1.3　生长效率

微生物细胞的生长与繁殖是组成分子的紊乱状态或熵的大幅度降低的过程。由热力学第二定律可知，必然同时存在系统另一处的熵增加，其值至少等于分子形成细胞结构时熵的损失。在活体系统中熵的这种重新分布是通过把产生更高的熵的分子反应与低熵反应偶合进行的。那些产生更为复杂（低熵）结构的反应称为合成过程；而那些产生更为简单的（高熵）分子的反应，称为分解代谢过程。微生物的生长效率因而取决于合成与分解代谢反应的效率。但生长效率的精确定量比较困难。

1.3.1　得率系数

生长得率（yield coefficient）的概念是假定所利用的基质与生成的细胞之间的固定化学计量关系。这种关系只有在培养物生长在限制性基质上和在一定的条件下成立，即消耗单位基质所生成的细胞量为一常数。细胞得率又称为转化（效）率，是工业过程的重要指标。若原材料（碳源）的成本占产品的大部分，提高得率便显得更为重要（例如，用糖蜜生产面包酵母）。得率的提高会降低对氧的需求和减少热的形成，从而降低产品的成本。因大规模生产的供氧和冷却也占相当大的一部分成本。另一方面，有些过程需要维持生物量在适当的浓度，以获得最大的转化率（碳源转化为胞外产物，如乙醇或柠檬酸）。

最简单表示得率的方法是采用细胞生成量与基质消耗量的比值（g细胞/g基质消耗），此无量纲系数便称为得率系数Y。

表示生长得率的方法主要有：分子得率系数、碳转化效率、以电子平均数为基准的得率、基于热的产生的得率、以氧耗为基准的得率系数和基于ATP消耗的得率。

1.3.1.1　分子得率系数

分子得率系数（molar yield coefficient）表示每消耗1mol基质所生成的细胞数量，以Yglc表示以葡萄糖作为基质的细胞得率。以生成单细胞蛋白为例，用甲醇为基质Y=0.5（g/g），Yjch=0.5×32=16（g/mol）；用甲烷为基质Y=0.8（g/g），Yjw=0.8×16=12.8（g/mol）。故分子得率适用于比较不同基质的转化率。

1.3.1.2　碳转化效率

碳转化效率（carbon conversion efficiency）是指基质中的碳有多少转化为细胞的碳。碳转化率（cc）=Y×（DCW中的C含量/基质中的C含量）×100％。以葡萄糖和乙醇为例，假设这两种基质的细胞得率Y均为0.5，则Yglc=90和YEtOH=23。如用碳转化率表示，则葡萄糖的ccglc=0.5×45/40×100=56；而乙醇的ccEtOH=43。由此可见，用碳转化率表示实际上比用分子得率更确切。表1-9列举了以这两种方法表示的典型得率系数，都是最大值。

此法只适用于基质为唯一碳源的情况，对生长的能学情况提供的信息很少。

1.3.1.3　电子平均数为基准的得率

以电子平均数为基准的得率（yield per average electron）是把从不同基质分解代谢中得到的可利用的能量与生长效率关联起来。任何有机基质均可用其电子平均生成值（ave e-）来表征，即基质完全氧化为CO2与水所获得的电子平均数。如葡萄糖完全氧化需要6分子O2，将所需氧分子乘以4，得24可利用的电子，这样，葡萄糖的；乙醇的。因可利用的电子数值随基质的代谢途径而变，不能用来预测得率。

曾测定各种不同基质的，经216次测定，发现大致恒定，为3.14±0.11，见表1-10。

1.3.1.4　基于热的产生的得率

基于热的产生的得率Ykcal（yield based on heat production）是以单位释放出的热所生成的细胞量，Ykcal=产生的细胞量/释放的热。每摩尔电子产生的热的平均值为26.53kcal/mol有效电子。于是。这种表示方法尤其适用于厌氧系统中途径未知的分解代谢过程，因此时在恒温恒压条件下只有热的输出可用来预测生长期间的能量变化。现已有一种精确的流通式量热计，可用于测量热的变化。对一生长基质已知的简单系统，可直接把热的产生与消耗基质关联起来；对好氧菌，热的产生可与氧耗关联，提供更为直接和方便的测量生长效率的方法。

