一、通过微米和纳米技术获得表面拓扑形貌

大量的研究表明，通过在材料的表面构建拓扑形貌能够有效地调控细胞行为以及组织再生。例如，通过电子束光刻法在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面构建随机排列的纳米小孔，能够在体外诱导人骨髓间充质干细胞（hBMSC）向成骨方向分化。再比如，与传统的表面光滑的羟基磷灰石（HA）陶瓷支架相比，通过热水法制备的表面具有微纳米结构的羟基磷灰石支架不仅能够在体外促进细胞成骨分化，植入体内后还能够增强材料的体内成骨性能。因此，选用合适的微纳米加工方法来构建材料表面拓扑形貌是实现细胞调控的重要一步。在这一部分，我们回顾了多种微纳米加工技术的最新进展，为了方便描述，我们将这些微纳米加工技术分为自上而下、自下而上以及它们的组合方法三类。

1.自上而下的微纳米加工技术

光刻技术是目前最常见的微纳米加工技术，主要用于硅片表面的微加工，一般精度范围在几个微米。通过对光源的优化，在实验室中可以获得小于100nm的光刻图案。另外，在传统光刻技术的基础上，研究人员还开发出了软光刻（SL）、等离子光刻（PL）、纳米压印光刻（NIL）、毛细管力光刻（CFL）、胶体光刻（CL）、嵌段共聚物光刻（BCPL）、电子束光刻（EBL）、纳米转印（NTP）等一系列非常规光刻技术。除了硅片，聚二甲基硅氧烷（PDMS）也是常用于光刻研究的材料。PDMS的超弹性使得其能够很轻松地复制基底图案。但无论是硅片还是PDMS，都不是理想的生物材料，其固有的生物惰性大大限制了它们在生物医学领域，特别是在组织工程领域的应用。正是基于这样的考量，许多研究人员尝试着将这些光刻技术应用到活性生物材料上，例如将图案复制到聚乙二醇（PEG）或者聚乙烯醇（PVA）表面。然而，通过这些方法制备的拓扑形貌仍然集中在二维（2D）平面上，而很明显，细胞在体内是处于三维（3D）微环境中的。近几年，一种称为直接激光写入（DLW）的特殊光刻技术可以通过使用双光子聚合获得3D支架。利用这种技术既可以一步直接激光写入制备三维刚性季戊四醇四丙烯酸酯（PETTA）支架和3D软性ormocomp（一种无机-有机杂化聚合物）支架，也可以通过多步法制备聚乙二醇二丙烯酸酯/季戊四醇四丙烯酸酯（PEG-DA/PETTA）复合支架及PEG-DA/PETTA/ormocomp复合支架。

其他自上向下的方法，包括等离子喷涂技术、静电纺丝技术和3D打印技术都已被广泛应用于组织工程支架制备以及植入材料表面修饰。其中，等离子喷涂技术常被用于制备骨科植入物的表面涂层，这些涂层在离子化过程中可以很容易地形成微纳米形貌。然而，等离子喷涂得到的这些微纳米结构的形貌尺寸皆不可控，往往还需进行后处理。另外，等离子过程中易产生高温使得等离子技术很少应用于高分子材料的表面加工。与等离子喷涂技术不同的是，静电纺丝技术常被用于制备胶原蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇（PVA）、聚己内酯（PCL）等生物高分子支架，这些支架都是由纳米纤维或微米纤维组成。然而，这些纤维的无规则致密分布使得细胞无法浸润生长，并不是理想的3D多孔支架。相比之下，3D打印技术则能够更好地控制支架的三维结构，包括PCL、PEG、HA等在内的多种生物材料均可以通过3D打印技术进行加工。只不过一般的3D打印技术很难实现对微米或纳米尺寸的调控，将3D打印和静电纺丝结合之后的直写熔融电纺技术，既可以有效地控制纤维的分布，又能够调控支架孔径到微米尺寸，更加有利于研究材料微纳米结构对细胞的影响。总的来说，自上而下的微纳米加工方法多是基于材料的物理性质而进行的机械加工方法，常用于构建大尺寸的材料体系。

