中压制备色谱法分离纯化亚麻木酚素

林楠^1,2，王尉^1,2，张经华¹，高峡^1,2*

（1．北京市理化分析测试中心，北京 100094；
2．有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京 100094）

植物木酚素（或称木脂素）是苯丙素类物质代谢产生的天然产物，具有C6-C4-C6的基本骨架^[1]。其种类较多，油料作物和谷类食物是木酚素的重要来源^[2]，尤以亚麻籽和芝麻最为重要。亚麻籽中木酚素为开环异落叶松树脂素（SECO），主要以开环异落叶松脂素二葡萄糖苷（SDG）结构的形式存在。SDG分子式为C₃₂H₄₆O₁₆，能溶于水、甲醇、含水乙醇和丙酮^[3]。SDG在哺乳动物肠道内，经过肠道菌群的作用代谢产生动物木酚素，能与体内的雌激素受体相结合，表现为雌激素活性和抗刺激素活性。研究表明亚麻木酚素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗骨质疏松、降低血清胆固醇、增强自身免疫力、延缓衰老、保护心血管、抑制芳香酶活性，尤其在抑制人体乳腺癌细胞生长、减轻妇女绝经期症状、预防结肠癌和前列腺癌等方面有良好的效果^[4-6]。

通常使用的快速中压制备色谱是由中压恒流泵、检测器、六通阀、馏分收集器等组成的。中压制备色谱具备柱效高和分离速度快等特点^[7]，目前快速中压制备色谱已越来越广泛用于中药和天然产物的提取。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

岛津LC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；博纳艾杰尔CHEETAH MP 200中压制备柱层析系统（天津博纳艾杰尔科技公司）；CR22GIII型高速离心机（日本日立公司）发仪（上海爱朗仪器有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Integral纯水/超纯水一体化系统（密理博中国有限公司）；BS224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；1000μl微量可调移液器（Eppendorf）。

甲醇，分析纯，北京化工厂；甲醇，色谱纯，美国Fisher scientific公司；超纯水，实验室自制。亚麻木酚素对照品（HPLC＞98%），中国食品药品检定研究院；亚麻木酚素提取物（SDG含量约为50 %），湖南三为生物科技有限公司。

1.2　亚麻木酚素样品及对照品的HPLC测定方法

色谱条件：色谱柱 Inertsil ODS-SP C18（5μm, 150mm×4.6mm），0到20min内，乙腈-1%磷酸的浓度由0.1 : 0.9升至0.43 : 0.57梯度洗脱，流速1ml/min，柱温30℃，检测波长280nm，分析时间20min。

对照品配置：称取5mg亚麻木酚素对照品，以2ml超纯水溶解样品后，过0.45μm聚醚砜滤膜后放入2ml高效液相色谱仪专用样品瓶中，以待测定。

样品提取：称取20g亚麻木酚素提取物样品，以100ml超纯水溶解该样品后置于超声波中提取30min，提取2次，将提取液合并后以5000r/min进行离心10min，得到亚麻木酚素提取物的水提液，取1ml过0.45μm膜后待测备用。根据峰面积归一化法，确定样品水提液的纯度。

1.3　亚麻木酚素的中压制备色谱分离纯化方法

博纳艾杰尔CHEETAH MP200系列中压制备色谱系统。色谱柱：12g ODS FLASH柱，0→40min，甲醇-水[(10 : 90)→(30 : 70)]梯度洗脱；40→50min，甲醇-水[(30 : 70)→(40 : 60)]梯度洗脱；50→60min，甲醇-水(40 : 60)等度洗脱。将1.2所述的亚麻木酚素提取水提液旋转蒸发去除溶剂后，称取100mg，以5ml流动相溶解样品，用注射器将样品注入FLASH柱前端进行分离。

2　结果

2.1　亚麻木酚素在样品水溶液中的纯度测定

根据1.2所述的亚麻木酚素的HPLC测定方法对亚麻木酚素对照品和亚麻木酚素提取物的水溶液进行测定如图1所示。采用峰面积归一化法进行确定对亚麻木酚素提取物的水溶液纯度进行测定，结果显示其纯度为78.47%。

2.2　中压制备色谱法对亚麻木酚素提取物水溶液成分进行分离纯化

将样品经过1.3所述方法处理后对其进行分离纯化，如图2（a）所示，收集46～52min馏分，去除溶剂，用超纯水溶解样品后过0.45μm膜后，进行高效液相色谱测定，以峰面积归一化法对其进行纯度计算，如图2（b）所示，测得纯化后样品纯度为99.89%。

3　讨论

中压制备色谱技术用于天然产物及中药有效成分提取，通过适宜的前处理和优化条件可以达到较好的分离纯化效果。本研究利用反相中压制备液相色谱技术分离纯化亚麻木酚素提取物，将纯度为78.47%的亚麻木酚素样品提高至99.89%，具有较好的分离效果，且分离速度快、消耗有机溶剂少，为亚麻木酚素分离纯化的研究提供了技术依据。

参考文献

[1] 张文斌. 无锡: 江南大学, 2007: 4-5.

[2] 崔宝玉, 刘玉, 阚侃, 等. 食品研究与开发, 2010, 31(7): 181-184.

[3] 房娜. 济南: 山东师范大学, 2013: 2-6.

[4] 杨宏志, 李静. 食品科学, 2011, 32(3): 27-29.

[5] 徐海娥, 陈新霞, 顾呈华, 等. 中国卫生检验杂志, 2008: 18(3): 475-477.

[6] 葛晓静, 邓天, 侯相林. 食品与发酵工业, 2009, 35(7): 174-178.

[7] 李雪莹, 武永刚. 安徽农业科学, 2012, 40(15): 8477-8479.

^*通信作者：高峡，女，研究员，E-mail: gaoxia@iccas.ac.cn