1.3.1.5　以氧耗为基准的得率

以氧耗为基准的得率系数（yield in terms of O2consumed）是指每0.5mol氧的消耗所产生的细胞量，氧消耗。因在好氧培养中氧化磷酸化提供的ATP是主要能量来源，故提供一种测量生长效率的最为方便的方法。但在分批培养中很难测得，需在连续培养中才能做到。

1.3.1.6　基于ATP消耗的得率

以上各种方法都有其局限性。若能把生长效率与菌的代谢关联，便可用基于ATP消耗的得率（yield based on ATPconsumed）YATP方便地表示任何生化反应的能量需求。可把ATP当作是活体细胞中的能量货币，它不能作为能量贮存，但它提供大多数生化合成反应所需的能。此外，NAD（P）H、ADP、其他磷酸化核苷酸、离子梯度等都能提供自由能。尽管如此，可把这些高能化合物折算成ATP当量。如NAD（P）H≈3ATP，FAD≈2ATP，K+逆梯度泵入≈1/2ATP。YATP=g细胞/mol ATP消耗。

在复合培养基中进行厌氧培养，提供全部必需氨基酸，以葡萄糖为能源，并假定只有氨基酸用作碳源，求得基于葡萄糖的细胞得率为21g/mol葡萄糖。若葡萄糖走EMP途径，每分子葡萄糖可得2ATP。故YATP=（21g细胞/mol葡萄糖）/（2ATP/mol葡萄糖）=10.5g细胞/ATP。同样，对粪链球菌的培养，以精氨酸作为能源，经分解代谢产生1ATP，其分子细胞得率为10.5g细胞/mol葡萄糖，这样YATP=10.5g细胞/mol ATP。

据此，有人提出YATP恒定的假说，即微生物消耗一定量的ATP，生成一定量的菌体。若此假说正确可靠，便可以求得在能量代谢期间产生的ATP数N：

N=Ysub/YATP=mol ATP（产生）/mol基质（分解代谢）　　（1-27）

测定细胞得率便得知葡萄糖代谢走哪一条主要途径。以粪链球菌为例，其Yg=20，因YATP=10.5，所以N=20/10.5≈2，说明其葡萄糖代谢走EMP途径。一种林氏假单胞菌（P.lindneri）的Yg=8.3，N=8.3/10.5≈0.8，即<1分子ATP，因此，很可能走ED途径。

此规律大致适用于许多厌氧生长的微生物，测定结果略有差异（这与测定方法有关，可能带来的误差有多种）。因此，为了优化大规模的发酵过程，需要获得更多有关生长得率受哪些因素控制的基础知识。本小节主要以酵母为例讨论各种参数对生长得率及其生理的影响，相信这些数据和取得的经验也适用于其他异养生物。

生长得率取决于许多因素：①碳源的性质；②基质的分解代谢途径；③提供任何复杂基质，菌体将会不再启动一些暂时用不上的合成途径，去合成这些复杂基质；④同化其他养分，特别是氮的能量需求（若提供氨基酸而不是NH3，能量需求会少一些，如提供硝酸盐作为氮源，能量需求会更多）；⑤不利于离子平衡的抑制性物质或其他会对运输系统提出额外要求的培养基组分；⑥生成ATP反应的效率的变化；⑦菌的生理状态，几乎所有微生物随外界环境而调整其生理代谢（如形成孢子），且不同的生理代谢将导致不同的物料与能量平衡；⑧对于连续培养，限制性基质的性质（碳限制的生长常比氮限制的生长的效率更高，过量碳基质的分解代谢可能会走浪费能量的，但对人有用的途径）；⑨连续发酵可能取得的最大生长得率，在低生长速率下维持作用的重要性；⑩微生物的遗传特性。

