缓释粉雾剂分析方法的建立及应用

徐恩宇¹，李浩莹²，刘俊亭^1*

（1．中国医科大学法医学院，沈阳 110122；2．苏州惠仁生物科技有限公司，苏州 215513）

与口服及注射方式相比，吸入式给药途径是治疗呼吸系统疾病的黄金疗法^[1,2]。吸入粉雾剂 （dry powder inhalers，DPI）是目前发展最快的肺吸入制剂，随患者主动吸气气流引发的药物颗粒沉积在呼吸道的不同部位，空气动力学直径在2μm以下的纳微药物颗粒能被肺泡吸收^[3]。通常，药物沉积在肺部会被快速吸收，药物的初期释放往往存在“突释现象”，可能造成局部给药浓度过高，对人体组织或器官有潜在的不良反应。因此，开发一种检测吸入式药物在肺部分布情况的方法显得尤为重要。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

1260型高效液相色谱仪（含G1312B双元泵，G1329B型自动进样器，G1314F型紫外检测器，OpenLAB CDS化学工作站，美国Agilent公司）；B-290小型喷雾干燥机（瑞士Büchi公司）；下一代药用撞击器（Next Generation Impactor，NGI，英国Copley Scientific公司）；RC806溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）。

硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate，SS，美国Sigma-Aldrich公司）；壳聚糖（200～400mPa·s）、壳聚糖（<200mPa·s）、羧化壳聚糖、磷酸二氢钾（上海阿拉丁试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Spectrum Chemicals & Laboratory Products Cali公司）；3号HPMC胶囊，（苏州胶囊有限公司）。

1.2　实验方法

1.2.1　硫酸沙丁胺醇缓释粉雾剂的制备

分别称取药用辅料壳聚糖（Chitosan 200～400mPa·s），壳聚糖（<200mPa·s）和羧化壳聚糖各1.0g，分别加入0.5%醋酸水溶液100ml搅拌溶解，再分别精确加入2mg硫酸沙丁胺醇（SS），搅拌均匀，得质量浓度1.0%的试液。喷雾干燥进口温度150℃，溶液泵速400ml/h，喷嘴压缩空气流量650L/h，真空度100%，出口温度（84 ± 1）℃，喷嘴孔1.5mm。分别收集旋风分离器底部1/3处和收集器中的粉末，并分装于3号 HPMC胶囊，产品储存于棕色干燥器中。

1.2.2　硫酸沙丁胺醇HPLC分析方法的建立

参照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录VD）测定。硫酸沙丁胺醇（SS）化学名称1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇硫酸盐，分子式(C₁₃H₂₁NO₃)₂•H₂SO₄，结构式如图1所示。

1.2.3　试剂的配制

磷酸二氢钠缓冲液（0.08mol/L，pH = 3.15）：称取磷酸二氢钠12.48g，加超纯水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至3.10 ± 0.05后，经0.2μm微孔滤膜过滤脱气后备用。

硫酸沙丁胺醇储备液：精密称取硫酸沙丁胺醇原料药0.5000g加磷酸二氢钠缓冲液溶解并稀释至10ml，摇匀，4℃冷藏保存备用。

空白辅料溶液：按处方工艺制备空白辅料粉末，称取0.02g溶于100ml容量瓶中，加磷酸二氢钠缓冲液溶解并稀释至刻度，得空白辅料溶液备用。

1.2.4　色谱条件

色谱系统：Agilent 1260 infinity泵（1260 bin pump, G1312B），自动进样器（1260 ALS, G1329B），紫外检测器（1260 VWD, G1314F），Agilent化学工作站（OpenLAB CDS）；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 (25mm×4.6cm, 5 µm)；保护柱：Eclipse XDB-C18 (4.6mm×12.5mm, 5 µm)；流动相：磷酸二氢钠缓冲液（0.08mol/L，pH = 3.15）：甲醇=80 : 20；流速0.8ml/min；检测波长276nm；柱温25℃；进样量50µl；理论塔板数：按硫酸沙丁胺醇计算，应不低于 3000。

