分散液相微萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中的苯并咪唑类农药残留

韩丹丹^*1，闫宏远¹，唐保坤²，郭玉洁¹，徐泽华¹

（1．河北大学预防医学与卫生事业管理系；2．河北大学药学院，保定 071002）

苯并咪唑类农药是一种高效、低毒、内吸性广谱杀菌剂，主要包括多菌灵、噻菌灵、硫菌灵等，该类农药是水果、蔬菜的生产、贮藏、运输及保鲜过程中最重要的杀菌剂，可防治水果蔬菜的多种病虫害。但是由于多菌灵、噻菌灵、硫菌灵在蔬菜上残留期比较长，对人体健康产生危害^[1-2]。国内外对植物源性食品中苯并咪唑类农药的最大残留限量（MRLs）作了规定，最低残留限量为0.5mg/kg。因此建立高效、快速的检测蔬菜中的苯并咪唑类农药残留具有重要的意义。

由于蔬菜样品组成复杂，而且目标分析物在样品中含量通常较低，因此，对样品进行预富集萃取非常必要。分散液相微萃取是一种新型样品前处理技术，它克服了传统萃取的诸多不足，具有无溶剂化、快速、高效等优点，在很多领域得到了广泛应用^[3-4]。本课题以西红柿、黄瓜中的多菌灵、噻菌灵、硫菌灵为研究对象，建立了基于分散液相微萃取的样品前处理技术，并与高效液相色谱技术联用，为苯并咪唑类农药检测提供高灵敏度的检测方法。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；pHS-4型智能酸度计（美国奥豪斯公司）；电子分析天平（美国奥豪斯公司）；离心机（上海手术器械厂）；超声萃取仪（宁波新芝）；氮吹仪（杭州奥盛）。多菌灵、噻菌灵、硫菌灵标准品（国家标准物质研究中心），均为分析纯；氯仿、乙腈、甲醇（安赛生物科技），均为色谱纯；实验用水为去离子水。

1.2　实验方法

1.2.1　液相色谱分离条件

流动相：甲醇-水（70 : 30，体积比），流速为1.0ml/min；检测波长280nm；C18色谱柱（日本岛津，4.6mm×250mm, 5μm）。

1.2.2　分散液相微萃取方法

取1.0ml的标准混合液（0.01mol/ml的多菌灵、噻菌灵、硫菌灵）于10ml玻璃离心管中，用pH=4.0的水定容到10ml。加入750μl的乙腈，混匀1min，再加入750μl的氯仿，边振荡边混匀5min。以3000r/min离心3min，弃去上层水相，用氮吹仪吹干有机相后，加入500μl甲醇，混匀5min，使残渣充分溶解，以3000r/min离心3min，使杂质沉淀。取10μl萃取液直接进样，采用高效液相色谱法测定多菌灵、噻菌灵、硫菌灵的含量。

2　结果与讨论

2.1　萃取条件的优化

2.1.1　萃取剂的选择

萃取剂的选择对萃取效率以及富集倍数起着重要的作用，萃取剂一般要具备以下特征：① 密度比水大；② 对待测物有较好的萃取效果；③ 水中溶解度小；④ 能形成稳定的两相系统。本实验选择比水密度大的氯仿作为萃取剂，操作简便，萃取剂用量少，萃取效果较好，满足同时分离蔬菜中多种农药残留的要求。

2.1.2　萃取剂用量对萃取效率的影响

考察了不同体积的氯仿对萃取效率的影响。结果如图1所示，随着萃取剂用量的增加，萃取效率逐渐提高，当萃取剂用量达到750μl时，萃取效率达到最高，超过750μl时，对萃取效率影响不大。因此选择最佳萃取剂用量为750μl。

2.1.3　不同分散剂对萃取效率的影响

分散剂是液相微萃取技术的重要影响因素。分散剂的作用是使萃取剂和水样溶液的接触面积最大化，从而使萃取效率最大化。实验发现无分散剂加入时，萃取剂的萃取效率较低，已有研究选用乙腈、甲醇作为分散剂对其分散效果进行了考察。结果如图2所示，采用乙腈作为分散剂时药物的富集倍数都较高。

2.1.4　分散剂用量对萃取效率的影响

考察了乙腈用量对萃取效率的影响。分散剂体积小时很难使萃取剂在水相中形成均一的乳浊液从而影响萃取效率，而较大体积的分散剂则会影响有机相在水中的溶解性。因此，选择合适体积的分散剂至关重要。结果如图3所示，随着分散剂用量的增加，萃取效率提高，当分散剂用量为750μl时，萃取效率达最高值。因此，本实验选择分散剂用量为750μl。

2.2　标准曲线和方法检出限

配制不同浓度的苯并咪唑类农药标准溶液测定峰面积，以溶液的峰面积为纵坐标，以苯并咪唑类农药的浓度为横坐标，对多菌灵、噻菌灵、硫菌灵标准溶液绘制标准曲线，线性回归方程分别为Y=4×10⁷X−79943，R=0.9986；Y=4×10⁷X−88127，R=0.9999；Y=3×10⁷X−13389，R=0.9999，其中，Y代表峰面积，X代表标准溶液浓度，R代表线性回归系数。线性范围为0.005～0.1mg/ml。

对0.001mg/ml的标准溶液依次稀释2倍，配成不同浓度的标准溶液，对不同浓度试液进行测定，直至信噪比（S/N=3），将此时的峰面积代入标准曲线得到方法的检出限，多菌灵与噻菌灵的检出限为31.25ng/ml，硫菌灵的检出限为62.50ng/ml。

2.3　样品分析

称取一定量的西红柿和黄瓜样品，榨汁后，减压抽滤得澄清的西红柿汁和黄瓜汁，滤液备用。分别移取1.0ml的西红柿和黄瓜汁于10ml玻璃离心管中，按照1.2.1步骤进行分散液相微萃取，测定西红柿和黄瓜样品中的苯并咪唑类农药残留含量，并对其进行加标回收率实验，结果如表 1所示。在西红柿中检测出1.42μg/ml的多菌灵，黄瓜中检测出1.76μg/ml的多菌灵、1.20μg/ml的噻菌灵、0.78μg/ml的硫菌灵。样品的加标回收率为38%～58.0%，RSD小于5.2%。

3　结论

液相微萃取技术测定蔬菜中的痕量苯并咪唑类农药，萃取效率较高，萃取剂用量少，准确度高、精密度好，分散液相微萃取技术由于萃取剂和分散剂瞬间与样品充分接触，导致其萃取时间比液相微萃取的其他模式更短。通常只需加入微量的萃取剂，使得目标分析物的富集倍数更高，将其与高效液相色谱分析技术相结合，可用于蔬菜中多种农药的痕量分析检测。

参考文献

[1] 刘乾开, 朱国念. 新编农药使用手册. 第2版. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 309.

[2] 吴丽明, 黄伯俊. 职业医学, 1992, 19(1): 11-12.

[3] Huang P, Zhao P, Dai X, et al. J Chromatogr B, 2016, 1011:136-144.

[4] Amoli-Diva M, Taherimaslak Z, Allahyari M, et al. Talanta, 2015, 134: 98-104.

基金项目：河北省自然基金资助项目（B2014201089）和河北省留学人员科技活动项目择优资助（C201400301）

通信作者：韩丹丹，女，Tel：0312-5079010，E-mail：hdd117@126.com