四、复合小分子化合物生物材料在心血管系统修复再生中的应用

据世界卫生组织统计，2012年有1 750万人死于心脏病，占全球死亡人数的31%。心血管疾病已经成为全球主要死因之一，严重影响人民健康，目前尚缺乏有效的治疗手段。因此，发展新型、高效、经济的心脏疗法是世界范围内的共同目标。众所周知，成人心脏的再生能力非常有限，大多数心脏病往往伴随着心肌细胞的严重损坏和心脏病理性重塑，最终导致心力衰竭甚至猝死。心肌梗死后，损伤区域被纤维瘢痕所取代，一方面可以保护心脏壁不破裂，另一方面丧失收缩和传导电信号功能，最终导致心脏压力升高，不可逆转地影响心脏功能。因此，心脏移植是治疗这些患者的可能方法之一。显然，由于心脏供体的短缺，这种治疗方法在很大程度上是不可行的，同时要考虑移植后所需的终身免疫抑制剂治疗。因此，替代再生疗法是非常必要的。在过去20年里，人们对干细胞疗法给予了极大的关注，并在文献中对此进行了广泛的回顾。移植干细胞可以作为心脏修复的种子细胞，促进受损心肌的再生。但是干细胞在体内转分化效率很低，并且多来自异体干细胞，伴随免疫排斥。因此，寻找可替代的自体细胞源成为细胞替代疗法中的重要任务。

基于小分子化合物诱导初始细胞重编程为心肌细胞（CM）已有报道。直接重编程的纯化学方法在本质上比转基因方法更安全。近来，利用小分子化合物的组合可实现小鼠和人成纤维细胞直接重编程为CM。

两个独立研究小组利用不同的小分子化合物混合成功诱导小鼠成纤维细胞为心肌细胞样细胞（CiCM）。其中You等的研究团队筛选出12个小分子化合物，它们具备诱导细胞重编程或保持ESC多能性的能力。为了鉴定小分子化合物组合中哪些为心肌细胞诱导的关键性小分子化合物，他们采用从培养体系中依次减少其中一个小分子化合物的方法，最终确定了核心小分子化合物组合，足以将鼠成纤维细胞转化成CiCM。这五个核心小分子化合物调节不同的细胞靶标，依次为糖原合酶激酶3（GSK-3）、激活素受体样激酶 5（ALK5）、环 AMP、ras GTP酶激活蛋白（Ras-GAP）/胞外信号调节激酶（ERK）和钙通道，说明重编程过程是复杂的，是由多条细胞信号通路介导的。与此同时，Xie的研究小组又发现了另一种小分子化合物组合[Chir99021、RepSox、forskolin、VPA、Parnate、TTNPB、DZnep（CRFVPTZ）]，该组合也能够重编程小鼠成纤维细胞为CiCM，其中CRFV为该组合中诱导重编程的核心小分子化合物。

总之，上述方法均能将鼠成纤维细胞转化为自发跳动心肌细胞样细胞。另外，重编程获得的CiCM都表达心脏特异性标记物，具有心脏基因典型的表观遗传状态，并显示与生理状态下CM相似的亚细胞结构。此外，CiCM具备典型的心脏钙通量和电生理特征，如自发性收缩。

最近，Ding研究小组首次成功地将人成纤维细胞重编程为跳动的心肌细胞。他们小分子化合物组合的理念是基于能够诱导或增强细胞重编程的小分子组合，并与若干心源性分子（例如激活素A、BMP4和VEGF）组合以诱导其向心肌细胞表型分化。其中关键原则是首先促进细胞表观遗传处于重编程状态，将染色质处于开放状态。因此，细胞对外源性心源性因子的刺激反应更强，这些刺激可以结合关键基因的启动子/增强子区域，调节TGF-β、Wnt和GSK3β等关键通路。另外，Cao等筛选了几组化合物，除了由 SB431542、CHIR99021、parnate和forskolin组成的SCBF组合外。最后他们优化了由9个小分子化合物（9C）组成的“鸡尾酒”，能够通过顺序诱导中胚层、心脏祖细胞和最后的心肌细胞，再现心脏生理。将人类包皮成纤维细胞转化为CiCM。CiCM呈现良好的肌节结构，并表达特异的形态学和功能性心肌标志物，如心肌肌钙蛋白T和I、连接蛋白43（connexin43）、心房利钠因子和MLC2v，且获得的CiCM中有97%在体外自发跳动。因此证明它们是具有类似于CM的电生理学特征的功能性心肌细胞。该策略的优势在于CiCM是由直接重编程获得，而非通过多能细胞的状态，保持了亲本基因组的稳定性。此外，9C重编程而来的CiCM移植到小鼠心肌梗死模型后，促进受损区域的再肌化，发挥治疗作用。这些结果为人体细胞完全基于药物直接重编程为CM提供了全新的手段。然而，小分子化合物重编程的手段面临以下两个难题：转化效率和获得心肌细胞的成熟度。

为了解决低转化效率问题，生物材料与小分子化合物相结合的手段用于进一步提升重编程的转化效率。纳米材料在生物医学研究中具有无可比拟的优势，由于其生物相容性、可控性，作为潜在的药物载体受到了极大关注。一系列纳米材料被用作载体来输送药物，如金纳米棒（AuNR）、量子点（QD）、石墨烯纳米粒子和介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）。在各种纳米材料中，MSN被考虑作为最安全的材料（已被FDA批准），且具有高负载能力、可调节的粒度和孔径、多功能表面性能和无与伦比的生物相容性。最重要的是其具有独特的中空结构，大的表面和内部区域可以用作储存药物的储存器。MSN作为药物输送平台，可以将小分子5-氮杂胞苷更有效地递送到干细胞中，增加心肌细胞转化效率。5-氮杂胞苷主要通过改变心肌细胞分化基因和心脏标志物基因的组蛋白修饰调控区域。

另外，抗坏血酸（AA，现称维生素C）负载的荧光TRITC介孔二氧化硅纳米粒子（TMSN-AA）可以作为诱导hESC分化成心肌细胞的潜在工具。TMSN-AA纳米复合物能够将hESC阻滞在细胞周期G1期，并降低hESC中OCT4和SOX2的表达，较单独使用AA显著增加心肌细胞的分化效率。此外心肌标志物，心肌肌钙蛋白I（cTnI）和胎肝激酶1（FLK-1）在TMSN-AA纳米组中显著上调。因此，初步证明了载药纳米颗粒对hESC分化的有效性，在心肌组织工程中具有潜在的前景。