利用色谱法分离制备庆大霉素类似物C-6′差向异构体JI-20Ba/JI-20B

谷雅文

（河北省分析测试研究中心）

庆大霉素是由2-DOS通过1-4和1-6糖苷键分别与绛红糖胺（purpurosamine）和加拉糖胺（garosamine）相互连接而成的，为临床中最广泛应用的氨基糖苷类抗生素。庆大霉素由棘孢小单孢菌及绛红小单孢菌发酵产生，小单孢菌在发酵过程中产生的庆大霉素主要有四个组分，分别是C1、C2和C2a、C1a。目前临床上用的庆大霉素对四个组分的比例有严格的要求，2010年版中国药典对三种组分的含量规定如下：C1 25%～50%；C1a 15%～40%；C2+C2a 20%～50%，毫克单位不低于590U/ml。

由于庆大霉素在临床应用中易产生严重的耳毒性^[1]、肾毒性^[2]以及大量的耐药菌^[3]，其临床应用受到了限制。如上所述，庆大霉素等氨基糖苷类抗生素通常以混合物的形式存在，其中每一个单体化合物称为一个组分。这可能是由于氨基糖苷类抗生素生物合成酶底物特异性较低且多有分支途径存在而造成的。这些组分化学结构相似，但通常都表现为不同的生物活性。有效组分和一些活性低的组分共同存在，对有效组分的高产和分离都有不利影响。Sandoval等人研究发现，在庆大霉素一对差向异构体C2和C2a中，C2保持与C2a一致的抑菌活性，但C2却令人惊喜的具有无肾毒性和低细胞毒性的特征^[4]。通过分析庆大霉素生物合成途径^[5]（图 1），改造生物合成基因簇^[6]，可人为定向控制合成途径代谢流生成某一组分的高产菌株^[7]或一系列庆大霉素类似物。

Gu等^[5]对棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）庆大霉素的生物合成基因簇和生物合成途径进行研究发现，当阻断genP时，基因工程菌株M. echinosporaΔgenP除有预测产物少量的JI-20A和JI-20B之外，还发现一个新产物JI-20Ba，经结构鉴定，证明JI-20Ba为JI-20B的C-6′差向异构体。

通过化学结构分析发现，JI-20Ba和JI-20B较C2a和C2相比，C3′和C4′位多出两个羟基，这两个羟基可中和部分氨基的碱性，在临床应用中理论上可降低抗生素的毒性。已知C2保持与C2a一致的抑菌活性，但C-6′-(R)构型的C2表现为无肾毒性和低细胞毒性，那么C-6′-（R）构型的JI-20B的毒性是否更低就有待研究。对JI-20B的抗菌活性及毒性等性质进行研究首先就是要分离并制备大量的JI-20B。通过薄层色谱法、高效液相色谱法和柱色谱分离等分析方法，一定条件下庆大霉素四组分几乎都可以达到基线分离。但是在相同条件下，JI-20Ba和JI-20B均无法达到基线分离。

本实验通过分析C2a/C2和JI-20Ba/JI-20B这两对差向异构体的化学结构和性质，改良薄层色谱法、高效液相色谱法以及柱色谱分离的实验条件，使JI-20Ba/JI-20B在这三种色谱方法分析中都达到了基线分离，并且通过柱色谱分离法制备大量纯度为95%的JI-20B供其抗菌活性、毒性等药理学性质的研究。

1　实验方法

1.1　仪器：

高效液相色谱仪SHIMADZU LC-10ATVP；蒸发光散射检测器 SofTA-200S；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵；EYEL4旋转蒸发仪；YKKY DX-2010低温循环机。

1.2　实验方法

1.2.1　色谱分析样品预处理

采用732型离子交换树脂对棘孢小单孢菌发酵产物进行纯化。上样流速为1/30～1/25柱体积（ml）/min，上样完成后用去离子水冲洗色谱柱至流出液无色。然后用0.4mol/L HCl，0.2mol/L HCl+0.62mol/L NH₄Cl各冲洗8个柱体积，后用去离子水洗至中性。最后用5% NH₄Cl洗脱抗生素，并串联711 H⁺型离子交换树脂柱对抗生素进行脱色处理。收集有活性的洗脱液混合，旋蒸浓缩。

1.2.2　薄层色谱法

用微量移液器吸取一定体积的经预处理的样品点样于GF₂₅₄硅胶薄层板，点样量根据发酵液总效价及各组分效价而定。薄层展开剂为一定体积比的氯仿、甲醇和氨水的混合液，混匀后静置分层，取下层用于展层。待溶剂挥发干后，将硅胶板贴在铺好检定菌的生物检定盘上吸附10min。取下硅胶板，将检定盘置于37℃培养16～18h。观察形成的抑菌圈。

