第三节 粮油中淀粉的检测方法

一、淀粉检测方法概述

淀粉是人类食物的重要组成部分，也是供给人体热能的主要来源。按聚合形式不同，淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉。一般淀粉均同时含有直链淀粉和支链淀粉，只是不同来源的淀粉，所含这两种淀粉的比例不同。例如，玉米含直链淀粉约为27%，马铃薯约为23%，甘薯约为20%，其余部分为支链淀粉。糯玉米、糯大米和糯高粱几乎全部是支链淀粉。由于直链淀粉和支链淀粉的结构不同，性质上也有一定差异。如直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水，支链淀粉常压下不溶于水，只有在加热并加压时才能溶解于水。直链淀粉可与碘生成深蓝色络合物；而支链淀粉与碘不能形成稳定的络合物，呈现较浅的蓝紫色。

直链淀粉和支链淀粉都以颗粒状存在于胚乳细胞中，具有晶体结构，常称为淀粉粒。不同来源的淀粉，其淀粉粒的形状和大小各不相同，用显微镜观察可鉴别淀粉的种类，淀粉不溶于浓度在30%以上的乙醇溶液，在酸或酶的作用下可以水解，最终产物是葡萄糖，淀粉水溶液具有右旋性。淀粉的许多测定方法都是根据淀粉的这些理化性质而建立的。常用的方法有：根据淀粉在酸或酶作用下能水解为葡萄糖，通过测定还原糖进行定量的酸水解法和酶水解法；根据淀粉具有旋光性而建立的旋光法；根据淀粉不溶于乙醇的性质而建立的重量法等。

二、粮油种子粗淀粉含量的检测

（一）酶水解法

1.原理

样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，其中的淀粉用淀粉酶水解为双糖，再用盐酸将双糖水解成单糖，接着按还原糖测定方法测定水解所得的葡萄糖含量，最后把葡萄糖含量折算为淀粉含量（换算系数为162/180=0.9）。

水解反应如下：

2.适用范围及特点

由于淀粉酶水解样品，具有专一性和选择性，只水解淀粉而不会水解半纤维素、多缩戊糖、果胶质等多糖，所以该法不受这些多糖的干扰，水解后可直接通过过滤除去这类多糖。适合于富含纤维素、半纤维素和多缩戊糖等多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，重现性好。但是酶催化活力的稳定性受pH和温度的影响很大，而且操作烦琐、费时，使用受到了一定程度的限制。本法参照了GB/T 5514—2008中的方法。

3.试剂

（1）淀粉酶溶液（5g/L）称取α-淀粉酶0.5g，加100mL水溶解，加入数滴甲苯或氯仿防止生霉，贮于冰箱中。

（2）碘溶液 称取3.6g碘化钾溶于20mL水中，再加入1.3g碘，溶解后加水稀释至100mL。

（3）乙醚。

（4）85%乙醇。

（5）6mol/L HCl溶液。

（6）200g/L NaOH溶液。

（7）甲基红指示液 称取0.1g甲基红用84%乙醇溶液定容至100mL。

4.主要仪器

（1）恒温水浴锅。

（2）高速组织捣碎机 1200r/min。

（3）回流冷凝装置，配250mL锥形瓶。

（4）容量瓶 250mL。

（5）抽滤装置 由砂芯漏斗和吸滤瓶组成，用水泵或真空砂抽滤。

5.操作方法

（1）样品处理 准确称取干燥样品2～5g，置于放有折叠滤纸的漏斗中，先用50mL乙醚分5次洗去脂肪，再用85%乙醇约100mL分3～4次洗去可溶性糖类。将残留物移入250mL烧杯内，用50mL水分数次洗涤滤纸和漏斗，洗液并入烧杯中。

