金花葵中黄酮类物质的液相色谱法分析

臧健，李宏博，吴正超，刘文娥，李亮亮^*

（沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866）

金花葵，又名菜芙蓉、野芙蓉、有的地区别名叫黏干或山榆皮，是锦葵科秋葵属一年生草本植物，在200多种秋葵植物中最具食用、药用、保健价值^[1]。该物种原已被国内外生物界定为绝种植物，直到2003年8月被中国农业科学研究院在河北邢台地区意外发现，经多年重新栽培繁育，目前全国范围内包括黑龙江、辽宁、山东、山西等地种植面积超过万亩^[2]。

黄酮类化合物具有抗氧化、调节机体免疫力、降低心血管疾病发生、抗炎、降血糖等生理活性^[3]。有报道^[4]称金花葵中黄酮含量高达干重 5.6%，是已知天然产物中含量最高者。目前，研究者^[5-7]多以金丝桃苷作为金花葵中黄酮类物质的活性指标，而其所含黄酮具体种类有哪些还未见报道。本文利用HPLC法对金花葵中的黄酮物质的种类及其含量做了初步探索，为金花葵的进一步开发利用提供了依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　样品来源

金花葵样品取自沈阳林昰商贸有限公司位于辽宁省本溪市桓仁县的六道沟种植园，在金花葵八九月份的开花期，由人工采摘（带花托），经低温（45～50℃）烘干3天，密封保存。

1.1.2　主要试剂

金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷等标准样品，购自成都曼斯特生物科技有限公司；分析纯甲醇及磷酸，天津康科德科技有限公司；色谱纯甲醇、乙腈，迪马公司；纯净水，浙江娃哈哈集团公司。

1.1.3　主要仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有四元低压梯度泵、二极管阵列检测器；思博尔系列C18柱（4.6mm × 250mm，5μm）（迪马公司）；万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）； KQ-500DB 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；制样粉碎机（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。

1.2　方法

1.2.1　色谱条件

C18柱（4.6mm × 250mm，5μm），流动相为A. 乙腈，B. 0.05%磷酸溶液，梯度洗脱程序为（以A相为准）：0→25min，12%→35%A；25→27min，35%→12%A；27→32min，12%A；流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长355nm，进样量20μl。

1.2.2　样品处理

取1.1.1中样品用剪刀剪碎成小块，再用粉碎机粉碎，过100目筛后转移至密封袋保存。取5g于烧杯中，加70%甲醇水溶液100毫升，于30℃下超声震荡50min，过滤并转移至100ml上述样品升容量瓶，用70%甲醇水溶液定容至刻度，制成样品提取液。取1ml过0.22μm滤膜准备上机。

1.2.3　标准溶液配制

分别准确称取金丝桃苷8.5mg、槲皮素3.7mg、芦丁10.4mg、牡荆素5.2mg、牡荆素鼠李糖苷11.6mg 于 10ml 容量瓶中，用甲醇定容制成浓度分别为 0.85mg/ml、0.37mg/ml、1.04mg/ml、0.52mg/ml、1.16mg/ml的原始储备液，再取上述溶液各2ml混合，制成混合标准样品储备液，−20℃保存备用。

2　测定与分析

2.1 HPLC方法建立

2.1.1　流动相的选择

为实现样品中所有黄酮类化合物的最佳分离，我们在流动相的选择上尝试了水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-甲醇、磷酸水-乙腈等组合，前三者均有保留时间长，峰型较宽的问题，因此我们选择了磷酸水-乙腈为流动相。

磷酸水溶液的浓度选择：我们先后考察了浓度为0.01%、0.05%、0.1%及0.2%的磷酸水溶液与乙腈组成流动相，发现0.05%～0.2%的比例时分离良好，而磷酸浓度较低时，分离出现色谱峰展宽现象，综合考虑流动相酸度对色谱柱及仪器的影响，最终选择0.05%磷酸水溶液与乙腈组合作为流动相。

洗脱方式选择：尝试各种比例的等度洗脱后，发现均不能达到满意效果，尤其是牡荆素与芦丁很难实现分离，最终确定梯度洗脱程序如下（以A相变化为准）：0→25min，12%→35%A；25→27min，35%→12%A；27→32min，12%A。实验结果表明，按上述梯度洗脱程序进行分离，5种黄酮分离情况良好，图1为5种黄酮标准样品的色谱图。