1.2.3　高效液相色谱分析法

采用Welch Ultimate^R LP-C18（4.6mm×200mm，5μm）色谱柱，使用一定体积比的三氟乙酸、甲醇和水的混合液为流动相，流速为0.6ml/min。蒸发光散射检测器雾化管温度为40℃，漂移管温度为80℃，载气压力为0.35MPa。经预处理的样品和流动相在分析前均用0.22μm微孔滤膜（水系膜）过滤。

1.2.4　柱色谱分析法

将预处理后的样品用 D152NH₄⁺型离子交换树脂进行分离。上样流速为 1/30～1/25柱体积（ml）/min，然后进行梯度洗脱，并且用生物效价测定和高效液相检测的方法测定洗脱液。

2　结果与分析

2.1 JI-20Ba/JI-20B薄层色谱分离结果

薄层色谱配合生物检定的方法检测棘孢小单孢菌发酵液，可以定性分析发酵产物中活性组分的个数及各组分抗菌活性的大小。庆大霉素为棘孢小单孢菌次级代谢产物，且分泌到微生物胞外。发酵液经酸碱处理后，离心去除胞体，上清液即可用于薄层色谱分析。以庆大霉素标准品（效价为2000U）为对照品，M. echinosporaΔgenP发酵产物为样品，各取20μl点样。配置氯仿 : 甲醇 : 氨水=1 : 1 : 1混合液，震荡混匀后静置分层，取下层为展开剂，置于展缸中，将点样结束的薄层板置于展缸中没有展开剂的一侧饱和30min后将展缸倾斜使展开剂流入薄层板一侧，静置于37℃烘箱内展开5～6h，取出晾干，扣放在提前30min制作的生物检定板上10min取出，将检定板放置在37℃培养箱中过夜培养，通过抑菌圈定性分析发酵产物活性组分的活性大小和比移值。结果如图1所示。在上述展开条件下，可知M. echinosporaΔgenP产物比移值较庆大霉素四组分都小，且两个组分JI-20Ba和JI-20B无法分离，JI-20A由于产量较小，实验条件下无法形成抑菌圈（图1）。

由结果可知，要使两者分离首先可考虑增加展开剂极性，经过多次尝试，最终在展开剂为氯仿 : 甲醇 : 氨水=5 : 7 : 6时，两者可达到基线分离（相同条件下，庆大霉素标准品已跑出薄层板）（图2）。

2.2 JI-20Ba/JI-20B高效液相色谱分离结果

高效液相色谱法为定性定量分析庆大霉素组分的重要手段，由于庆大霉素各组分无紫外吸收，因此采用蒸发光散射检测器对组分进行检测。传统的分析庆大霉素四组分的流动相条件为0.2mol/L三氟乙酸 : 甲醇=93 : 7，在此条件下，JI-20Ba和JI-20B无法分离（图3）。通过增加流动相极性，延长JI-20Ba/JI-20B保留时间，有可能使两者分离。最终当流动相条件为0.2mol/L三氟乙酸 : 甲醇=97 : 3时，两者达到基线分离（图4）。

2.3 JI-20Ba/JI-20B柱色谱分离结果

将按照1.2.1样品预处理纯化后的庆大霉素类似物用D152型离子交换树脂进行分离。分离庆大霉素各组分的常用柱层析条件为上样流速为0.6ml/min，ddH₂O冲洗5个柱体积，用0.01～2mol/L氨水进行梯度洗脱。上述条件无法分离JI-20Ba和JI-20B。经改良后的条件为上样流速为1/30～1/25柱体积（ml）/min，ddH₂O冲洗5个柱体积，然后用0.01～2mol/L NH₄Cl进行梯度洗脱。该方法可较好地分离JI-20Ba和JI-20B，JI-20B的回收率为71%，纯度为95%。

3　结论

JI-20Ba和JI-20B分离的难点在于两者是结构相同，仅6'端基碳构型不同的差向异构体，且化合物极性较大，在色谱分析方法中保留时间较短。针对化合物的这些性质，通过改变色谱条件，延长样品保留时间，从而将两者在色谱分析中的差异性扩大，最终在薄层色谱、高效液相色谱分析中两者都达到基线分离。并且通过柱色谱分离法可制备纯度为95%的JI-20B，对后续进行JI-20B的药理性质研究提供条件。

色谱法为化合物分离鉴定及制备的重要方法，通过深入的了解待分析样品的性质及每种色谱法的分析原理，灵活应用分析方法和条件，甚至多种分析方法联合应用，就能达到对不易分离的样品进行分离分析的目的。

参考文献

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[2] Streetman D S, Nafziger A N, Destache C J, et al. Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 2001, 21(4): 443-451.

[3] Mingeot-Leclercq M P, Glupczynski Y, Tulkens P M. Antimicr Agents and Chemotherapy, 1999, 43(4): 727-737.

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[7] Li D, Li H, Ni X, et al. Microbiol Res, 2013, 168(5): 263-267.