将烧杯置沸水浴上加热15min，使淀粉糊化。放冷至60℃，加α-淀粉酶溶液20mL，在恒温水浴锅中55～60℃下保温1h，并经常搅拌。

取1滴酶解液加1滴碘溶液检查应不显蓝色。若呈蓝色，再加热糊化并加α-淀粉酶溶液20mL，继续保温，直至加碘不显蓝色为止。

将酶解完全的试样加热至沸，冷却后倒入250mL容量瓶中，加水定容至刻度。摇匀、过滤（弃去初滤液）。

取50mL滤液，置于250mL锥形瓶中，加盐酸5mL，装上回流冷凝管，在沸水浴中回流1h。冷却后加2滴甲基红指示剂，用NaOH溶液中和至近中性后转入100mL容量瓶中。洗涤锥形瓶，洗液并入100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀备用。

（2）测定 按还原糖测定方法进行定量。同时量取50mL水及与样品处理时等量的α-淀粉酶溶液，按同一方法做试剂空白试验。

6.结果计算

淀粉含量按式（1-12）计算。

式中 m₁——样品水解液中还原糖的质量，mg：

m₂——空白液中还原糖的质量，mg；

m——样品质量，g；

V——样品水解液的体积，mL；

500——样品水解液总体积，mL；

0.9——还原糖换算为淀粉的系数。

7.说明及注意事项

（1）脂肪的存在会妨碍酶对淀粉的作用及可溶性糖类的去除，故应用乙醚脱脂。若样品引脂肪含量较少，可省略此步骤。

（2）淀粉粒具有晶格结构，淀粉酶难以作用。加热糊化破坏了淀粉的晶格结构，使其易于被淀粉酶作用。

（3）淀粉酶解过程中，黏度迅速下降，流动性增强。淀粉在淀粉酶中水解的顺序为：淀粉—蓝糊精—红糊精—麦芽糖—葡萄糖。与碘液呈色依次为：蓝色、蓝色、红色、无色、无色。因此，可用碘液检验酶解终点。酶解终点为酶解液与碘液的反应不呈蓝色。若呈蓝色，再加热糊化，冷却至60℃以下，再加淀粉酶溶液，继续保温，直至酶解液加碘液后不呈蓝色为止。

（4）使用淀粉酶前，应确定其活力及水解时加入量。可用已知浓度的淀粉溶液少许，加入一定量淀粉酶溶液，置55～60℃水浴中保温1h，用碘液检验淀粉是否水解完全，以确定酶的活力及水解时酶的用量。

（二）酸水解法

1.原理

样品经除去脂肪和可溶性糖类后，淀粉用酸水解成具有还性的单糖，然后按还原糖测定法测定其还原糖含量，并折算成淀粉含量。

2.适用范围及特点

此法可一步将淀粉水解至葡萄糖，简便易行，适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时它们也被水解为木糖、阿拉伯糖等还原糖，使测定结果偏高。该法应用广泛，但选择性和准确性不及酶水解法。操作方法可参阅GB/T 5009.9—2008。

3.试剂

（1）乙醚。

（2）85%乙醇。

（3）HCl溶液（1+1）量取50mL盐酸，与50mL水混合。

（4）NaOH溶液 配制的质量浓度分别为10%和40%。

（5）甲基红指示剂（2g/L）。

（6）Pb（Ac）₂溶液（200g/L）。

（7）Na₂ SO₄溶液（100g/L）。

（8）石油醚 沸点范围为60～90℃。

（9）精密pH试纸 6.8～7.2。

4.仪器

（1）水浴锅。

（2）高速组织捣碎机 1200r/min。

（3）回流装置 附250mL锥形瓶。

5.操作步骤

（1）样品处理

①粮食、豆类等较干燥的样品：准确称取2～5g磨碎，过40目筛的样品，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用50mL石油醚或乙醚分5次洗去样品中的脂肪，弃去石油醚或乙醚。再用85%乙醇溶液约150mL分数次洗涤残渣，除去可溶性糖类。滤干乙醇溶液后用100mL水洗涤漏斗中残渣并转入250mL锥形瓶中，加入HCl溶液（1+1）30mL，连接好冷凝管，置沸水浴中回流2h。

回流完毕后，立即置流动水中冷却至室温，加入2滴甲基红指示剂，先以40%的NaOH溶液调至黄色，再以盐酸（1+1）校正至水解液刚变红色。若水解液颜色较深或用精密pH试纸测试，使试样水解液的pH约为7。加中性Pb（Ac）₂溶液（200g/L）20mL摇匀，放置10min，使蛋白质等干扰物质沉淀完全，再加等量的Na₂SO₄溶液（100g/L），以除去多余的铅。摇匀后将全部溶液及残渣转入500mL容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中。用水定容至刻度，混匀、过滤（初滤液弃去20mL），滤液供测定用。