1.3.2　测定生长效率时应注意的实际问题

为了得到微生物生理与生长得率之间的关系的可靠数据，以下一些实际问题需予以考虑。

1.3.2.1　分批与恒化培养

分批培养所得生长得率的结果难以解释。这是由于分批培养的细胞处在不断变化的环境中，并受其影响，恒化培养可避免这种不利情况。此外，需考虑细胞成分（特别是蛋白质含量或含氮量），因比较不同酵母的生长得率需要了解细胞成分。

1.3.2.2　培养基组成

培养基组成的重要性不容忽视，必须进行严格的试验，以确定限制生长得率的培养基组分。如酿酒酵母的生理和细胞得率受培养基中锰缺乏的影响。在厌氧培养中提供适量的甾醇和不饱和脂肪酸是很重要的。在厌氧生长期间缺少麦角甾醇和油酸会导致低生长得率和YATP值偏低，因在厌氧生长时麦角甾醇和油酸是作为维生素被利用的。

1.3.2.3　流出液的控制

在恒化培养中培养液流出方式对恒化有一定影响。在培养液表面靠抽吸以除去培养液的办法会导致细胞在发酵罐内堆积。发酵罐的菌浓与流出液的菌浓之间的差异可大于10％。解决这些问题常把出料管口置于发酵液体的当中，然后用置于液体表面的电接触传感器控制液体流出速率，从而维持所需的工作体积。

1.3.2.4　取样与代谢物的分析

取样时，对残留基质浓度的测量应特别当心。因在取样期间葡萄糖的消耗仍在继续，从而导致低估发酵罐内分析物的残留浓度。因此，应采用快速取样方法将细胞从发酵液中分离出来，如过滤或把细胞转移到液氮中立即中止代谢活动。

1.3.3　用于生物量形成的能量需求

在异化作用方面可用一术语YATP（g细胞/mol ATP）将细胞得率与能量得率关联。此YATP是从厌氧分批培养中产物的形成求得的，是试验值。表观YATP值会受到维持需求的影响，特别在细菌生长的情况下，引入第二种术语。这是把YATP与维持能量（与生长无关的）联系在一起。对酵母来说，YATP与无多大差别。

曾有人试图计算的理论值。把用于细胞生长的ATP与产生的ATP加在一起便可求得的理论值。比较生长在葡萄糖、乙醇或乳酸中对ATP的需求发现，理论很大程度上取决于碳源，见表1-11。若碳源是通过主动（需能）运输，会得到比低的值。

理论不能用于计算细胞得率。YATP的试验值比理论值低许多。例如，酿酒酵母厌氧葡萄糖限制下生长的理论值在D=0.10h-1的条件下为28g生物量/mol ATP，但其试验值为14～16g生物量/mol ATP。ATP需求的理论值与试验值的差异可能是一些仍未归纳到表1-11的因素所致，如蛋白质和代谢物的胞内运输，或低估用于蛋白质合成的ATP消费。据此，采用生物量形成所需的理论ATP加上一固定的ATP量可以接近实际值。后一附加量是由理论计算出的厌氧ATP需求减去试验获得的厌氧ATP需求，这是在一套培养条件（D=0.10h-1）下用酿酒酵母做的。用此法计算，ATP需求的理论值与观察值的差额为2700mmol/g生物量。

1.3.4　呼吸效率

若已知代谢物的生物合成途径，便有可能从碳源或混合碳源求得其理论得率。如该生物合成是需能的，则其理论得率会受产生菌的P/O商的影响。一代谢物的生产导致净ATP或还原当量的生成的情况下，P/O商将会影响能量耗散的程度。因此，要想改进初级或次级代谢物的得率，需要测定生产菌种的P/O商。

