2.3.2 制曲工艺研究

豆豉制曲的目的是使菌种在蒸煮后的豆粒上生长并产生各种酶。为了生产具有溶栓功能的豆酱，就需要使枯草芽孢杆菌M64菌体在产生蛋白酶的同时产生大量的纤溶酶。因此制曲后蛋白酶和纤溶酶的活力的高低是检验的关键指标。实验以蛋白酶和纤溶酶的活力为检测指标，研究了接种量、糖加量、制曲温度和制曲时间对两种酶活力的影响，以确定制曲工艺。

2.3.2.1 蔗糖添加量对纤溶酶和蛋白酶产量的影响

为了促进枯草芽孢杆菌M64菌体细胞的生长，在蒸煮后的大豆中拌入一定量的糖。将蒸煮冷却后的大豆，拌入0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的蔗糖，接入1%的菌悬液，空气相对湿度85%，36℃培养24h后，测定豆曲中纤溶酶和蛋白酶活力，实验结果见图2-8。

由图2-8可以看出，蛋白酶及纤溶酶都是枯草芽孢杆菌M64的次级代谢产物，蔗糖添加量对两种酶产量的影响有相同的趋势。蔗糖是易被利用的碳源，有利于枯草芽孢杆菌M64菌种的生长和酶等代谢产物的产生。当蔗糖添加量在0.1%～0.2%时，随着蔗糖添加量的提高，豆曲中纤溶酶和蛋白酶活力显著增大，当蔗糖添加量继续提高，豆曲中纤溶酶产量不再增加，而蛋白酶产量则呈现下降的趋势，因此最适蔗糖添加量为0.2%。

2.3.2.2 接种量对纤溶酶和蛋白酶产量的影响

接种量的高低会影响菌体的生长速度，进而影响水解酶等次级代谢产物的产生。将蒸煮冷却后的大豆，拌入0.20%的蔗糖，分别接入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的菌悬液，空气相对湿度85%，36℃培养24h后，测定豆曲中纤溶酶和蛋白酶活力，实验结果见图2-9。

由图2-9可以看出，由于接种量影响菌体的枯草芽孢杆菌M64生长量，纤溶酶和蛋白酶都是菌体细胞的次级代谢产物，导致接种量对豆曲中纤溶酶和蛋白酶产量的影响呈现相同的趋势。当枯草芽孢杆菌M64的接种量在0.5%～1.5%之间时，随着接种量的增加，豆曲中纤溶酶和蛋白酶的产量显著增大，当接种量继续增加，豆曲中两种酶产量不再增加。这主要是由于枯草芽孢杆菌M64的接种量过大时，菌体过量生长，物料中营养物质过量消耗，导致次级代谢产物产量下降，因此适宜的接种量为1.5%。

2.3.2.3 制曲温度对纤溶酶和蛋白酶产量的影响

温度是影响微生物生长及代谢产物产生的重要因素，当温度低时，菌体的生长速率降低，次级代谢产物的产生速度降低，但温度过高导致菌体的衰老死亡及代谢产物产量降低。将蒸煮冷却后的大豆，拌入0.20%的蔗糖，接入1%的枯草芽孢杆菌M64菌悬液，分别在28℃、32℃、36℃、40℃和44℃，空气相对湿度85%的条件下培养24h，测定豆曲中纤溶酶和蛋白酶活力，实验结果见图2-10。

由图2-10可以看出，温度对纤溶酶和蛋白酶产量影响显著。纤溶酶在36℃时产量最大，而蛋白酶在32℃时产量最大，但32℃和36℃时产量差异不显著，因此，适宜的发酵温度选择为36℃。

2.3.2.4 制曲时间对纤溶酶和蛋白酶产量的影响

微生物生长及次级代谢产物的产生与培养时间有重要的关系，在微生物培养的前期主要是细胞的生长，然后进入各种代谢产物产生的时期。因此培养时间对制曲中各种水解酶的产生量有重要影响。

将蒸煮冷却后的大豆，拌入0.20%的蔗糖，接入1%的菌悬液，在空气相对湿度85%，32℃培养16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h，测定豆曲中纤溶酶和蛋白酶的活力，实验结果见图2-11。

由图2-11可以看出，发酵时间对豆曲中纤溶酶和蛋白酶产量影响显著。当制曲时间小于36h时，随着制曲时间的延长，两种酶的产量逐渐增大，当制曲时间大于36h时，蛋白酶和纤溶酶的产量不再增大。因此，适宜的制曲时间为36h。

2.3.2.5 制曲工艺正交实验

根据单因素确定的适宜的接种量、蔗糖添加量、制曲温度和制曲时间为正交实验的中心点，以蛋白酶和纤溶酶活力为指标，进行四因素三水平的正交实验，因素水平及实验结果分别见表2-4和表2-5。

由表2-5可以看出，在枯草芽孢杆菌M64制曲过程中，豆曲中蛋白酶的最佳工艺条件为A₃B₃C₃D₃，即接种量1.8%、蔗糖添加量0.25%、制曲温度40℃，制曲时间38h。影响豆曲中蛋白酶产量的主次顺序为发酵温度、蔗糖添加量、制曲时间和接种量。豆曲中纤溶酶产生的最佳工艺条件为A₃B₂C₂D₂，即接种量1.5%、蔗糖添加量0.25%、制曲温度36℃，制曲时间36h。影响豆曲中纤溶酶发酵的主次顺序为蔗糖添加量、发酵温度、制曲时间和接种量。在大豆的制曲过程中首先要求蛋白酶含量高，同时为了提高溶栓功能性，产品中纤溶酶的活性也需要提高。综合考虑这两个参数，确定制曲过程中最佳的蔗糖添加量为0.25%；另外制曲温度对两种酶的产量影响较大，因此制曲温度可选择介于两者最佳制曲温度之间的温度即38℃；其他两个因素影响较小，从降低生产成本，缩短整个制曲时间考虑，选择菌种接种量1.5%，制曲时间36h。

2.3.2.6 验证实验

在以上正交实验确定的最佳制曲条件下进行3次独立平行实验，测定豆曲纤溶酶和蛋白酶活力，实验结果见表2-6。

由表2-6可以看出，在确定的最佳制曲工艺条件下进行3次实验，豆曲蛋白酶和纤溶酶活性的平均值分别为3432U/g和2168U/g，高于正交实验各组的实验结果。