二、材料表面拓扑形貌对细胞行为和组织再生的影响以及可能的生物学机制

众所周知，细胞对拓扑形貌十分敏感，材料表面微纳米结构能够影响细胞的行为并进一步影响组织再生。早期的研究主要集中在表面微米图案对细胞的“接触引导”，而最近的研究则更专注于揭示微纳米形貌对细胞命运的影响（特别是干细胞），以及这个过程中细胞和材料是如何相互作用的。但无论对于何种基质材料，细胞黏附显然都是细胞与拓扑形貌相互作用的第一步。因此，本章将重点讨论以下两个问题：①不同的拓扑形貌会对细胞行为产生怎样的影响？特别是对干细胞命运的影响；②微米或纳米形貌是如何被细胞感知并通过什么信号通路调控细胞命运？

1.拓扑形貌对细胞黏附、形态及排列的影响

当细胞接触拓扑形貌产生时，细胞黏附是细胞和材料响应的第一步。细胞外基质（ECM）是细胞微环境的主要组成之一，它是一个包含微纳米多级尺度的复杂的分子网络。为了更加深入地了解细胞与材料表面拓扑形貌的相互作用，研究细胞与细胞外基质的相互作用是非常有必要的。细胞通过不同的黏附分子与ECM接触，最常见的途径就是整合素介导的细胞-ECM相互作用。细胞通过整合素与ECM连接，而整合素是一组由α和β亚基组成的异源二聚体跨膜蛋白，通过识别细胞外侧的特定氨基酸序列，将细胞骨架与ECM连接起来。细胞-细胞外基质相互作用建立后，细胞得以铺展并通过一系列细胞内信号传导级联[包括黏着斑（FA）和细胞骨架细丝]感受拓扑形貌表面的形态特征。

整合素的活化及聚集在细胞-ECM相互作用中起着至关重要的作用。最典型的研究案例就是采用与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结合的金簇阵列来控制和研究整合素对细胞的影响。例如，在Elisabetta的工作中，整合素聚集的距离阈值被控制在58nm以内。当整合素聚集的距离超过58nm时，细胞黏附变得不稳定。可能原因在于黏着斑更容易在小的纳米图案上形成，而细胞无法在70nm以上的大尺寸上形成黏附肌动蛋白束。除了配体尺寸之外，纳米结构有序性也能影响细胞黏附，与具有有序配体的纳米图案相比，无序纳米图案更有利于细胞黏附，这主要归功于局部配体的多分散性。有趣的是，除了尺寸和有序度，配体密度也能影响细胞黏附，相比于微米尺寸的间距，细胞对配体间纳米级的间距更加敏感，这主要是由于配体密度对整合素聚集以及FA形成都有着至关重要的影响。

以上这些研究表明，整合素或其他细胞黏附分子会受到微米或纳米形貌特征的影响进行分布和聚集。相应的，细胞形态也会受到微米或纳米形貌的影响。Ding的团队在通过微纳米形貌控制细胞形态上做了很多工作。一个典型的例子就是通过剥离光刻法制备的具有不同RGD微图案的PEG水凝胶来控制单个间充质干细胞。细胞会完全改变它们的形状以适应微小的空间。不仅细胞骨架，细胞核的形状也可以通过微图案进行调控。例如，骨髓间充质干细胞的细胞核可以在PLGA微柱上自我变形，并进一步转变成不同的核形状，包括圆形、方形哑铃和不对称球形。另外，纳米尺度的表面形貌也可以影响细胞的形态和铺展，并且常被应用于重塑神经细胞生长。大量的研究证明，比起在平坦的表面，神经元在纳米材料表面上会产生更多的神经突，且其生长速度以及生长质量都相对更好。

接触引导是细胞与拓扑形貌相互作用时最容易产生的现象，由Harrison在1911年首次观察到。与纳米结构相比，细胞更容易在微米尺度方向上形成有序排列。例如细胞会沿着微米沟槽排列，但并不总是如此。一个典型的例子是海马神经元的神经突会垂直于微槽延伸，而脊髓神经元的神经突则沿着微槽延伸。其他类型的拓扑形貌，例如微纳米柱或微纳米褶皱也可以调控细胞的排列方向。总的来说，细胞的黏附、铺展以及排列都可以通过拓扑形貌进行调控，也很容易直接进行观察分析。除此之外，拓扑形貌还会影响干细胞的命运，这也是目前组织工程领域的一大研究热点。