P/O商是指消耗0.5mol O2形成ATP的量。精确测定P/O商较难，实践中一般从碳限制条件下恒化器培养中测定微生物的生长得率。为了测定菌的P/O商，需测量随稀释速率变化的呼吸速率（）。从连续培养中对稀释速率所作曲线的斜率的倒数可求得基于氧的最大生长得率（）。由式（1-28）从可求得P/O商（K）：

　　 （1-28） 　　

应强调的是，利用葡萄糖及矿物盐细胞生物合成的理论ATP需求是28.8g DCW/mol ATP，而通常从生长得率和已知ATP合成途径求得的ATP需求为12～14g DCW/mol ATP，这是测量P/O商的重要误差来源。另一误差来源是忽略了经基质水平的磷酸化合成的ATP。结果常过高地估算P/O商值。尽管如此，只要生长在同一碳源的碳源限制条件下的差异可减到最小，P/O商可用于表征生长效率。用此法测得的P/O商只是一近似值，但它不失为分析代谢物生产的能量学的一种可行办法。

在研究需氧细胞得率方面的一个重要参数是呼吸效率，也是用P/O商表征。酿酒酵母线粒体的P/O商要比产朊假丝酵母或哺乳动物线粒体低。酿酒酵母缺少位点Ⅰ的质子易位作用（proton translocation），且其还原当量不能穿过内部线粒体膜。故还原当量被分隔在胞液和线粒体库。结果酵母中的这两处NADH分别被各自的NADH脱氢酶氧化。胞液NADH的氧化总是避开位点Ⅰ的质子易位作用。有关鼠线粒体P/O商的数据表明，线粒体NADH氧化的结构性P/O商在1.5～2.5。在酿酒酵母线粒体中乙醇氧化的P/O商为1.5；而胞液NADH或磷酸甘油氧化的P/O商为1.25。鉴于酿酒酵母的匀称的电子输送链，P/O商并不取决于还原当量的定位作用，即P/O商不取决于碳和能源。对生长在乙醇中在同化期间出现还原当量的净产生，可区分两种极端的情况，若乙醇代谢的头两步是在线粒体或胞液中进行，则有77％的总还原当量在线粒体中形成，并用于能量传递。如果这些酶是在胞液内的，只有28％的总还原当量在线粒体中产生，可求得生长在葡萄糖的结构性P/O商为2.0；生长在乙醇的P/O商为1.8～2.3（用乙醇或乙醛脱氢酶，二者均为胞液的或线粒体的）。

P/O商的大小对细胞得率具有重要的影响。现有的数据说明，碳源对P/O商有一些影响，但在细菌中P/O商取决于质子易位的数目。为了评估体内P/O商对生物量得率的影响，计算生长在葡萄糖、乙醇和乳酸上作为有效P/O商函数的生物量得率，见图1-28。为了计算得率，需要设定YATP值，可在表1-11的理论值上加上一固定值，2700mmol/100g生物量。从图1-28可以看出，在P/O商为2.0以上，生长在乙醇上的生物量得率维持不变。在这一点生长受到碳源可利用性的限制。考虑到部分碳源必须异化以提供NADPH，生长在葡萄糖和乳酸上的最大生长得率分别为0.68g/g和0.65g/g碳源。从图1-28可得出，体内有效P/O商高达3.0，这些数值是不可能得到的。

1.3.5　维持能与环境因素的关系

维持能（即维持的能量需求）是指分解代谢产生的用于非生长的活动那部分能量。这些活动包括大分子的周转、无效（futile）循环、维持细胞体内平衡。通常可用1/Y对1/D作曲线，其中Y代表基于碳源、氧或ATP的细胞得率，当然，也可能存在与生长有关的维持能。

一般来说，酵母在各种碳源上的维持系数很小，细菌的则大许多。酵母中维持能对生长得率的影响比细菌的要小得多。因受值变化的影响，在细胞组分变化大的情况下是很难求得维持系数的。维持能还受pH、温度、培养基的渗透压、氧和二氧化碳分压的影响。研究环境对维持能影响的最有效手段是恒化培养。