②各种粮豆含水熟食制品：将干净样品，按体积1∶1加水，在组织捣碎机中捣成匀浆。称取匀浆5.00～10.00g（液体样品：直接量取），置于250mL锥形瓶中，加30mL乙醚振摇提取脂肪，用滤纸过滤除去乙醚，再用20mL乙醚淋洗两次，弃去乙醚。以下按①中自 “再用85%乙醇溶液约150mL” 起操作。

（2）测定 按还原糖的测定方法操作。

6.结果计算

同酶水解法。

7.说明及注意事项

（1）本法要求对粮食、豆类和代乳粉等较干燥、易磨细的样品磨碎、过40目筛，再称取此处理后的样品进行分析。

（2）样品含可溶性糖类时，会使结果偏高，可用85%（体积分数）乙醇分数次洗涤样品以除去。脂肪会妨碍乙醇溶液对可溶性糖类的提取，所以要用乙醚分数次洗去样品中的脂肪。脂肪含量较低时，可省去乙醚脱脂肪步骤。

（3）样品加入乙醇溶液后，混合液中乙醇的浓度应在80%以上，以防止糊精随可溶性糖类一起被洗掉。如要求测定结果不包括糊精，则用10%乙醇洗涤。

（4）水解条件要严格控制，要保证淀粉水解完全，并避免因加热时间过长对葡萄糖产生影响（形成糠醛聚合体，失去还原性）。

（5）样品水解液冷却后，应立即调至中性。可加入两滴甲基红，先用40%氢氧化钠调至黄色，再用盐酸调到刚好变为红色，最后用10%氢氧化钠调到红色刚好褪去。若水解液颜色较深，可用精密pH试纸测试，使样品水解液的pH约为7。

（6）用中性乙酸铅溶液沉淀蛋白质、果胶等杂质，以澄清样品水解液，再加入硫酸钠溶液除去过多的铅。

（三）称量法

1.原理

把样品与氢氧化钾酒精溶液共热，使蛋白质、脂肪等溶解，而淀粉和粗纤维不溶解。过滤后，用氢氧化钾水溶液溶解淀粉，使之与粗纤维分离。然后用乙酸酸化的乙醇使淀粉重新沉淀，过滤后把沉淀于100℃烘干至恒重，再于550℃灼烧至恒重，灼烧前后质量之差即为淀粉的含量。按式（1-13）计算：

式中 m₁——坩埚和内容物干燥后的质量，g；

m₂——坩埚和内容物灼烧后的质量，g；

m——样品质量，g；

V——测定时取样液体积，mL；

100——样液总体积，mL。

2.适用范围及特点

本法是北欧食品分析委员会的标准方法，结果准确、重现性好，但操作繁琐、时间较长。

3.说明及注意事项

（1）氢氧化钾酒精溶液是将50gKOH溶于1000mL95%乙醇溶液中；乙酸酸化的乙醇溶液是指1000mL90%乙醇溶液中加了5mL冰乙酸。

（2）实验过程中有两次过滤，第一次是从样品溶液中分离提取出淀粉和粗纤维，用氢氧化钾酒精溶液洗涤沉淀，采用滤纸过滤；第二次是以乙酸酸化的乙醇溶液洗涤沉淀淀粉，采用古氏坩埚过滤。过滤过程中易造成损失，需细心操作，确保实验结果准确。

（3）测定肉制品中淀粉也可以采用容量法。即把样品与氢氧化钾共热，使样品完全溶解再加入乙醇使淀粉析出，经乙醇洗涤后加酸水解为葡萄糖，然后按测定还原糖的方法测定葡萄糖含量，再换算为淀粉含量。此方法没有把淀粉与其他多糖分离开，如果在水解条件下，这些多糖也能水解为还原糖，将产生正误差。

