第四节 粮食中纤维素含量的检测方法
一、纤维素检测方法概述
食品中的粗纤维在化学上不是单一组分的物质，而是包括纤维素、半纤维素、木质素等多种组分的混合物。粗纤维是植物性食品的主要成分之一，广泛存在于各种植物体内，其含量随食品种类的不同而异，尤其在谷类、豆类、水果、蔬菜中含量较高。由于其组成十分复杂，且随食品的来源、种类而变化。因此，不同的研究者对纤维的解释有所不同，其定义也不相同。目前，还没有明确的科学的定义。早在19世纪，德国的科学家首次提出了 “粗纤维”的概念，用来表示食品中不能被稀酸、稀碱所溶解，不能为人体所消化利用的物质。到了近代，在研究和评价食品消化率和品质时，从营养学的观点，提出了膳食纤维的概念。它是指人体消化系统或者消化系统中的酶不能消化、分解、吸收的物质，包括粗纤维和半纤维分析方法所测得的那些化合物，如纤维素、半纤维素、戊聚糖、木质素、果胶、树胶等。膳食纤维比粗纤维更能客观、准确地反映食物的可利用率，因此有逐渐取代粗纤维的趋势。
食品中粗纤维的测定提出最早、应用最广泛的是称量法，此外还有纤维素测定仪法及不溶性膳食纤维等的测定。
二、粮食粗纤维素含量的检测
1.原理
在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶等物质经水解而除去，再用热的氢氧化钾溶液处理，使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去。然后用乙醇和乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪，所得的残渣即为粗纤维素，如其中含有无机物质，可经灰化后除去。
2.适用范围及特点
该法选自GB/T 5515—2008，其操作简便、迅速，适用于各类食品。该法由Heln-neberg等人于1860年提出后，一直沿用至今，是应用最广泛的经典分析法，也是测定纤维素的国家标准分析方法。目前，我国的食品成分表中 “纤维素” 项的数据都是用此法测定的，但该法测定结果粗糙，重现性差。由于酸碱处理时纤维素成分会发生不同程度的降解，使测得值与纤维的实际含量差别很大，这是此法的最大缺点。
3.试剂
（1）硫酸工作液（ρ为1.25%）将280mL浓硫酸加入水中，并稀释至5L，此为质量浓度为10%的硫酸贮备液，然后将62.5mL硫酸贮备液加水稀释至500mL。
（2）氢化钾工作液（ρ为1.25%）溶解500g氢氧化钾于水中，并稀释至5L，此为质量浓度为10%的氢氧化钾贮备液，然后将62.5mL氢氧化钾贮备液加水稀释至500mL。
（3）硅油消泡剂（ρ为2%）以四氯化碳作溶剂。
（4）乙醇（ρ为95%）。
（5）乙醚。
4.主要仪器
实验室常用仪器，特别是下列仪器。
（1）粉碎设备，能将样品粉碎，使其能全部通过筛孔孔径为1mm的筛。
（2）分析天平 感量0.1mg。
（3）滤埚 石英、陶瓷或者硬质玻璃材质，带有烧结的滤板，孔径40～100μm。在初次使用前，将新滤埚小心地逐步加温，温度不超过525℃，并在500±25℃下保持数分钟。也可以使用具有同样性能特性的不锈钢坩埚，其不锈钢滤板的孔径为90μm。
（4）陶瓷筛板。
（5）灰化皿。
（6）烧杯或锥形瓶 容量500mL，带有配套的冷却装置。
（7）干燥箱 电加热，可通风，能保持温度在（130±2）℃。
（8）干燥器 盛有蓝色硅胶干燥剂，内有厚度为2～3mm的多孔板，最好为铝制或不锈钢材质。
（9）马福炉 电加热，可通风，温度可以调控，在475～525℃条件下能够保持滤埚周围强度准确至25℃。