硫酸沙丁胺醇的HPLC图谱如图2所示，在此条件下，硫酸沙丁胺醇的保留时间约为5.3min。

2　结果与讨论

2.1　标准曲线建立及线性关系的考察

精密量取硫酸沙丁胺醇储备液，加磷酸二氢钠缓冲液逐级稀释成所需浓度的标准系列溶液，分别进行HPLC测定，按“1.2.4”项下色谱条件，重复进样3次。以硫酸沙丁胺醇峰面积A对浓度c进行线性回归，得标准曲线方程：A = 22.55c + 0.039；R² =0.999，如图3所示。

2.2　精密度

取标准曲线项下低、中、高三组浓度样品溶液，分别在日内0h、5h、10h和日间1d、2d、3d重复测定，记录峰面积A₁、A₂、A₃，计算日内及日间精密度（RSD）结果如表1所示。

从表1可以看出，在所选择的含量测定条件下，日间及日内精密度较好，样品稳定性和方法重现性满足分析要求。

2.3　回收率

一般制剂含量测定的回收率是向辅料中加入处方量80%、100%、120%已知含量的主药，按含量测定的方法测定。按照标准曲线一项操作方法，配制低、中、高三组浓度硫酸沙丁胺醇样品液，测定其峰面积，依据标准曲线求得相应浓度，回收率结果如表2所示。

从表2可以看出，在硫酸沙丁胺醇的高、中、低浓度范围内，3 组 9 次测定的平均回收率为99.8% ± 0.24%，相对标准偏差RSD均小于等于1.56%。结果表明：在所选择的含量测定条件下，方法的回收率较好，辅料不干扰测定，该方法可以满足硫酸沙丁胺醇含量测定的需要。

2.4　体外肺沉积性质

吸入粉雾剂体外分布测定采用下一代药用撞击器（NGI），收集杯内涂甘油层可预防粒子回弹。通常在 20℃相对湿低于 35 % 条件下模拟药粉在肺部沉积状况^{[4, 5]}：打开 NGI 铰链盖，放入经甘油涂层的一套收集盘，再将预分离器、人工喉和入口适配器与NGI入口依次连接；取装样胶囊一粒（25mg），精密称定重量W₁后，置于给药装置（Handihaler^®）内，掀压按钮刺破胶囊，在60L/min抽气流下给药5s，称定重量W₂，用小刷拭净残留内容物，再称定胶囊壳重量W₃；分别加入20ml超纯水溶解给药装置（DEV）、人工喉（THR）、预分离器（SEP）和收集盘（S1～S8）各部分含药粉末，精滤液进行HPLC测定。本实验将S2—S8级收集盘中检测到的药物总量定义为有效部位沉积量（FPD，粒径小于4.46μm），其所占收集到全部药物的百分比定义为有效部位沉积率（FPF）。胶囊内容物的排空率按公式：[(W₁−W₂)/(W₁−W₃)]×100%计算，应不少于90%。

2.5　溶出度考察

由于喷雾干燥所得含药粉体粒径小，药物溶出面积大，撒入水中即可溶解，采用“桨法”以减少药物扩散边界层厚度以提高药物的扩散系数来考察其溶解行为。精密称定含 SS 粉末50mg，放入双层纱布制成的松散口袋中，以500ml超纯水为释放介质，水浴控温（37± 0.1）℃，转速50r/min，依法操作^[6]，分别于预定时间点取样2ml，精滤液进行 HPLC 法测定含量，绘制溶出度曲线。

2.6　体外沉积率及排空率

以乳糖制剂作对照组，3种壳聚糖制剂中药物的体外沉积性能见图4。与乳糖制剂相比，壳聚糖载体中药物粉末在人工喉（THR）处药物截留量均显著降低，且在下呼吸道处（S2-S8）的药物沉积量明显提高。此外，羧化壳聚糖制剂中药物在S2—S4部分有效沉积量较高，而200～400mPa·s的壳聚糖制剂中药物在S5—S8部分沉积量最多，即存在较多小于2μm的药物颗粒，可经肺泡吸收提高药物生物利用度（p<0.05）。