1.3.5.1　渗透压

若在生长培养基中加入高浓度的盐，细胞会脱水，为了恢复渗透压的平衡，胞内出现溶质的积累，使胞内盐浓度维持在低于培养液的水平。酿酒酵母的主要渗透压调节剂为甘油，而其他一些酵母在盐的应力下在胞内生成甘油和阿拉伯糖醇。酿酒酵母在分批培养中在渗透压应力下有29％的葡萄糖转化为甘油。在1mol/L的NaCl下酿酒酵母厌氧生长的维持能需求增加了4倍。按以下方程，每生成1分子甘油，需要净输入1分子ATP。

有些耐渗酵母以主动钠驱动运输方式运输甘油。这些酵母把一小部分的葡萄糖变成甘油，并且将大部分甘油保留在胞内。添加解偶联剂2，4-二硝基酚（DNP）会导致甘油的排泄。在酿酒酵母中未发现甘油的主动运输系统。

培养环境的渗透压应力也会影响Lactobacillus paracasei的乳酸生产。X.W.Tian等［62］的研究指出，环境渗透压（844～1772mOsm/kg）对乳酸的生成影响很小，但超过3600mOsm/kg时乳酸的生产受阻。作者在分批培养中采用一种新的策略，添加两种中和试剂Ca（OH）2与NH4OH，使L-乳酸的比生产速率提高2.21倍，达到5.94（g/L）/h。故有理由认为，在乳酸发酵后期的抑制效应，除了其自身的作用，还应归咎于环境渗透压应力的剧烈上升。

1.3.5.2　水活度

水活度对基质、CO2和O2对应的细胞得率YX/S、YX/C、YX/O的影响可从图1-29看出，这里可看出，YX/S、YX/C似乎有一峰值，最高的细胞得率不是在最大的生长速率下，而是在0.9μmax，即在Aw=0.993时获得。

1.3.5.3　氧和二氧化碳分压

生物量得率与氧吸收的关系可用Cooney提出的关系式表示：

　　 （1-29） 　　

以甲醇为基质时，

　　 （1-30） 　　

式中，m（O2）和m（细胞）分别为氧和细胞的质量，g；C、H和O是每一基质的原子数；C′、O′、N′和H′分别为细胞中的C、O、N和H的元素组分，以DCW％表示；Y是细胞得率；MW是碳源的分子量。

对典型的细菌（xj）来说，式（1-29）可简化为：

　　 （1-31） 　　

式中，假设灰分=0，细菌的最低相对分子质量为C6H9.5N1.16O3=123.5。

对以葡萄糖为基质的酵母（jm）：

　　 （1-32） 　　

假设灰分=0，酵母的最低相对分子质量为C6H10.9N1.03O3.06=145。将生长在各种基质上的菌对氧的需求与细胞得率作曲线，得图1-30。从式（1-31）和式（1-32）可知，氧的需求与细胞得率成反比。在得率一样的条件下比较，氧化状态越高的基质，菌对氧的需求越少，高氧和二氧化碳分压通常会影响微生物的生理和细胞得率。

氧应力的作用可能是形成过氧化物或羟基所致。呼吸形成的过氧化物可以被酵母胞液或线粒体的超氧化物歧化酶（SOD）转化为过氧化氢，随后被过氧化物酶和触酶分解。酵母中的线粒体细胞色素c过氧化物酶（CCP）可能在H2O2的去毒上起主要作用。表1-12列举了与防卫机能有关的若干与氧基团和H2O2产生的相关反应。由此可见，酵母可以作为中间体产生H2O2。由CCP分解H2O2会影响生长得率，因电子在细胞色素c的水平被接受，从而避开细胞色素c氧化酶复合物，使得P/O商降低。表1-13列出多形汉逊酵母葡萄糖限制培养中H2O2对生长得率的影响。随添加到培养基中的H2O2量的增加，氧作为电子受体被H2O2取代。在发酵罐内H2O2残留浓度低于0.5mmol/L。尽管如此，如部分避开位点Ⅲ的质子易位，只有P/O商降低，H2O2对生长得率的负向影响比预期的要大。因此，尽管H2O2在发酵罐中的浓度低，但H2O2影响菌的生理。H2O2的减少与乙醇厌氧氧化偶合说明H2O2确实起电子受体的作用。