马福炉的温度读数可能发生误差，因此对马福炉中的强度要定期校正。因马福炉的大小及类型不同，炉内不同位置的温度可能不同，当炉门关闭时，必须有充足的空气供应。空气体积流速不宜过大，以免带走滤埚中的物质。
（10）冷提取装置 需带有滤埚支架，以及连接真空。液体排出孔的有旋塞排放管和连接滤埚的连接环等部件。
（11）加热装置（适用于手工操作方法）带有冷却装置，以保证溶液沸腾时体积不发生变化。
（12）加热装置（适用于半自动操作方法）用于酸碱消解。包括：滤埚支架，连接真空和液体排出孔的有旋塞排放管，容积至少270mL的消解圆筒，供消解用，并带有回流冷凝器，连接加热装置、滤埚和消解圆筒的连接环。压缩空气可以选配，使用前装置用沸水预热5min。
5.手工操作步骤
（1）试料 称取1g制备好的试样，准确至0.1mg（m1）。如果试样脂肪含量超过100g/kg，或试样中的脂肪不能用石油醚提取，则将试样转移至滤埚中，按5（2）处理；如果试样脂肪含量不超过100g/kg，则将试样转移至烧杯中。如果其碳酸盐（以碳酸钙计）超过50g/kg，按5（3）处理，如果其碳酸盐（以碳酸钙计）不超过50g/kg，直接按5（4）进行操作。
（2）预脱脂 在冷提取装置中，真空条件下，试样用30mL石油醚脱脂后，抽吸干燥残渣，重复3次，将残渣转移至烧杯中。
（3）除去碳酸盐 样品中加入100mL盐酸，连续振摇5min，小心地将溶液倒入铺有过滤辅料的滤埚中，小心地用水洗涤两次，每次100mL，充分洗涤使尽可能少的物质留在过滤辅料上。把滤埚中的物质转移至原来的烧杯里，进行酸消解。
（4）酸消解 向样品中加入150mL硫酸。尽快加热至沸腾，并且保持沸腾状态（30±1）min。开始沸腾时，缓慢转动烧杯。如果起泡，加入数滴消泡剂。开启冷却装置保持溶液体积不发生变化。
（5）第一次过滤 在滤埚中铺一层过滤辅料，其厚度约为滤埚高度的1/5，过滤辅料上可盖筛板以防溅起。当酸消解结束时，把液体通过搅拌棒倾入滤埚中，用弱真空抽滤，使150mL消解液几乎全部通过。若发生堵塞而无法抽滤时，用搅拌棒小心地拨开覆盖在过滤辅料上的粗纤维。残渣用热水洗涤5次，每次用水约10mL。注意使滤埚的筛板始终有过滤辅料覆盖，使粗纤维不接触筛板。停止抽气，加入一定体积的丙酮，使其刚好能覆盖残渣。静置数分钟后，慢慢抽滤除去丙酮，继续抽气，使空气通过残渣，使其干燥。如果试样中的脂肪不能直接用石油醚提取，按照5（6）操作，反之按照5（7）操作。
（6）脱脂 在冷凝装置中，真空条件下，试样用30mL石油醚脱脂并抽吸干燥，重复3次。
（7）碱消解 将残渣定量转移至酸消解用的同一烧杯中。加入150mL氢氧化钾溶液，尽快加热至沸腾，并且保持沸腾状态30±1min。开启冷却装置保持溶液体积不发生变化。
（8）第二次过滤 在滤埚中铺一层过滤辅料，其厚度约为滤埚高度的1/5，过滤辅料上可盖一筛板以防溅起。将烧杯中的物质过滤到滤埚中，残渣用热水洗涤至中性。残渣在负压条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30mL，洗涤后继续抽气以干燥残渣。
（9）干燥 将滤埚置于灰化皿中，在130℃干燥箱中至少干燥2h。在加热或冷却的过程中，滤埚的烧结滤板可能会部分松散，从而导致分析结果错误，因此应将滤埚置于灰化皿中。滤埚和灰化皿在干燥器中冷却，从干燥器中取出后，立即对滤埚和灰化皿进行称量（m2），称量准确至0.1mg。
