葡萄酒中单萜烯类物质GC检测方法的建立与应用

周立华¹，牟德华¹，李艳^1,2*

（1．河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018；2．河北省发酵工程技术研究中心，石家庄，050018）

在自然界中单萜烯类物质存在极为广泛，具有特殊的香气。萜烯类化合物是酿酒葡萄中重要的香气成分，主要包括单萜烯类、倍半萜烯类以及二萜烯类化合物等^[1]。葡萄酒中的香气成分主要以游离态和结合态香气前体物质的形式存在，结合态物质本身没有香气，必须经过分解释放才能产生香气^[2]。通常葡萄浆果中以葡萄糖苷键形式存在的结合态香气物质的含量比游离态的呈香物质要丰富^[3]，研究表明，结合态萜烯类香气糖苷物质是葡萄酒活性香气成分的预备库，比它们对应的游离态配基多几倍，甚至几十倍^[4]。β-葡萄糖苷酶对葡萄中与糖苷结合的单萜类物质进行水解，从而释放糖苷及单萜增加葡萄酒的香气^[5-7]，进而增加葡萄酒的香气物质含量，提高葡萄酒的感官品质。本研究就是建立一种检测葡萄酒中存在的13种单萜烯类物质的GC检测方法，并对分别经过自选高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母和商品菌SC酵母发酵的2个葡萄品种的葡萄酒中的单萜烯进行了检测，比较两种酵母在对葡萄酒香气的影响效果，验证自选高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母在对葡萄酒增香方面的积极作用。

1　实验部分

1.1　材料和试剂

美乐和赤霞珠酿酒葡萄，2015年采摘于河北沙城产区和昌黎产区，2个品种4个批次；葡萄酒，采用传统工艺酿造于实验室^[8]；二氯甲烷，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；HE果胶酶，为法国LAFFORT公司生产；SC酿酒酵母和偏重亚硫酸钾，意大利Esseco公司生产。

菌株：本实验室于2008年、2009年和2010年分别从河北省沙城葡萄酒产区的葡萄园土壤、葡萄酒厂设备表面、接触过葡萄酒厂设备的葡萄汁和自然发酵过程中采集菌源样品，经过分离纯化，共筛选出1358株酵母菌，后经过5.8S-ITS 区域RFLP 方法鉴定出270株酿酒酵母，再利用 Interdelta PCR 指纹图谱法将酿酒酵母区分为16大类^[9]，后又经过高产β-D-葡萄糖苷酶酿酒酵母菌株筛选^[10]，最终得到此酿酒酵母，本实验室自己命名为亚种16。

1.2　仪器与设备

GC 7820A配有FID检测器，美国安捷伦公司；RE52CS-1旋转蒸发仪，天津亚荣生化仪器厂；DC-12氮吹仪（上海安谱科技仪器有限公司）。

1.3　单萜烯物质标准曲线的建立

以二氯甲烷为溶剂配制浓度分别为α-蒎烯464mg/L、β-蒎烯828mg/L、月桂烯778mg/L、D(+)-樟脑634mg/L、芳樟醇858mg/L、L-薄荷醇748mg/L、α-萜品醇494mg/L、右旋香芹酮558mg/L、香茅醇494mg/L、橙花醇496mg/L、(Z)-香叶基丙酮319mg/L、香叶醇354mg/L和(E)-香叶基丙酮478mg/L的标准混标原液，然后分别稀释1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍和1000倍，利用这7个梯度稀释后的溶液建立标准曲线，进行GC-FID分析。以单萜烯物质峰面积作为纵坐标，物质浓度作为横坐标，使用Origin 8.0完成线性回归。

1.4　单萜烯物质的萃取^[11]

