1.2　细胞周期

细胞周期（cell cycle）是指细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变，完成一个活动后才能进行下一个活动。典型的真核生物细胞周期如图1-19（a）所示：S、M和G1、G2分别代表DNA合成、有丝分裂期和两次间隙。若生长速率因养分多寡而改变，S、G2和M几乎不变，只有G1改变。原核生物在低生长速率下的细胞周期与真核生物相似［见图1-19（b）］，其染色体复制期C相当于S；细胞分裂期D相当于G2+M；C和D不随生长速率变化，只有G1可变动。有证据表明，C和D也略有变化，假设其不变，考察细胞周期的各项活动如何去适应生长速率变化的需要。

1.2.1　染色体复制与细胞分裂的调节

大肠杆菌和枯草杆菌只有一个环状染色体，其复制是从原点向两个方向进行。单一染色体复制所需时间相当恒定，大肠杆菌在37℃一般需40min。染色体的复制需精确控制，分裂时每个子细胞所得的遗传物质是完全一样的。细胞分裂紧随DNA合成之后。凡能抑制DNA合成的因素也会抑制细胞的分裂，结果形成很长的细胞。

在高速生长下，如细胞周期为30min，染色体复制不能在一个周期内完成。为此，前一轮复制还未结束，后一轮复制又在原点上启动，如图1-20所示。可以把C期的启动和终止，以及细胞分裂看作是不可更改的活动顺序，称为C+D周期。若增代时间少于C+D时间，C+D周期重叠，其重要特征是分配到子细胞的染色体已开始新的一轮复制，这类染色体称为二叉染色体（dichotomous）。染色体复制和细胞分裂的调节规律如下；①染色体复制未完成，细胞就不会分裂。不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后。②不管生长速率如何，C和D所需时间大致不变。③C和D可以依次或同时（指上一轮的D和下一轮的C）进行。

1.2.2　染色体复制的启动

染色体复制的启动受启动因子（origin，一种特异调节性蛋白）的正向控制。当启动因子增加到某一临界水平，启动便开始。在这以后启动因子被毁或稀释。合成启动因子达到有效浓度所需的时间恰好等于培养物增代时间。大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细胞质量之比在各种生长速率下是一定的，这一比例实际上是染色体启动因子的浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度，当它达到一临界值时便启动新一轮的复制。启动的直接后果是启动因子的浓度提高一倍。启动不会重新发生直到其浓度因生长而降到临界值。这种控制机制构成一种生物钟，它是以细胞体积或其他有关参数为依据。据此，染色体复制的启动频率是DNA合成速率的控制步骤。

启动总是在染色体上的专一位置上进行，此位点称为复制或染色体原点。启动和复制是性质截然不同的两种过程。证据有三：曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成，除去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允许复制继续完成；培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有完整的染色体。细胞分裂是与染色体的完成复制同步的，这样，在隔膜形成前每个子细胞会获得其DNA。显然，当DNA复制完成时合成了一种“中止蛋白”，也正是这种蛋白启动隔膜的形成与分裂。

1.2.3　细胞周期的研究方法

1.2.3.1　镜检法

用电子显微镜观察单个细胞的生长并定时拍照，由此发现大肠杆菌在分裂时细胞大小的变化不大。这说明似乎存在一种控制细胞大小的因子，即启动细胞质量。

1.2.3.2　同步培养法

同步培养法（synchrony）有密度梯度离心沉降法和过滤洗脱法。

（1）密度梯度离心沉降法　这是按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养物分级。近来，采用H2O/D2O密度梯度沉降法。其优点是能应用于任何品种，不会施加渗透压强的影响。从某一密度带便可分离出同质的细胞群体并加以培养。图1-21显示细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系。

（2）过滤洗脱法　将细胞黏附在固体支持物，如硝化纤维膜上，然后将其倒置，让生长培养基从上到下通过，新生的细胞便被洗脱到培养基中，呈一种特征性的振荡模式，见图1-22。

在初始冲洗（wash-off）期后从滤膜上洗脱下来的主要是新分裂的细胞。在洗脱曲线高峰处从膜上洗下的细胞是沉积在膜上的新生细胞后代，在低峰处洗下的是其沉积时正要分裂细胞后代。

1.2.3.3　同位素示踪法

如亲本培养物沉积在滤膜上之前用氚标记胸苷使细胞带上标记，则结合到洗脱细胞的标记量与结合到亲本培养物那一年龄细胞的标记量成正比。图1-23（a）显示实验结果的理论曲线。此培养物的增代时间为65min，C和D分别等于40min和20min。图1-23（b）显示的实验结果和那些预测的几乎完全一致。此方法的缺点在于洗脱分布有噪声，经几个细胞周期后很快便偏离洗脱曲线的理论值。在低生长速率下洗脱曲线的噪声使数据的定量解释变得很困难和主观。

