分枝杆菌分离培养包括固体培养和液体培养方法，用于分离检测分支杆菌。固体培养是我国基层目前使用最多的方法，下述将主要针对简单法固体培养进行描述（图3-8），液体分离培养方法须严格按照厂家说明进行（图3-9）。分枝杆菌分离培养应选择2份痰标本进行分离培养。

（1）对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约1～2ml标本转移至相应前处理管中，旋紧痰标本容器螺旋盖。

（2）视标本性状，将1～2倍的4%NaOH溶液加入前处理管中，旋紧处理管螺旋盖，立即开始计时15分钟。

（3）在生物安全柜内，将处理管在涡旋振荡器上涡旋振荡30秒直至痰标本充分液化。

（4）将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置，直至15分钟计时结束。

（5）拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。

（6）用无菌吸管吸取前处理后的痰标本，保持培养基斜面水平，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基接种0.1～0.15ml（约2～3滴），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部（距离培养基顶端1cm处），旋紧培养管螺旋盖，轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀地在斜面上铺开。

（1）将培养基放置在斜面放置架上，保持培养基斜面水平向上。

（2）连同斜面放置架将培养管置于恒温培养箱内，（36±1）℃孵育。

（3）待24小时后，直立放置培养管，（36±1）℃条件下继续孵育。

接种后第3日和第7日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第8周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。

（1）拿出MGIT 7ml生长指示管、生长添加剂、PANTA，检查MGIT生长指示管有无破损及污染（管中液体出现浑浊）。

（2）将MGIT PANTA与15ml MGIT生长添加剂重新混合。

注意：该混合物在2～8℃可稳定保存7天。在保存前贴上标签，包括内容物、配制时间、有效期及配制人信息。若7天内不能用完，可当时分装，置于-20℃以下的温度，保存6个月。

（3）在生长指示管上标记标本编号。

（4）用移液枪在每个MGIT管内添加溶解后的0.8ml PANTA/生长添加剂混合物，注意操作不要污染管，盖紧MGIT管。

（1）对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约1～2ml标本转移至相应前处理管中，旋紧痰标本容器螺旋盖。

（2）视标本性状，将1～2倍的NALC-NaOH混合溶液加入前处理管中，旋紧处理管螺旋盖，涡旋震荡10～20秒，立即开始计时15分钟。

（3）室温静置15分钟。

（4）加入0.067M的pH为6.8的磷酸盐缓冲液至45毫升。

（5）离心力3 000×g，离心机温度为8～10℃，离心15～20分钟。

（6）在离心期间，按所接种的液体培养基要求，向液体培养基中加入指定量的营养添加剂（如OADC）和抗污染剂（如PANTA）。

（7）离心结束后，将离心筒（杯）取出，在生物安全柜中小心打开离心桶（杯）盖，取出离心管。

（8）小心弃掉离心管内上清液至含消毒剂的废液缸中。

（9）加入1ml磷酸盐缓冲液至离心管中，重悬沉淀。

（10）吸取0.5ml重悬液，接种于液体培养基内。

按照液体培养基的具体要求放置到培养仪器相应的位置进行孵育。

（1）如果培养仪器报告阳性，应按照液体培养基的具体要求对培养液进行涂片染色显微镜检查。

（2）如果涂片检查为抗酸菌阳性，则报告培养阳性，进行进一步鉴定和药物敏感性试验。

（3）如果难以确定，可用培养液接种血琼脂培养板或巧克力琼脂培养板，如果在24小时内有菌落生长，则判定不是结核分枝杆菌生长。如果涂片检查发现有非抗酸菌存在，则报告污染。如果任何微生物皆未发现，应继续培养。

（4）6周培养仪器未报告阳性，则判定为培养阴性。

观察培养基外观，酸性罗氏培养基绿色略偏蓝，中性罗氏培养基为绿色。如果培养基异常，颜色灰暗，过蓝或过黄，均不能使用。另外培养基质地过软或干涸、匀化性差等均不能使用。每批新制作或新批号的商品化培养基至少要抽取5%进行无菌性测试，有条件时进行敏感性测试。

抗结核治疗会降低分离培养阳性率，用于分离培养的痰标本尽可能在治疗前采集。

若不能在痰标本采集后立即进行分离培养操作，应将痰标本储存于2～8℃冰箱暂时保存，防止痰液干涸或污染。从收集痰标本至处理痰标本的时间至多不能超过7天。

确保痰标本处理液浓度为4%，处理时间为自加入前处理液开始至结束15分钟内，处理时间过短会造成过高的污染率，如果标本量过大，应分批次处理（如每次处理6～8个痰标本），避免因每批处理标本过多，导致处理时间过长而降低培养的阳性率。

如果经过正常的前处理过程后，仍有部分肉眼可见的沉渣或痰栓，接种前不要吹打或混匀，直接吸取上层液体接种，减少污染的发生。

接种处理液时尽量铺满整个培养基斜面。

接种菌液的培养基应水平放置放置24小时，待菌液完全吸收后再直立放置继续孵育。

结核分枝杆菌的最适宜生长温度为37℃左右，温度过高或过低均会造成结核分枝杆菌停止生长，因此要每日监测培养箱的温度，确保温度波动范围为35～37℃之间。

每月定期汇总分析反映分枝杆菌分离培养工作的质量指标，连续监测各指标，指标值出现明显变化应立即查询原因，并尽快解决。

分枝杆菌分离培养质量指标包括初诊患者培养阳性比例、初诊患者结核分枝杆菌培养阳性比例、涂阳标本培养阳性比例、培养发生污染比例（固体）、培养发生污染比例（液体）、分离培养周转时间（固体）、分离培养周转时间（液体）。

初诊患者培养阳性比例=初诊患者中培养阳性的患者数量/初诊患者中开展培养的总数量

初诊患者结核分枝杆菌培养阳性的比例=初诊患者中分离培养阳性且菌株经鉴定为结核分枝杆菌的患者数量/初诊患者中开展培养的总数量

涂阳标本培养阳性比例=痰涂片镜检阳性且培养阳性的标本数量/痰涂片镜检阳性且开展分离培养的标本数量

培养发生污染比例=分离培养发生污染的培养管（基）数量/开展分离培养的总培养管（基）数量

分离培养周转时间=自实验室接收到标本至实验室报告分离培养结果报告的时间间隔