三、破损淀粉含量的检测

1.原理

破损淀粉对α-淀粉酶的敏感性大大高于未破损淀粉，在常温下能被α-淀粉酶降解生成糊精和一定量的还原糖。利用此特性，在规定的条件下，用α-淀粉酶降解小麦粉中破损淀粉，再用铁氰化钾法测定其还原糖量，并根据法兰德的经验公式计算小麦粉中的破损淀粉值。

2.适用范围及特点

本方法适用于小麦粉破损淀粉值的测定。介绍了用α-淀粉酶测定小麦粉破损淀粉值的原理，使用的试剂、仪器、分析的步骤以及结果计算。本方法参照了国家标准GB/T 9826—2008。

3.试剂

（1）乙酸缓冲溶液 溶解4.1g无水乙酸钠于水中，加入3mL冰乙酸，再用水定容至1000mL，pH应为4.7±0.1。

（2）乙醇 体积分数为95%。

（3）α-淀粉酶液 称取活力大于10U/mg的α-淀粉酶制剂溶于500mL提取液中，再加入500mL缓冲液，此溶液现用现配。

（4）硫酸溶液 将100mL浓硫酸加入到约700mL水中，用水定容至1000mL，溶液的浓度为3.68±0.05mol/L。

（5）钨酸钠溶液 称取12.0g钨酸钠溶于水中，并定容至100mL。

（6）0.1mol/L碱性铁氰化钾溶液 称取32.9g干燥纯净的铁氰化钾与44.0g无水碳酸钠溶于1000mL水中，置于棕色瓶避光保存。

铁氰化钾溶液标定：准确量取10.0mL的铁氰化钾溶液，并加入25mL乙酸盐溶液和1mL淀粉- 碘化钾溶液。用0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液蓝色完全消失。0.1mol/L硫代硫酸钠溶液的消耗量为10.0mL。

（7）乙酸盐溶液 称取70g氯化钾和40g硫酸锌于水中完全溶解后，并缓慢加入200mL冰乙酸，再用水定容至1000mL。

（8）可溶性淀粉-碘化钾溶液 用少量冷水调和2g的可溶性淀粉，然后慢慢加入沸腾的水中（小于50mL）。溶液冷却后，加入50g碘化钾，用蒸馏水定容至100mL，并加入1滴饱和的氢氧化钠溶液。

（9）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 称取24.82g硫代硫酸钠（含5个结晶水）和3.8g四硼酸钠用水定容至1000mL，贮于棕色瓶避光保存，按GB/T 5490—1985的附录B进行标定。

4.主要仪器

（1）耐热玻璃试管 ϕ25mm×220mm。

（2）量筒 50mL、25mL。

（3）恒温水浴 可控温（30±0.1）℃。

（4）秒表。

（5）玻璃棒。

（6）移液管或移液器 1mL、5mL、10mL。

（7）玻璃漏斗及中速定量无灰滤纸。

（8）水浴锅 沸水浴。

（9）磨口带塞锥形瓶 100mL、150mL。

（10）滴定管 10mL（精度分别为0.02mL、0.1mL）。

（11）天平 感量0.01g、0.1mg。

（12）pH计或精密pH试纸 可测pH4.7±0.1。

（13）铁丝笼 放置试管。

5.操作步骤

（1）酶解 将乙酸缓冲液置于30℃水浴中。称取1.00g（14%湿基）面粉样品置于150mL锥形瓶中。称取0.050g酶，加入到锥形瓶中，再加入45mL乙酸缓冲液，用玻璃棒搅匀。从加入溶液起，在30℃恒温水浴中准确保温15min。保温后，加入3.0mL硫酸溶液和2.0mL钨酸钠溶液。充分混合，静置2min，然后经滤纸过滤，弃去最初8～10滴滤液。立即吸取5.0mL滤液于试管中，测定还原糖的含量。

（2）还原糖测定

①样品提取：称取5.675g的小麦粉至100mL的锥形瓶（三角瓶）中，振荡锥形瓶使样品处于同一侧，用5mL的乙醇湿润面粉，振荡锥形瓶使湿润面粉位于上方，然后加入50mL的乙酸盐缓冲液，直到将缓冲液全部加入后再让缓冲液与面粉接触，振荡锥形瓶，将湿润面粉变成悬浊液，立即加入2mL的钨酸钠溶液并再一次彻底混匀。