另一种研究细胞周期的方法是通过蔗糖密度梯度离心，使一对数生长的培养物沉淀，收集最上层的细胞，在含有氚标记胸苷的生长培养基上生长，测量其DNA合成速率。从图1-24可见，第一个细胞周期比初始的培养物的平均细胞周期要长，第二个细胞周期要短些。这可能是诞生时细胞个子分布在平均值上下。过后，效率更高的细胞比个体最小的那部分细胞更占优势。

1.2.4　生长速率与细胞大小的关系

生长培养基越丰富，细菌生长速率加快，其细胞也越大。如在同一种培养基内改变温度也会影响生长速率，但对细胞大小几乎没有多大影响。如一细胞的增代时间为60min，在细胞分裂结束时染色体复制便开始启动。假设细胞这时具有质量为m（启动细胞量=1/启动因子浓度），从图1-25可见，个体细胞的量呈指数增加，直到2m，细胞便开始分裂。如此时从培养液中检出新生的细胞，置于较丰富的培养基（能使菌快速生长，增代时间为35min）中，并假定细胞迅速调整到新的生长速率。这样，个体细胞量增长速率往上移动，如C+D规律还适用，下一个细胞分裂的时间不会变动，但细胞会增大。新一轮复制的启动将在细胞分裂前便开始。换句话说，C+D周期开始重叠。快速生长经一个细胞周期后便达到新的平衡。生长速率越快，细胞大小的差异也越大。可用式（1-25）表示细胞周期t对指数培养物的细胞平均大小m的影响。

　　 （1-25） 　　

式（1-25）曲线的形状将取决于C、D和K是否变化，只有在简单情况下lgm与t作曲线才会得一直线。将生长稳定期的培养物移种到新鲜培养基中，经短暂停滞后细胞先变大，接着细胞中的DNA含量增加，细胞数目随后也在增加，见图1-26。当培养物进入生长稳定期后，细胞先渐渐变小（这是细胞量增长速率下降后细胞分裂继续指数地进行的缘故）。这时细胞中的DNA含量也在逐渐减少。细胞数目的增长随后下降，直到进入生长稳定期为止。

1.2.5　生长速率对细胞内DNA含量的影响

细胞中的DNA含量随生长速率的增加而下降，可用式（1-26）表示：

G/m=［t/（KCln2）］（1-2-C/t）　　（1-26）

式中，G是基因组的当量，为每个细胞的DNA平均值。

图1-27展示生长速率对DNA浓度和染色体构型的影响。这组曲线显示以启动细胞量为单位的生长随时间的变化。一个启动细胞量单位含有一个刚开始一轮复制的染色体。用一水平线C表示时间（min），它在纵轴上所处高度代表细胞量。假定细胞量的复制时间为70min，见图1-27（a），将出现复制期的间隙。当细胞量增加到3倍时它将完成4个复制好的染色体。如在初始时把细胞置于增代时间为40min的培养基内，见图1-27（b），则新复制期将紧跟在上一复制完成之后开始，它们之间不存在间隙。待细胞量增到3个单位时，下一复制期将不会完成。结果得到2条复制了一半的染色体，DNA浓度下降到3/3。如将细胞置于增代时间为20min的培养基内，在第一复制期还未完成前下一复制期已开始。当细胞量达到3时，只有一个带三个复制叉的染色体，见图1-27（c），DNA浓度进一步下降到2.25/3。

图1-27说明了生长速率如何影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数。在一随机的指数培养物中，接近原点处的基因，其拷贝数总是居多，靠近两端的较少。这种相对基因剂量的倾斜度随生长速率的增加而提高。它也取决于复制时间C。一般认为二叉复制导致染色体原点附近的基因数目的增加。其实并非如此，DNA的浓度随生长速率的增加而下降，从而不同程度地影响基因浓度。那些靠近染色体原点的基因浓度没有变化；位于中间的基因平均浓度则只有原点周围的一半左右；处在染色体复制近末端的基因浓度最低。据此，对生长速率有限制作用的基因应位于靠近染色体原点处。其实，这是为什么大肠杆菌中有6个拷贝编码核糖体RNA的基因都聚集在原点附近的缘故。

1.2.6　生长速率对细胞组分的影响

一般来说，细菌生长越快，其个子越大，含RNA越多，其中大部分是核糖体。生长速率随核糖体含量线性地增加。这是由于核糖体是蛋白质合成的速率限制步骤。实际上，每个细胞RNA随生长速率的变化可以达10倍之多。在快速生长的细胞中RNA的含量可以达到细胞重量的30％。每个细胞的DNA也随生长速率的提高而增加，但程度低一些。因此，以细胞重量衡量，DNA含量是减少的。细胞外壳的厚度通常不变，胞壁和质膜在整个细胞中的比例随细胞个子的增大而减小。