（10）灰化 把滤埚和灰化皿放到马福炉中，在500±25℃下灰化。每次灰化后，让滤埚和灰化皿在马福炉中初步冷却，待温热时取出，置于干燥管中，使其完全冷却，再进行称量，直至冷却后两次的称量差值不超过2mg。最后一次称量结果记为m3，称量准确至0.1mg。
（11）空白测定 用大约相同数量的滤器辅料按5（4）～5（10）进行空白测定，但不加试样。灰化引起的质量损失不应超过2mg。
6.半自动操作步骤
（1）试料 称取1g制备的试样，准确至0.1mg（m1），转移至带有约2g过滤辅料的滤埚中。如果试样脂肪含量超过100g/kg，或者试样中的脂肪不能用石油醚提取，则按6（2）处理。如果试样脂肪含量不超过100g/kg，其碳酸盐（以碳酸钙计）超过50g/kg，按6（3）处理，反之按6（4）处理。
（2）预脱脂 将滤埚和冷提取装置连接，在真空条件下试样用30mL石油醚脱脂后，抽吸干燥残渣，重复3次。如果其碳酸盐（以碳酸钙计）含量超过50g/kg，按6（3）处理，反之按6（4）处理。
（3）除去碳酸盐 将滤埚和加热装置连接，加入30mL盐酸，放置1min。洗涤过滤样品，重复3次。用约30mL的水洗涤一次，然后按6（4）操作。
（4）酸消解 将消解圆筒和滤埚连接，将150mL沸腾的硫酸加入带有滤埚的圆筒中，如果起泡，加入数滴消泡剂，尽快加热至沸腾，并保持剧烈沸腾30±1min。
（5）第一次过滤 停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下，通过滤埚将硫酸滤出，残渣每次用30mL热水洗涤至少3次，洗涤至中性，每次洗涤后继续抽气以干燥残渣。如果过滤器堵塞，可小心吹气以排除堵塞。如果试样中的脂肪不能直接用石油醚提取，按照6（6）操作，反之按照6（7）操作。
（6）脱脂 连接滤埚和冷却装置，残渣在真空条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30mL。然后残渣在真空条件下用石油醚洗涤3次，每次用30mL石油醚。每次洗涤后继续抽气以干燥残渣。
（7）碱消解 关闭排出孔旋塞，将150mL沸腾的氧氧化钾溶液转移至带有滤埚的圆筒中，尽快加热至沸腾，并保持剧烈沸腾30±1min。
（8）第二次过滤 停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下通过滤埚将氢氧化钾溶液滤去，每次用30mL热水至少清洗残渣3次，直至中性，每次洗涤后都要继续抽气以干燥残渣。如果过滤器堵塞，可小心吹气以排除堵塞。将滤埚连接到冷提取装置上，残渣在真空条件下每次用30mL丙酮洗涤残渣3次，每次洗涤后都要继续抽气以干燥残渣。
（9）干燥 将滤埚置于灰化皿中，在130℃干燥箱中至少干燥2h。在灰化皿冷却的过程中，滤埚的烧结滤板可能会部分松动，从而导致分析结果错误，因此应将滤埚置于灰化皿中，滤埚和灰化皿在干燥器中冷却，从干燥器中取出后，立即对滤埚和灰化皿进行称量（m2），称量准确至0.1mg。
（10）灰化 把滤埚和灰化皿放到马福炉中，在（500±25）℃下灰化。每次灰化后，让滤埚和灰化皿在马福炉中初步冷却，待温热后取出置于干燥器中，使其完全冷却，再进行称量，直到冷却后两次的称量差值不超过2mg。最后一次称量结果记为m3，称量准确至0.1mg。
（11）空白测定 用大约相同数量的过滤辅料按6（4）～6（10）进行空白测定，但不加试样。灰化引起的质量损失不应超过2mg。
7.结果计算
粗纤维素含量按式（1-16）计算。
式中 m1——试样质量，g；