分别取葡萄果汁和葡萄酒50ml，倒入250ml的分液漏斗中，加入等体积二氯甲烷萃取24h，萃取过程中反复振荡达到充分混合，静置分层后分离萃取液和萃余液，萃取液倒入圆底烧瓶中，封口待用。萃余液再分别加入30ml溶剂进行第2次和第3次萃取，均萃取24h。将3次萃取液合并，用旋转蒸发仪浓缩至3ml左右，转入5ml试管，再用2ml溶剂洗涤圆底烧瓶，洗液一并倒入试管中，氮吹至1ml以下，溶剂定容至1ml，用0.45μm膜过滤，滤液用于香气物质检测，次样品为浓缩50倍。每个样品做3个平行。

1.5 GC分析条件

Agilent 7820A GC-FID，色谱柱为HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为氮气，流速1ml/min；升温程序：初始温度为50℃，保持10min；以3℃/min升温至140℃，保持10min；以5℃/min升温至200℃，保持1min；然后以10℃/min升至250℃，保持1min。

检测器（FID）温度280℃；进样口温度250℃；尾吹25ml/min；氢气流量40ml/min，空气流量400ml/min；1μl样品不分流进样。

2　结果与分析

2.1　单萜烯物质标准曲线

以香气物质峰面积作为纵坐标，香气物质浓度作为横坐标，使用Origin 8.0完成线性回归，得到GC-FID分析结果的线性关系（见表1），13种单萜烯类物质的标准品GC色谱图如图1所示。

由图1可以看出，13种标准品的分离度都大于1.5，符合分离检测的标准，说明检测的方法适合对这13种单萜烯类物质进行检测。

由表1可以看出，13种单萜烯物质的标准曲线的R²在0.9967～0.9993之间，说明线性关系较好，标准方程可以用于物质的定量。

方法的检出限一般为基线噪声3倍的该物质浓度，在试验中可以反映对待测目标物质的灵敏性，测得的检出限越小，说明仪器方法对所要测得的物质灵敏性比较高，所建方法对目标物质比较适合。表1中的各物质的检出限在0.58～1.073mg/L之间，相对较小，可以满足对各种物质的检测要求，说明所建方法对单萜烯类物质的灵敏性满足要求，适合对目标物质的检测。方法的重复性可以用目标物质的相对标准偏差（RSD）来表示，RSD值越小说明重复性比较好，本研究中的RSD都在0.58%～3.18%范围内，都小于5%，说明了方法的重复性较好。回收率用来评价测定方法的准确度，一般测定方法为向已知物质浓度的样品中加入纯目标物质，利用仪器测定浓度，然后进行分析。回收率计算公式为公式（1）^[12]。

　　（1）

表1中每种物质的回收率都是6种样品的回收率，所以综合为一个范围，13种物质的回收率都在89.98%～107.34%，说明该方法在物质的定性与定量上较为准确，比较适合对单萜烯类物质的检测。从对所建方法的R²、检出限、RSD和回收率的检测与分析可以看出，所建方法适合对样品中单萜烯类物质的检测。

2.2　葡萄汁和葡萄酒中单萜烯类物质的检测

本研究使用液液萃取的方法来获得单萜烯类物质，结合GC-FID进行检测，通过色谱图上的保留时间与标准品色谱图的比较，最终对物质进行定性定量。待测样品分别包括沙城产区和昌黎产区的美乐葡萄、赤霞珠葡萄、经过SC酿酒酵母发酵过的2种葡萄的干红葡萄酒和经过自选高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母发酵过的2种葡萄的干红葡萄酒，共12个样品，每个做3个平行，定量去3次测定结果的平均值，物质含量按公式（2）计算。

