CM-β-CD手性分离非天然氨基酸的研究

田宝娟^*，杨晓丹，李保会

（华北电力大学环境科学与工程学院，保定 071003）

手性物质是互成镜像，从物质的空间结构上看，对映体之间虽然不能重叠，但分子的组成是相同的^[1-2]。手性化合物的存在是自然界的普遍现象，其应用在药物化学领域尤为突出。大多数的氨基酸含有手性中心，存在生理活性不同的D型和L型两种对映异构体^[3-5]。一种手性化合物两个对映体在药理学性质上有重大差异，可能具有不同的药理毒理作用。早在1992年，美国食品与药物管理局就发布了手性药物指导原则，要求在新药的使用说明中必须明确量化各种对映异构体的药理活性和毒性反应^[6]。因此手性对映体的分离分析就变成为一项非常重要的工作。目前，常用的手性选择剂包括环糊精、手性冠醚、蛋白质、手性表面活性剂等^[7-8]。针对药物对映体的分离模式有色谱法、酶分离法、化学法等^[9-11]。色谱法是一种具有良好分离性能的方法，包括高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法（CE）等^[12-14]。CE分离手性对映体是基于在缓冲液中加入手性试剂，依据药物对映体与手性试剂之间络合常数的不同，致使电泳淌度差异放大而实现分离^[15-17]。环糊精与其衍生物由于具有良好的拆分效果，而成为常用的手性选择剂^[18]。

本文主要以CE为研究手段，对三种非天然羧酸类氨基酸包括非天然羧酸类氨基酸包括4-(N-甲基)甲胺-对氟-苯乙酸(±)、4-(N-甲基)甲胺-对甲基-苯乙酸(±)、4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)的手性分离进行研究。通过改变影响分离条件的因素包括pH、CM-β-CD浓度优化分离条件，进而对样品进行分离。

1　实验部分

1.1　仪器与设备

TH-2000系列毛细管电泳仪（保定市高新区天惠分离科学研究所）；ACCULAB分析天平（珠海天创仪器有限公司）；PHS-3C型酸度计（上海康仪仪器厂）；SK3200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DRAGON移液枪（大龙医疗设备有限公司，上海）；50μm×60cm未涂层熔硅弹性石英毛细管柱（河北省永年锐沣色谱器件有限公司）。

1.2　药品与试剂

4-(N-甲基)甲胺-对氟-苯乙酸(±)（中国科学院化学研究所）、4-(N-甲基)甲胺-对甲基-苯乙酸(±)（中国科学院化学研究所）、4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)（中国科学院化学研究所）、氢氧化钠（天津市华东试剂厂），标准缓冲溶液（天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司），超纯水（实验室自制)。β-CD（上海化学试剂有限公司），CM-β-CD（百灵威化学技术有限公司）。

1.3　实验步骤

实验前先对毛细管进行清洗，首先用甲醇溶液冲洗3min，缓冲溶液冲洗10min，高纯水冲洗5min，1.0mol/L氢氧化钠冲洗3min，再用缓冲溶液冲洗2min；每次进样前用1.0mol/L氢氧化钠冲洗3min，再用缓冲溶液冲洗2min。样品溶液是在18kV的分离电压下进行分离的。

2　结果与讨论

2.1　手性试剂对样品分离的影响

本次实验首先考察了Me-β-CD、β-CD及CM-β-CD在3种非天然羧酸类样品分离中的选择性。实验结果表明，β-CD和Me-β-CD对于实验中用到的3种非天然羧酸没有任何选择性。然而CM-β-CD对3种样品表现出了良好的选择性。另外，只要在缓冲溶液中加入极少量的CM-β-CD即可促使3种样品发生明显的分离现象。因此本次实验选择了CM-β-CD作为手性分离试剂。

2.2　苯乙羧酸的紫外吸收曲线图

为了确定样品的最佳吸收波长，本次实验用高纯水配制样品待测溶液，用高纯水做对照试剂做出样品的紫外吸收谱图。图1和图2分别是2种样品的紫外吸收曲线图。图1中，曲线1和曲线2是超纯水和10mmol/L NaH₂PO₄的紫外吸收曲线，曲线3-8是100μg/ml 4-(N-甲基)甲胺-对甲基-苯乙酸在4.0ml 10mmol/L NaH₂PO₄及不同体积CM-β-CD (10mmol/L)组成的缓冲溶液中的紫外吸收曲线图。图2是相同条件下100μg/ml 4-(N-甲基)甲胺-对氟-苯乙酸(±)的紫外吸收曲线图。从图1和图2可以看出，随着缓冲溶液中CM-β-CD的体积不断增加，两种样品的吸收曲线明显地变化。

在样品溶液中逐次增加CM-β-CD的用量时，吸光度逐渐增大，样品可以与缓冲溶液中的CM-β-CD络合，则可以选择CM-β-CD作为手性拆分试剂；随着紫外光波长增大，样品吸光度降低。但当波长小于200nm时，无法保证样品正常出峰，故本次实验波长确定为214nm。

2.3　缓冲溶液pH对分离度的影响

从图3可以看出，随着缓冲溶液pH值从3.5变化到4.5时，4-(N-甲基)甲胺-对甲基-苯乙酸(±)和4-(N-甲基)甲胺-对氟-苯乙酸(±)的分离度也随之增加且分别在pH值为4.5时达到最大，而4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)此时的分离度为0，随着缓冲溶液pH值增加到7.5时，前两种样品的分离度逐渐降低。而4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)的分离度却随着pH值的增大而不断增大，在pH值为6.5时分离度达到最大。随后其分离度也随着pH值的增大而减小。因此后续实验将在缓冲溶液pH值为4.5及6.5处进行。

2.4 CM-β-CD浓度对分离度的影响

从图5可以看出，当从1.0mmol/L增加到10.0mmol/L时，4-(N-甲基)甲胺-对甲基-苯乙酸(±)和4-(N-甲基)甲胺-对氟-苯乙酸(±)的分离度随之增加且在10mmol/L时分离度达到最大；而当CM-β-CD的浓度继续增加至20mmol/L时，两者的分离度没有明显变化。4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)分离度与CM-β-CD浓度的关系与前两者类似，但其最适CM-β-CD为5mmol/L。而且从图4中4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)在不同CM-β-CD浓度下的电泳谱图中可以看出4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)在5mmol/L时，其分离现象最明显。

2.5　在最优化条件下的电泳谱图

3　结论

利用CE对手性药物进行拆分，与经典电泳相比，它克服了由于焦耳热引起的谱带宽，柱效较低的缺点，确保引入高的电场强度，改善分离质量，具有分离效率高、速度快和灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低的优点^[19-22]。实验表明，缓冲溶液pH及手性分离剂CM-β-CD的浓度会显著影响样品分离效果。通过选择合适的pH值及适当浓度的CM-β-CD即可实现非天然羧酸的分离。通过不断的优化实验操作条件，CE可以有效地对手性化合物进行拆分，实验分离效果明显。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金项目（21275053）

通信作者：田宝娟，女，副教授，Tel:13933267585, E-mail: tbj2001@163.com