m2——灰化皿、滤埚以及在130℃干燥后获得的残渣质量，mg；
m3——灰化皿、滤埚以及在500±25℃干燥后获得的残渣质量，mg。
8.说明及注意事项
（1）纤维素的测定方法之间不能相互对照，对于同一样品，分析结果因测定方法、操作条件的不同差别很大。因此，必须严格控制实验条件，表明分析结果时还应注明测定方法。
（2）酸碱处理法是测定纤维含量的标准方法，但由于在操作过程中，纤维素、木质素、半纤维素都发生了不同程度的降解和流失，残留物中除纤维素、木质素外，还含有少量蛋白质、半纤维素、戊聚糖和无机物质，因此称为 “粗纤维”。
（3）酸碱处理法操作较繁杂，测定条件不易控制，影响分析结果的主要因素如下。
①样品细度：样品越细，分析结果误差越低，通常样品细度控制在1mm左右。
②回流温度及时间：回流时沸腾不能过于猛烈，样品不能脱离液体，且应注意随时补充试剂，以维持体积的恒定，沸腾时间为30min。
③过滤操作：对于蛋白质含量较高的样品不能用滤布作为过滤介质，因为滤布不能保证留下全部细小的颗粒，这时可采用滤纸过滤。此外，若样品不能在10min内过滤出来，则应适当减少样品。
三、粮食膳食纤维含量的检测
鉴于粗纤维测定方法的诸多缺点，近几十年来各国学者对膳食纤维的测定方法进行了广泛的研究，提出了不溶性膳食纤维概念，试图用来代替粗纤维指标。不溶性膳食纤维是指来源于各类植物性食物中不溶于水的半纤维素、纤维素和木素。目前酸性洗涤剂纤维素（ADF）和中性洗涤剂纤维素（NDF）已被有些国家列为营养成分的正式指标之一。
（一）酸性洗涤剂纤维素含量的检测
1.原理
将磨碎、烘干的样品在十六烷基三甲基溴化铵的硫酸溶液中回流煮沸2h，经过滤、洗涤、烘干后所得的残留物称为酸性洗涤剂纤维。
2.适用范围及特点
本法是美国谷物化学家协会（AACC）审批的方法，也是我国国标GB/T 9822—2008、GB/T 12394—1990的方法，适用于谷物及其制品、饲料、果蔬等样品，对于蛋白质、淀粉含量高的样品，由于易形成大量泡沫、黏度大、过滤困难，使此法应用受到限制。本法设备简单、操作容易、准确度高、重现性好。所测结果包括样品中全部的纤维素、木质素，接近于食品中膳食纤维的真实含量。
3.试剂
（1）酸性洗涤剂溶液 加56mL浓硫酸于水中并稀释至2000mL，用此溶液溶解20g十六烷基三甲基溴化铵，冷却至室温。
（2）萘烷消泡剂。
（3）丙酮。
4.主要仪器
同粗纤维测定方法。
5.操作方法
将样品全部磨碎并通过16目筛，放在95℃鼓风干燥箱中，干燥过夜后移入干燥器中冷却。准确称取此样品1g，放入500mL锥形瓶中，加入100mL酸性洗涤剂溶液、2mL萘烷消泡剂，连接好回流装置。加热，使之在3～5min内沸腾，维持微沸2h。
取下，用预先烘干至恒重的玻璃砂芯坩埚过滤（以重力过滤，不要抽滤）。用热水洗涤锥形瓶，洗液倒入坩埚中，在轻轻抽滤下用热水充分洗涤坩埚内容物（热水的总用量约为300mL）。
用丙酮洗涤残留物并抽干，将坩埚与残留物置于95℃烘箱中干燥8h以上，移至干燥器中冷却至室温后称重。
6.结果计算
酸性洗涤纤维素含量按式（1-17）计算。
式中 m1——残余物的质量（或经高温灼烧后损失的质量），g：
m2——样品质量，g。
7.说明及注意事项
（1）洗涤坩埚内残渣的方法 坩埚内倒入90～100℃的热水，水量约占坩埚体积的2/3，用玻璃棒搅碎残渣，浸泡15～30 s后，开始轻轻抽滤。
（2）经过酸性洗涤剂的浸煮，样品中的蛋白质、果胶物质、淀粉和半纤维素等成分分解，经过滤除去，残留物中包括全部的纤维素和木质素及少量矿物质，测定结果高于酸碱处理法。