一般采用纯氧或添加产生氧基的化合物，如百草枯（paraquat）来研究微生物对高氧压和氧基的敏感性。于酿酒酵母恒化培养中通入100％的纯氧，会导致得率降低25％～40％（取决于稀释速率）和总SOD活性的增加。在D=0.10h-1，葡萄糖限制下酿酒酵母生长在0.6bar氧分压期间生长得率降低24％。假丝酵母属对氧压的增加也敏感。产朊假丝酵母的生长得率在氧分压大于350mbar（氧饱和为1bar）下急速下降；另一菌株在210～500mbar间的得率下降到零。这些数据说明，溶氧分压略高于210mbar，便会导致生物量的下降。

二氧化碳的毒性作用部分原因在于离解为。碳酸根抑制许多酶（包括三羧酸循环的酶，如琥珀酸脱氢酶）并可能影响质膜透性。酿酒酵母需氧分批培养在CO2高于350mbar（1bar的空气压力等于0.35mbar CO2）下生长得率下降，但在下生长得率只下降10％。高密度培养可能产生与气压有关的问题。用空气来通气，有时不能确保供氧条件。在这种情况下可采用富氧或纯氧。在纯氧下局部高氧浓度可能产生氧基。如CO2未被带走，高浓度的CO2会抑制生长得率。有时可以利用抑制生长来增加产物的转化。例如，用高氧压来增加曲霉和热带假丝酵母柠檬酸生产得率。

1.3.5.4　温度

在最适生长温度下生物量得率不一定最大。例如，K.marksianus分批生长在40℃下的生长速率最高。但在恒化培养期间（D=0.10h-1）其生长得率在38℃和30℃分别为0.42g/g和0.48g/g葡萄糖。当生长温度从30℃升高到40℃，不同碳源生长的大肠杆菌的维持系数增加7～10倍。这是由于细胞材料周转的增加所致。

高温常使酵母变成小个体突变株，并可能影响质膜透性，使产能的效率降低，维持需求增加，导致得率的减小。这是由于葡萄糖被无活力培养物消耗所致。在醇、有机酸（包括辛酸和乙酸）的存在下会加重高温对生长的负作用。生长温度显著影响细胞的组分，细胞组分（特别是蛋白质含量）影响生物量对ATP的需求，因而影响生长得率。

温度也影响碳源基质转化为细胞的得率。如图1-31所示，在多形汉逊酵母连续培养中甲醇转化率最大时的温度比μ最大时的温度要低。其生长得率随温度升高而降低，主要原因是维持生命活动的需求增加（维持系数的活化能为50～70kJ/mol）。最大的转化率所处的温度一般略低于最适生长温度。如需使转化率达到最大，这一点对过程的优化特别重要。

1.3.5.5　pH

酵母可以在外界环境pH变化（pH3.5～9）下大致维持胞液pH恒定。质膜ATPase在pH内环境稳定方面起重要作用。生长在被缓冲的pH3.5比生长在pH5～6下其质膜ATPase的活性增加2～3倍。质膜ATPase的活性降低的酿酒酵母突变株比野生型菌株对生长在低pH和乙酸（这可能会降低胞液的pH）的影响更为敏感。

在恒化培养中酿酒酵母生长得率通常在某一范围内与培养基的pH无关。在较低的pH下得率下降。酿酒酵母的蛋白质含量不受pH的影响，故得率的降低可能不是由于细胞成分的变化，而是由于在较低pH下质子的被动流入更多。