　　（2）

萜烯及C13-降异戊二烯类物质对葡萄酒品种香气形成起到了决定关键的作用，这类物质通常都具有浓郁的香气和较低的感官阈值^[13]，这些物质是酿酒葡萄原料中潜在的非常重要的香气成分，对葡萄酒品质起着举足轻重的作用。由表2和图2可以看出，沙城和昌黎产区的美乐葡萄汁、赤霞珠葡萄汁、经过SC酵母发酵后的美乐和赤霞珠干红葡萄酒、经自选高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母亚种16发酵后的美乐和赤霞珠干红葡萄酒中各检测到6、7、8、9、10、11、4、7、7、7、10和11种单萜烯类物质，经过酵母发酵后葡萄酒中的单萜烯种类和总含量都有明显的增加，葡萄经过发酵后，由于发酵作用使葡萄酒中的单萜烯类物质总含量普遍存在升高的趋势，且经自选高产β-葡萄糖苷酶酵母发酵后的葡萄酒中单萜烯类物质的种类数目和含量都要高于经商品菌SC酵母发酵后的葡萄酒。经过自选菌发酵后的赤霞珠干红葡萄酒中的单萜烯类物质含量在葡萄汁的基础上总含量的增加量最高，最高达到了308.88%，最低也达到了181.83%，而经过SC发酵后的酒中含量增加最高为90.80%，从增加量上来说高产β-葡萄糖苷酶的自选菌在增香上要优于商品菌，具有很好的增香效果。从总体来看，亚种16在提高单萜烯总含量作用上，对赤霞珠干红酒的作用要好于对美乐葡萄酒的改善作用。

2.2.1　自选菌对沙城产区葡萄酒中单萜烯含量的影响

沙城产区美乐葡萄经过2种酵母的发酵作用后，单萜烯类物质的含量和种类数都呈现了增加的趋势，葡萄汁中的总含量为0.502mg/L，经过SC酵母发酵后增长为0.959mg/L，而经过自选酵母亚种16发酵后含量上升为1.416mg/L。芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇和香叶醇在葡萄汁和葡萄酒中都被检测到，含量有明显的增加，尤其芳樟醇的含量在亚种16发酵后的葡萄酒中的含量为0.391mg/L，说明了这些物质在葡萄中天然存在一部分游离态，同时也存在结合态，这些结合态物质经过酵母的发酵作用而水解出游离态，导致含量增加；月桂烯和(Z)-香叶基丙酮只在经过亚种16发酵后的葡萄酒中被检出，说明自选菌发酵过程中释放的酶可以水解月桂烯和(Z)-香叶基丙酮结合态物质释放单体，这两种物质是典型的油脂香型物质。

沙城产区赤霞珠及赤霞珠葡萄酒中单萜烯物质含量要明显高于美乐品种，葡萄汁中总含量为0.75mg/L，经过对照菌株发酵后总含量上升为1.142mg/L，而经过亚种16发酵后总含量达到最高为2.454mg/L，在果汁的基础上提高了227.05%。2-莰酮、芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇和香叶醇是葡萄汁和葡萄酒中都具有的，在葡萄汁中芳樟醇的含量最高为0.206mg/L，经过亚种16发酵后含量增加了198%，达到了0.614mg/L，成为沙城产区赤霞珠葡萄酒中含量最高的单萜烯物质，使葡萄酒呈现了浓郁的玫瑰花香和果香^[14]；L-薄荷醇、右旋香芹酮和(E)-香叶基丙酮仅在亚种16发酵葡萄酒中被检出，说明自选菌在发酵过程中所产生的β-葡萄糖苷酶可以水解这三种物质的结合态，从而释放游离态单体物质，而SC酵母则不具备对其的水解作用；此外，α-蒎烯、2-莰酮在两种发酵酒中都被检测到，而在葡萄汁中则未被检出，说明这两种物质是发酵的产物，从含量上来说，亚种16发酵酒中含量要高于商品菌SC。

沙城产区的美乐葡萄和赤霞珠葡萄经过两种酵母的发酵作用后，单萜烯类物质含量都有所增加，以自选菌亚种16为发酵菌的葡萄酒中的含量显著增加，尤其赤霞珠干红酒的含量从葡萄汁中的0.75mg/L增加为葡萄酒中的2.454mg/L，而且种类从6种增加到了11种。通过试验分析可知，自选高产β-葡萄糖苷酶酵母菌亚种16在对沙城产区的美乐和赤霞珠葡萄酒增香作用上要优于对照菌SC酵母菌。