②氧化：吸取5mL样品滤液至试管中，向试管中准确加入10mL的铁氰化钾滤液，混合均匀，然后将试管浸入剧烈沸腾的水浴锅中，试管中的液面应低于沸水液面3～4 cm。试管在沸水锅中准确煮沸20min。

③滴定：取出试管立即用流水冷却，冷却后将试管中溶液倒入容积为100mL的锥形瓶中，并用25mL乙酸盐溶液洗涤试管，并将洗涤液也加入锥形瓶。混匀后加入1mL的淀粉-碘化钾溶液，并彻底混匀。然后用0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液蓝色完全消失，并记录下消耗的硫代硫酸钠溶液体积（V₁）。同时做空白实验，吸取空白液5mL代替样品液，按照上述步骤操作，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积（V₀）。

（3）换算 样品中消耗硫代硫酸钠溶液体积（V₁）减去空白实验消耗的硫代硫酸钠溶液体积（V₀）就是还原糖氧化0.1mol/L铁氰化钾消耗的体积（V），再根据此体积查表1-2，即可查得消耗的铁氰化钾溶液体积换算成的麦芽糖的质量（mg）。

6.结果计算

破损淀粉值按式（1-14）计算。

式中 m——由表1-2得到的10g淀粉中麦芽糖质量，mg；

5——样品稀释倍数；

1.64——61%的淀粉转化为麦芽糖，所以乘以0.61的倒数1.64。

7.说明及注意事项

（1）在进行还原糖测定时，样品提取物的过滤处理与沸水浴处理的时间间隔不要超过15～20min。进一步延迟可能引起蔗糖在溶液中的分解而导致测定错误。

（2）在每天测定样品时，应做相应的空白试验以测定铁氰化钾试剂的变化，并校正试剂中还原性杂质。

四、抗消化淀粉含量的检测

目前，国内外学者根据抗消化淀粉的形态和物理化学性质，将其分为四种类型：即RS1型、RS2型、RS3型和RS4型。RS1称为物理包埋淀粉，是指淀粉颗粒因细胞壁的屏障作用或蛋白质等的隔离作用而难以与酶接触，因此不易被消化。加工时的粉碎及碾磨，摄食时的咀嚼等物理动作可改变其含量。常见于轻度碾磨的谷类、豆类等食品中。RS2是指抗消化淀粉颗粒，是有一定粒度的淀粉，通常为生的薯类和香蕉。经物理和化学分析后认为，RS2具有特殊的构象或结晶结构（B型或C型衍射图谱）、对酶具有高度抗性。RS3为老化淀粉，主要为糊化淀粉经冷却后形成的。凝沉的淀粉聚合物，常见于煮熟又放冷的米饭、面包、油炸马铃薯片等食品中。这类抗消化淀粉又分为RS3 a和RS3 b两部分，其中RS3 a为凝沉的支链淀粉，RS3 b为凝沉的直接淀粉，RS3 b的抗酶性最强。RS4为化学改性淀粉，经基因改造或化学方法引起的分子结构变化以及一些化学官能团的引入而产生的抗酶解性，如乙酰基、羟丙基淀粉，热变性淀粉以及磷酸化淀粉等。

1.原理

样品先在37℃下经α-淀粉酶水解，使可消化淀粉转化成葡萄糖，用80%乙醇提取，未水解的抗性淀粉部分经沸水浴凝胶化后，淀粉葡萄糖苷酶转化成葡萄糖，用葡萄糖氧化酶法分别测定葡萄糖含量，再换算成抗性淀粉含量。

2.适用范围及特点

适用于所有含淀粉食物的测定。

3.试剂

除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。

（1）0.1mol/L乙酸缓冲液（pH5.0）称取14.28g乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O）溶于水中，加入2.7mL冰乙酸，并调节pH5.0，用水定容至1L。