2.1.2　检测波长的选择

利用二极管阵列检测器，在2.1.1条件下对五种黄酮类物质进行吸收光谱扫描，得到最大吸收波长结果为：牡荆素鼠李糖苷342nm；牡荆素340nm；芦丁355nm；金丝桃苷355nm；槲皮素372nm，综合考虑我们将检测波长确定为355nm。

2.1.3　流速的选择

实验考察了流动相流速为0.6～1.2ml/min时，5种黄酮混合标准品及金花葵样品的分离情况，发现流速为1.0ml/min时分离效果最佳。

2.1.4　柱温的选择

实验考察了色谱柱温度分别为25℃、30℃、35℃时，5种黄酮混合标准品及金花葵样品的分离情况，发现色谱柱温度为25℃时，色谱峰宽较窄，分离效果最佳，因此确定色谱柱温度为25℃。

2.2　方法学考察

2.2.1　回归方程、检测限及精密度

将1.2.3中混合储备液逐级稀释成不同浓度，按2.1中色谱条件测定峰面积，并分别以目标物色谱峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，分别得到金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷的回归方程、相关系数和线性范围见表1。以3倍信噪比确定检测限，结果见表1。

取一定浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，进行峰面积和保留时间的精密度考察，结果亦列于表1。表1的结果表明，5种组分峰面积和保留时间的RSD值均较小，表明色谱系统精密度良好。

按1.2.2中方法平行制备6份样品，测定并计算金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素鼠李糖苷4种黄酮含量的相对标准偏差分别为1.82%、1.67%、1.47%和1.64%，表明方法精密度良好。

2.2.2　样品稳定性

取新制备的一份样品溶液，室温下放置0、2h、4h、8h、12h、24h、48h后进样分析，金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素鼠李糖苷的峰面积相对标准偏差分别为1.16%、1.44%、1.29%、和1.47%，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.2.3　加标回收率

取金花葵（花）样品12份，分为4组，每组3份。每组样品中分别精密加入混合标准品储备液0、20μl、50μl、100μl，按前述方法进行样品的制备和测定，计算金丝桃苷、槲皮素、芦丁、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷的含量，计算各组分的回收率，所有组分的回收率在95.20%～99.48%范围内，RSD值均小于2.24%，说明本方法准确可靠。

2.3　样品测定与分析

将样品按1.2.2方法处理后，以2.1中方法进行测定，色谱图见图2。由色谱结果可知：金花葵中黄酮类物质和含量较高，总量可达到4.87g/100g，其中含量最多者为金丝桃苷，其含量达占了全部黄酮的23.31%，绝对含量为1.13g/100g，这与前人的研究结果相符。另外，我们发现样品黄酮种类很多，实验中共分离出黄酮类物质色谱峰63个，其中相对含量超过1%的就有13种，占所有黄酮含量的85.15%；此外，在样品中可以确认有除金丝桃苷外，还有芦丁（7.513%）、槲皮素（2.161%），牡荆素鼠李糖苷（3.346%）而未见牡荆素。样品中黄酮含量信息见表2。

3　结论与讨论

黄酮类物质是预防心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、止血镇痛等诸多功效，金花葵这一宝贵的食用、药用植物在经历濒危之后，现在正迅速的成为种植的热点，本实验建立了高效液相色谱法分离分析其黄酮类物质的方法，该方法分离效果令人满意，实验中发现其黄酮种类丰富，含量较高，经确认的有4种，分别是金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、芦丁和槲皮素，其中金丝桃苷含量达到 1.13g/100g。另外值得注意的是金花葵中黄酮种类达63种之多，其中含量超过1%的就有13种。因此，金花葵中黄酮的其他种类及其作用有必要继续深入研究。

参考文献

[1] 卢丹. 中国药物评价, 2015, 32(2): 90-92.

[2] 马永刚. 中国食品报, 2015年9月18日, 第002 版.

[3] 姜廷福. 分析测试技术与仪器, 2002, 8(4): 582-585.

[4] 杨秀松. 中国药师, 2013, 16(9): 1307-1311.

[5] 易剑峰. 宜春学院学报: 自然科学, 2007, 29(4): 72-97.

[6] 仇燕. 安徽农业科学, 2011, 39(14): 8331-8333.

[7] 邱金玲. 中医学报, 2015, 30(211): 1793-1795.

^*通信作者：李亮亮，男，副教授，博士，从事设施园艺及农业环境生态的研究，E-mail：LLL204600@163.com