2.2.2　自选菌对昌黎产区葡萄酒中单萜烯含量的影响

昌黎美乐葡萄及葡萄酒中总共包含了10种单萜烯物质，有4种为3个样品所共有，分别为芳樟醇、香茅醇、橙花醇和香叶醇，其中芳樟醇在样品中含量最高，在亚种16发酵酒中含量最高为0.645mg/L，是葡萄汁中含量的3.12倍，除此之外，香叶醇从葡萄汁经过SC酵母发酵后含量没有增加，相对的经过亚种16发酵后含量大量增加，从0.093mg/L增加到0.207mg/L，增加了122.58%；月桂烯、L-薄荷醇和(Z)-香叶基丙酮仅在亚种16的发酵酒中被检测到，总含量为0.074mg/L，这些物质是分别具有香脂香气、薄荷香气和香叶气息^[15]；另外，α-蒎烯、2-莰酮和α-萜品醇是经过酵母发酵后产生，α-蒎烯的含量在SC发酵酒中的含量和亚种16发酵酒中的含量相差不大，说明该物质在昌黎美乐葡萄中的存在形式不是以β-葡萄糖苷酶的水解形式存在的，不会因为β-葡萄糖苷酶的存在而急剧的增加，2-莰酮和α-萜品醇的含量经过亚种16发酵后增加，尤其α-萜品醇SC发酵酒中的含量为0.077mg/L，而经过亚种16发酵后含量急剧增加到了0.318mg/L，这说明β-葡萄糖苷酶可以促进α-萜品醇由结合态水解为游离态。

由图2可以看出，昌黎产区赤霞珠经过亚种16发酵后单萜烯的含量增加最多，从葡萄汁中的0.698mg/L增加到葡萄酒中的2.855mg/L，增加308.88%，而对照菌株SC酵母的发酵酒中的单萜烯物质含量在葡萄汁的基础上仅仅增加了58.09%，变化不大。与其他实验组相似，芳樟醇无论在葡萄汁还是葡萄酒中单萜烯的含量都是最高，在经过亚种16 发酵后的葡萄酒中的含量高达0.825mg/L，是葡萄汁中含量的3.29倍，由于其阈值为25μg/L^[16]，所以芳樟醇对昌黎赤霞珠亚种16发酵酒风味香气影响较大，使酒体花香比较突出。此外，香茅醇、α-萜品醇和香叶醇在亚种16发酵酒中的含量也较高，仅次于芳樟醇，分别达到了0.617mg/L、0.367mg/L和0.305mg/L，分别是葡萄汁中含量的6.86、11.12和2.40倍，这三种物质使亚种16发酵酒具有花香、果香和青叶油香。α-蒎烯、月桂烯、L-薄荷醇、右旋香芹酮和(E)-香叶基丙酮仅仅存在于亚种16发酵酒中，在果汁和SC发酵酒中未被检测到，说明这些物质是经过亚种16在发酵过程中释放的物质水解相对应的结合态物质而最终释放出；2-莰酮和橙花醇同时存在于葡萄汁和葡萄酒中，含量经过发酵后全部升高，尤其在亚种16中的含量增加明显。

3　结论

本研究建立了一种同时检测葡萄汁和葡萄酒中13种单萜烯类物质的方法，先以有机溶剂二氯甲烷进行液液萃取，然后旋转蒸发、氮吹浓缩，再结合气相色谱（GC）检测技术，对两个产区的两个葡萄品的葡萄汁和经不同菌种发酵后的共12个样品进行了检测，结果显示：高产β-葡萄糖苷酶的自选酿酒酵母在葡萄酒增香上相对于商品菌SC酵母具有明显的优势，对酒中单萜烯类物质含量增加幅度较大，极大地促进了葡萄中结合态的单萜烯前体物质水解成为游离态的单萜烯物质，并且数据显示赤霞珠干红酒中的单萜烯含量要高于美乐葡萄酒。此外，由实验结果可以看出，本研究所建对葡萄酒中13种单萜烯的检测方法具有简单、灵敏性高、重复性好等优点，可以对葡萄及葡萄酒中的单萜烯物质进行定性定量的检测。

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^*通信作者：李艳，女，教授，研究方向：传统发酵工程创新技术研究、葡萄酒和果酒酿造。