（2）酶溶液：分别称取4gα-淀粉酶溶液（Sigma公司）、1g淀粉葡萄糖苷酶溶液（Sigma公司）和0.3g转换酶（Sigma公司）溶液于研钵中，用0.1mol/L乙酸缓冲液研磨制成匀浆，并调节体积为100mL，3000r/min离心5min，取上清液。

（3）淀粉葡萄糖苷酶溶液 称取2g淀粉葡萄糖苷酶（Sigma公司），加100mL0.1mol/L乙酸缓冲液研磨成匀浆。3000r/min离心5min，取上清液。

（4）80%乙醇 800mL乙醇加水至1L。

（5）4mol/L氢氧化钾溶液 称取224g氢氧化钾，用水溶解并加至1L。

（6）2mol/L乙酸溶液 量取冰乙酸118mL，加水至1L，混匀。

4.主要仪器

（1）恒温水浴箱。

（2）温箱。

（3）分光光度计。

5.操作步骤

（1）样品处理 测定RS1时，直接称取样品0.2～1g；测定RS2时，选用生的样品，先研磨打碎后再称取样品0.2～1g；测定RS3时，则先将样品加水煮沸至少15min，使之凝胶化，然后取出放入4℃冰箱冷藏过夜，再混匀后称取样品0.2～1g（需折合水分）。加入10mL酶溶液，轻轻混匀。37℃温箱或水浴中酶解16h。加入40mL无水乙醇，使乙醇含量终浓度为80%，充分摇匀。静置30min，3000r/min离心15min，上清液转移至100mL容量瓶中。用80%乙醇反复洗涤沉淀2～3次。合并上清液并用乙酸缓冲液定容，供测定可消化淀粉用。

（2）水解抗性淀粉 将经反复洗涤的沉淀置于100℃干燥，然后用15mL水将沉淀转移至锥形瓶中，沸水浴中加热30min，冷却至室温。加入1倍体积的4mol/L氢氧化钾溶液，使氢氧化钾终浓度为2mol/L，室温下混合30min。（注：在样品凝胶化后，2mol/L氢氧化钾的作用是进一步破坏淀粉结构，如果氢氧化钾的浓度过高或过低，不利于结构破坏，操作中需注意。）加入约30mL 2mol/L乙酸溶液，调节pH为5.0，再加入淀粉葡萄糖苷酶溶液5mL，65～70℃水浴90min。冷却后将水解液转移至100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液定容至刻度，然后过滤。

（3）测定 吸取0.5mL上清液和抗性淀粉水解液，按照葡萄糖氧化酶法分别测定葡萄糖含量（从测定步骤开始）。同时做葡萄糖标准曲线。

6.结果计算

根据葡萄糖标准曲线得出上清液中和抗性淀粉水解液中葡萄糖浓度，再根据稀释定容体积和称样量分别计算出可消化淀粉和抗性淀粉含量，按式（1-15）计算。

式中 X——样品中抗性淀粉含量，g/100g；

A_s——由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖的质量，mg；

A_b——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖的质量，mg；

V——样品定容体积，mL；

F——稀释倍数；

0.5——测定时吸取样品提取液的体积，mL；

m——样品质量，g；

0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。

7.说明及注意事项

（1）Eglyst根据抗性淀粉的分类，对样品处理采用不同的处理方法。读者可根据实验需要选择相应的方法。

（2）Eglyst测定抗性淀粉时，模拟胃肠道内环境，根据α-淀粉酶水解时间长短，将20min时已水解的淀粉称为快消化淀粉，20～120min水解的淀粉称为慢消化淀粉，120min后仍没有水解的淀粉称为抗性淀粉。有的学者指出在体内实验中，肠道对淀粉的消化能力可能超过6h，认为120min的水解时间过于短暂，并建议水解时间应延长至16h。目前国际上检测方法尚没有完全统一，多采用的是Eglyst和Champ的方法，这里的方法是对二者的综合并略加改进。

（3）如果将样品先用80%乙醇去除可溶性糖后，再加水煮沸，使之凝胶化，然后用氢氧化钾破坏淀粉结构，进而采用淀粉葡萄糖苷酶水解，所测定的结果即为总葡萄糖含量，结果乘以0.9即为总淀粉含量。