2.图案表面上的干细胞命运

近些年来，越来越多的研究人员开始研究材料表面拓扑形貌与其对干细胞表型的影响，但由于文献中报道的拓扑形貌、材料基底以及干细胞类型多种多样，所以很难准确地揭示其内在联系。这里，我们总结出三种典型的可用来调控干细胞表型的拓扑形貌。首先是具有几何图案的拓扑形貌，在分子水平上会产生精确的配体间距，通过结合黏附蛋白或多肽（如RGD）来模拟ECM的黏附特性。干细胞的表型也会受到这些几何图案的影响。研究表明，当间充质干细胞（MSC）被限制到较小的粘连图案上时，会朝着脂肪细胞分化；但是当间充质干细胞黏附区域较大时，则会朝着成骨方向分化。另外，黏附图案的几何形状也同样会影响干细胞的分化。当间充质干细胞被重塑为圆形、方形、矩形、三角形和星形时，发生成骨和成脂分化的趋势也各不同。方形细胞呈现最好的成脂分化，而矩形细胞则呈现最佳的成骨分化。第二种会显著影响干细胞表型的拓扑形貌是具有一定取向的微纳米结构，例如凹槽结构或定向纤维。在Shinya的研究中，使用有序的脊和凹槽结构来探索形貌对间充质干细胞的影响，结果显示，细胞在400nm间距的有序沟槽上有更高的RUNX2和BGLAP表达，显示出明显的成骨分化趋势。类似的，Yau的研究表明取向结构纤维可以通过促进功能性siRNA的摄取来促进间充质干细胞的成骨分化。但Dalby的工作有所不同，他的研究表明，在具有120nm直径的有序纳米凹坑的材料表面，间充质干细胞的干性可以维持8周。而随机排列的纳米凹坑材料表面，间充质干细胞表现出明显的成骨分化。最后，微纳米组合结构也能够有效地调控干细胞表型。当纳米尺寸RDG阵列被限制在微图案中时，组合结构中可以观察到更多的干细胞成骨分化趋势。而n-（3-二甲氨基）丙基甲基丙烯酰胺的微纳米组合形貌则能够维持小鼠胚胎干细胞（mESC）干性3周以上。可见，拓扑形貌能够在很大程度上调控干细胞命运，而分析这个过程中可能的生物学机制将为以后设计更加有效的材料表面拓扑形貌提供指导。

3.细胞-形貌相互作用的可能机制

在这里我们介绍了三种可能的拓扑形貌-细胞相互作用机制（图3-1）。正如前面提到的，细胞黏附是细胞与拓扑形貌相互作用中必不可少的部分。这个过程中，机械传导途径被激活。在涉及细胞/材料界面的所有力传导机制中，由于基质引起的细胞骨架收缩机制是最具有相关性的。通过“感觉”拓扑形貌，细胞骨架蛋白中的肌动蛋白和分子运动肌球蛋白Ⅱ相互结合与滑动，产生细胞骨架收缩。这其中涉及的典型信号通路就是Rho/ROCK信号通路。通常，Ras同源基因家族成员A（RhoA）可以通过肌球蛋白轻链激酶（MLC）和Rho相关激酶（ROCK）调节肌球蛋白收缩，而MLC会通过磷酸化和激活的ROCK来产生细胞收缩相关行为，包括细胞黏附。此外，Rho和ROCK对不同的拓扑形貌特征也会产生不同的响应，是非常好的形貌感知和细胞调节器。

关于拓扑形貌影响细胞命运的另一可能机制就是通过拉伸激活通道（SAC）改变钙离子浓度来调控细胞行为。通过调节蛋白质-蛋白质相互作用，SAC可以选择性地让特定离子穿透。当涉及拓扑形貌特征时，可以频繁观察到钙离子通道的变化。早在1997年，Rajnicek就观察到钙离子通道阻滞剂可以降低大鼠胚胎海马神经元在微米沟槽上的垂直排列，暗示着拓扑形貌可能会通过影响钙离子通道变化来影响细胞命运。最近有实验表明，当人MG-63细胞在具有均匀硅-钛微米柱阵列（5μm×5μm×5μm）上培养时，其细胞内 Ca²⁺浓度降低，并伴随着肌动蛋白骨架的缩短。这些结果揭示了钙离子传导信号在拓扑形貌信号调控细胞命运中起到了重要作用。

黏着斑响应机制是被广泛研究的拓扑形貌-细胞相关作用机制。整合素可以感知基质信号，并通过非受体酪氨酸激酶，例如黏着斑激酶（FAK）传递信号，相关信号可以由FA直接传递到细胞核中。FAK可以通过降解p53（肿瘤蛋白53）来促进细胞增殖和存活。同时，FAK还可以激活下游细胞外信号调节激酶（ERK）来影响细胞分化。此外，各种研究已经证明了FAK分布对于不同的微米或纳米形貌具有敏感性。这意味着拓扑形貌可以通过改变FAK分布来间接调控细胞命运。其他酪氨酸激酶如Src，在调节细胞黏附方面也有类似的作用，抑制Src会增强细胞对微纳米形貌的敏感性，进一步证明了黏着斑响应机制是重要的拓扑形貌-细胞调控机制。

总的来说，与微纳米形貌表面接触时，细胞“感受”到所处环境的形貌特征，继而改变自身形态以适应这种新的“地面”。而细胞骨架的变化也会进一步影响细胞核的形状，染色体的排列和基因转录，从而影响细胞命运。