（3）测定结果中包含灰分，可灰化后去除。
（二）中性洗涤剂纤维素含量的检测
1.原理
样品经热的中性洗涤剂慢煮后，残渣用热蒸馏水充分洗涤，除去样品中游离淀粉、蛋白质、矿物质，然后加入α-淀粉酶以分解结合态淀粉，再用蒸馏水洗涤，以除去残存的脂肪、色素等物质，残渣经烘干，即为中性洗涤剂纤维素（不溶性膳食纤维）。
2.适用范围及特点
适用于谷物及其制品、饲料、果蔬等样品，对于蛋白质、淀粉含量高的样品，所测结果包括样品中全部的纤维素、半纤维素、木质素，最接近于食品中膳食纤维的真实含量。
3.试剂
（1）中性洗涤剂溶液
①将18.61g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）和6.81g四硼酸钠用250mL水加热溶解；
②另将30g月桂基硫酸钠（十二烷基硫酸钠）和10mL乙二醇乙醚溶于200mL热水中，合并于①液中；
③把4.56g磷酸氢二钠溶于150mL热水中，放入①液中；
④用磷酸调节混合液至pH6.9～7.1，最后加水至1000mL。此溶液使用期间如有沉淀产生，需在使用前加热至60℃，使沉淀溶解。
（2）α-淀粉酶溶液 取磷酸氢二钠溶液 [ c（Na2 HPO4）=0.1mol/L] 和磷酸二氢钠溶液 [c（NaH2PO4）=0.1mol/L] 各500mL，混匀，配成磷酸盐缓冲液。称取12.5mgα-淀粉酶，用上述缓冲溶液溶解并稀释至250mL。
（3）萘烷消泡剂。
（4）丙酮。
（5）无水亚硫酸钠。
4.主要仪器
同粗纤维测定方法。
5.测定
（1）将样品磨细使之通过20～40目筛，准确称取0.5～1g样品置于300mL锥形瓶中。如果样品脂肪含量超过10%，按每克样品用20mL石油醚的比例加入石油醚提取3次。
（2）依次向锥形瓶中加入100mL中性洗涤剂，2mL萘烷消泡剂和0.05g无水亚硫酸钠，装上冷凝管，加热锥形瓶使之在5～20min内沸腾。从微沸开始计时，准确微沸1h。
（3）把洁净的玻璃过滤器置于110℃烘箱中干燥4h，放入干燥器内冷却至室温后称量。将锥形瓶内容物全部转入过滤器中，抽滤至干，用不少于300mL的沸水分3～5次洗涤残渣。
（4）加入5mLα-淀粉酶溶液，抽滤，以置换残渣中水，然后塞住玻璃滤器的底部，加20mL淀粉酶液和几滴甲苯（防腐），置过滤器于（37±2）℃培养箱中保温1h。取出过滤器，取下底部的塞子，抽滤，并用不少于500mL的热水分次洗去酶液，最后用25mL丙酮洗涤、抽干。
（5）过滤器置于110℃烘箱中干燥过滤，移入干燥器中冷却至室温后称量。
6.结果计算
中性洗涤纤维素含量按式（1-18）计算。
式中 m0——玻璃过滤器的质量，g；
m1——玻璃过滤器和残渣质量，g；
m——样品质量，g。
7.说明及注意事项
（1）中性洗涤纤维包括了样品中的全部纤维素、半纤维素、木质素和角质，因为这些成分是膳食纤维中不溶于水的部分，故又称为 “不溶性膳食纤维”。由于食品中可溶性膳食纤维（果胶、藻胶及某些黏性物质等）含量较少，因此中性洗涤纤维更接近于食品中膳食纤维的真实含量。
（2）样品粒度对测定结果影响较大，颗粒过粗结果偏离，过细又会造成过滤困难。一般采用20～30目较为适宜，过滤困难时可加入助滤剂。
（3）对于蛋白质、淀粉含量较高的样品，由于形成大量泡沫、黏度大、过滤困难，因此不宜用此法测定。
（4）中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维之差即为半纤维素含量。