2.自下而上的微纳米加工技术

自组装技术是最常用的自下而上的微纳米加工方法，通过细小的组件不断地自组装而形成更大、更稳定、更具有层次的结构。自主装的原理既可以基于材料的物理性质又可以基于材料的化学性质。例如“呼吸图案法”（breath figures），在高湿度环境下，将聚合物溶解于和水不相容的低沸点有机溶剂中，随着溶液中溶剂的快速挥发，溶液表面温度降低使得环境中的水蒸气凝结成液滴并自组装排列于聚合物中。最后水分挥发，形成蜂窝状的孔结构。此方法适用于在多种聚合物上进行微纳米孔加工，孔径尺寸常介于几百纳米到几百微米之间。除了物理方法，还可以通过化学方法进行自组装。例如，通过化学键连接热力学不相容的不同高分子嵌段可以自组装成高度规则的超分子结构，其特征尺寸为10～100nm，由于相分离而产生的纳米图案可作为模板而用于纳米刻蚀。然而，通过上述这些自组装技术来制备大尺寸结构仍然是一个挑战。相比之下，层层自组装技术（LBL）更适合用于制备大尺寸且结构复杂的器件，无论是有机组分还是无机组分都可以通过化学或物理方式层层叠加而形成最终的多层结构。

另外，还有两种常用的自下而上的微纳米加工技术。一种是适用于有机材料的“褶皱加工技术”，基本原理是基于材料的热不稳定性，通过加热或折叠等外力刺激形成皱褶状的微纳米结构。另一种是适用于无机材料的晶体生长技术，其中最常见的就是通过水热反应或溶剂热反应在无机材料表面构建微纳米形貌。总的来说，自下而上的微纳米加工方法多是基于材料的化学性质而进行的化学加工方法，常用于构建小尺寸的材料体系。无论是自上而下还是自下而上的微纳米加工技术，其中单独的某一种微纳米技术往往都很难实现多尺度结构的调控，而人体组织又恰恰是典型的多尺度结构，为了获得合适的仿生结构，常常需要将不同的微米加工技术进行组合而用于材料加工。

3.微纳米加工技术的组合

一般而言，生物组织包含微米尺寸结构和纳米尺寸结构，每个微米或纳米结构都有其自身的功能。目前已有不少人工模拟多尺度仿生结构的报道，实现这些仿生结构最简单的方法就是重复使用某种微纳米加工技术或将多种加工技术相互组合。例如，壁虎足趾具有超强的黏附性能，甚至在光滑的玻璃上壁虎都能攀爬自如，主要原因就是其独特的足趾刚毛阵列，这些足趾表面由数百万个微米尺度刚毛组成，而这些微米尺度刚毛又可进一步分割成数百个刮刀状纳米尺度结构。为了模拟这种独特的结构，科研工作人员提出许多方法，包括两步紫外辅助毛细管力加工法、光刻和软光刻结合法等。然而，这些方法中所用的材料大多不适合细胞生长。为了研究细胞在多尺度拓扑形貌上的行为，需要将这些微纳米加工方法引用到生物材料上。目前已有一些报道，例如Kubo等人通过自组装技术在酸腐蚀产生的TiO₂微米凹坑表面成功制备了纳米级球状纳米结构，从而构建钛表面的微纳米组合结构。Yang等人将嵌段共聚物的自组装技术与光刻技术进行结合，制备出微米沟和纳米孔构成的组合结构。此外，除了二维组合结构，一些多尺度3D支架也在组织工程应用中崭露头角。例如，3D打印和静电纺丝组合可以在支架大孔结构中嵌入PCL/胶原纳米纤维。类似地，毛细管力学光刻和褶皱法组合可以获得适用于肠组织黏附的多尺度图案PLGA贴片。尽管过去几十年，微纳米制备技术发展迅速，但材料表面拓扑形貌与细胞或组织之间的内部联系仍不清楚。幸运的是，越来越多的研究人员已经意识到微纳米结构在组织再生中的重要性，这必将进一步推动微纳米加工技术的发展。