在酿酒酵母厌氧葡萄糖限制的恒化培养中培养基pH与维持能存在明显的关系。假定生物量形成的能量需求（即试验）不变，可以求得这种关系式。这样求得的维持能随pH的降低而大大增加［最高达12（mmol ATP/g）/h］，以维持能的对数对培养pH作曲线得一直线。这说明解偶联的程度是质子浓度的线性函数。皮状丝孢酵母对外部pH很敏感，在好氧葡萄糖限制生长期间在pH6～3.5之间生长得率下降，在pH3.0出现洗脱现象。细胞组分受pH降低的显著影响，会使蛋白质和RNA含量增加25％。细胞组分的改变使培养基pH的影响的分析复杂化，因生物量形成的ATP需求取决于细胞组分。酿酒酵母在葡萄糖限制恒化培养下生长得率受温度和pH的影响，在pH2～7和温度22～35℃下其最大生长得率出现在pH4.1和28.5℃。

1.3.5.6　副产物对生长得率的影响

（1）醇　乙醇在酵母生产中是不受欢迎的。葡萄糖浓度过高或生长速率过快均会出现所谓Crabtree效应，即在有氧条件下产生乙醇的现象。这种现象出现在超过临界稀释速率的糖限制的恒化培养中，此临界点主要取决于菌株。酿酒酵母的临界D高达0.38h-1，而其他菌株在D=0.25～0.30h-1间便已开始形成乙醇。

除碳的损失外，乙醇还会干扰细胞代谢。乙醇的影响范围较广，可能增加膜的渗透性，导致氨基酸的泄漏，促进乙酸的解偶联反应，跨质膜的质子驱动力（pmf）的消耗，抑制某些酶（特别是质膜ATPase）。有人对乙醇对质膜ATPase的抑制作用提出异议，用卡儿斯柏酵母的泡囊（vesicles）试验发现，这是乙醇降低跨质膜的pmf，而不是对ATPase的抑制作用所致。乙醇可以增加泡囊的透性。只有在乙醇体积分数很高（15％）时，才会直接抑制或钝化胞液中的酶，此浓度可能是大多数酿酒酵母能忍受的极限。给酿酒酵母一次性乙醇后会引起被动质子输入的明显增加，这至少部分是由于乙酸的形成，导致胞内pH暂时降低。

在分批培养中生长在葡萄糖上的酿酒酵母，当添加的乙醇浓度超过4％，生长得率便开始下降。乙醇的毒性，特别是对发酵的抑制作用是由于碳源以外的培养基组分的耗竭。例如，添加生物素或镁离子可以明显解除乙醇的抑制作用。外源乙醇的毒性比内源乙醇的小。许多原以为是乙醇引起的作用实际上是其他代谢物，如碳链长一些的醇或有机酸造成的。

（2）有机酸　在酵母生长期间即使在碳源限制的条件下也会产生有机酸。有机酸可能将能量的生成与细胞形成的偶联解除。有机酸的非偶联机制示于图1-32。不能代谢的有机酸以非解离形式通过被动扩散进入细胞内，其吸收速率与pH有关。一旦进入细胞内，有机酸将因胞液的高pH而被解离。这说明有机酸实际上起质子导体的作用。若此过程继续不减弱，跨质膜的ΔpH将消失，跟着胞内外pH变成相同。为此，必须通过质膜ATPase将质子驱逐出胞外。这便需要ATP的水解，为了提供这一ATP，便需要增加呼吸和/或发酵，这取决于生长条件（阴离子的去向不明，一般，假定质膜对阴离子是不能透过的）。因此这种弱酸的作用不同于解偶联剂，如2，4-二硝基酚（DPN）（DPN无论是解离或非解离状态都能透过），让它们进行跨膜快速循环，从而导致ΔpH和Δψ的耗散。若干有机酸（如苯甲酸、山梨酸）可能通过迄今未知的主动运输机制被排泄。