由表3可以看出，3种壳聚糖制剂的排空率均超过90%，符合药典要求；有效部位沉积率（FPF）达55%～65%，远高于乳糖制剂的11%，说明壳聚糖制剂粉粒大部分处于“可呼吸粒径”范围内，颗粒间黏附力小、再分散性好，符合SEM和粒度分析结果。

2.7　粉雾剂体外释放效果初评

乳糖、羧化壳聚糖、壳聚糖（<200mPa·s）和壳聚糖（200～400mPa·s）制剂的溶出度曲线见图5。

由图5可知，在初始1min，乳糖制剂中药物释放量超过 80%，说明乳糖载体不具有缓释效果；然而3种壳聚糖制剂中药物释放量在40%～55%，“突释”现象显著下降，且在20min内，药物能释放量均较平稳。在指定时段内，羧化壳聚糖中药物基本释放完全，小于200mPa·s的壳聚糖中SS释放85%，200～400mPa·s的壳聚糖中SS释放70%。药物释放的速度与程度与载体的分子量和溶解性密切相关。乳糖是一种小分子量（342.30g/mol）的化合物，极易溶解于水（25℃和40℃时水中溶解度分别为18.9g和25.1g）^[7]，所以在水中因其有效溶解使得药物快速地被释放，在1min内释放量超过80%，在5min达到完全释放。作为一种壳聚糖修饰方式，壳聚糖羧化后可明显改善其溶解性，与其他2种壳聚糖相比具有较高的溶解度^[8]，所以药物在以羧化壳聚糖为辅料的制剂当中获得了较快的释放速率，且达到平衡时药物可基本获得完全释放。壳聚糖溶解性还与其分子量有关，分子量越大，其溶解性就越差^[9]。而黏度是分子量的外在表现，黏度越高，相对分子质量越大，在水中的溶解度就越低。所以高黏度壳聚糖（200～400mPa·S）比低黏度壳聚糖（<200mPa·S）更能促进药物的缓释效果。达到释放平衡时在高黏度壳聚糖（200～400mPa·S）中药物的释放量为65%，在低黏度的壳聚糖（<200mPa·S）中的药物释放量为80%。这个可能是高相对分子质量的聚合物具有更大的吸附能力，小分子的药物吸附于聚合物的长链上而未能获得自由释放于水溶液中，从而造成高黏度高相对分子质量的壳聚糖所获得了较少的药物释放量。通过这些基础研究数据可以得出，尽管对药物释放量有所影响，但所采用的3种壳聚糖对药物均有一定的缓释作用，而且相对分子质量升高可进一步延缓药物的释放，获得更好的缓释效果。可以预期这些系统的一种或几种的组合来调控药物的释放速率从而满足临床的特定需求。

3　结论

本研究采用目前较先进的新一代药用撞击器考察粉雾剂体外沉积性能，发现不同壳聚糖制剂中药物在呼吸道中的沉积位置和沉积量存在显著差异。羧化壳聚糖制剂可治疗气管和支气管等局部疾病；分子量介于 200～400mPa·s间的壳聚糖制剂粒径更小可经肺泡吸收，达到全身给药治疗目的。因此，处方中添加不同分子量的辅料在药剂研究中同样需要引起重视，尤其对局部靶向给药具有指导意义。

药物在体内吸收速度常由溶解速率决定，易溶性药物也会因制剂的处方和工艺不同导致药物溶出度有很大差异，从而影响药物生物利用度和疗效。目前各国药典均未提出考察粉雾剂缓释效果的标准方法，本研究发现加入壳聚糖后药物的“突释”现象明显下降，且在较长时间内药物释放稳定，且随着壳聚糖分子量的增加，粉雾剂缓释效果逐渐提高，其缓释机理有待进一步阐明。总结所有体外数据分析可知，本方法用于吸入式药毒物在肺部分布情况的研究是可行的，具有一定的临床应用开发价值。

参考文献

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[9] Kubota N, Eguchi Y. Facile. Polym J, 1997, 29(2): p. 123-127.

^*通信作者：刘俊亭，男，教授，博士生导师，研究方向法医毒物分析，E-mail: liujunting8@163.com