高效液相色谱法检测不同品种枣果中的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸

李崇阳，牟德华^*

（河北科技大学 生物科学与工程学院，石家庄 050018）

红枣（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus Mill.）植物枣树的子实，又名大枣或中华大枣，是我国特有的果品之一，主要分布在晋、冀、陕、鲁、豫五省以及新疆的阿克苏地区。与桃、李、栗、杏并称为中国古代五果，是卫生部批准的“药食兼用”品种之一，具有很高的药用价值和食用价值^[1]。红枣味甘、性温、无毒，入心、脾、胃经，久食或入药膳有补气血，益脾胃，通九窍，和百药，润肤养颜，强志延年养生保健功效。凡体质虚弱或欲抗衰延年者均可食用。民间有谚曰：“一日吃三枣，一辈子不显老”^[2]。现代研究还表明红枣具有抗癌、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、保肝护肝和提高免疫力等功能^[3-5]，这与红枣中含有大量多糖、黄酮、环核苷酸和三萜类化合物等活性成分密切相关。

三萜酸作为一种五环三萜类化合物因具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝、降脂、降血糖、提高白细胞数量、增强机体免疫力等重要生理功能而成为当今社会研究的热点^[6-9]。红枣中含有大量的三萜酸类化合物，其中以白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸最为典型，三种三萜酸结构和极性极为相似且具有多种生理功能，其中白桦脂酸可选择性地杀死人类黑色素瘤细胞而不杀伤健康细胞，对HIV-1型感染有抑制作用；齐墩果酸具有较强的抗菌消炎作用及保护肝脏、利水渗湿等功效；熊果酸有抑制多种恶性肿瘤细胞生长的作用，对诱癌、致癌物也有一定的抵抗作用，能提高人体免疫力，毒副作用小，安全性高^[10-12]。

资料显示，大量文献采用HPLC法对齐墩果酸和熊果酸这一同分异构体进行分离，且都集中在白花蛇舌草、枇杷、女贞子、圣罗勒等中草药中^[13-16]，而对于大枣、酸枣和酸枣仁中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸同时分析检测的报道相对较少，高娅等^[17]采用HPLC法测定了不同品种枣果中的白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的含量；王向红等^[18]同样采用HPLC法测定了不同品种枣果和一种酸枣中齐墩果酸和熊果酸的含量。本文研究建立了一种同时检测不同品种枣果、酸枣和酸枣仁中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的高效液相色谱法，对同一品种不同产地、不同级别以及同一产地不同品种枣果间三种三萜酸含量的差异进行了比较，同时将检测结果与种植园新培育的多种新型枣品种进行比较，并对不同产地酸枣和酸枣仁中三种三萜酸含量进行了比较。对于提高枣果和酸枣的附加值、选育高三萜酸含量的枣品种和充分开发酸枣仁的剩余利用价值具有重要意义。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸标品均购自艾科试剂公司，甲醇和乙腈均为色谱纯，磷酸、三乙胺、乙酸铵、无水乙醇、95%乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿均为分析纯，实验用水均为娃哈哈纯净水。

所有大枣、酸枣和酸枣仁样品均由河北农业大学中国枣研究中心提供。

1.2　仪器与设备

SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)LC-20A，日本岛津公司；Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱；Spectrum 756p紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHZ-Ш循环水式多用真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司；飞鸽TDL-5-A高速离心机，广州航信科学仪器有限公司；101-0AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；九阳料理机；DELTA320pH 计、ARI140 型电子分析天平、微孔过滤器等。

1.3　试验方法

1.3.1　样品的处理

将不同品种枣样品去核后切成薄片置于55℃电热鼓风干燥箱中烘至恒重，然后用高速粉碎机进行粉碎，过40目筛，粉碎后的枣粉样品置于密封袋中保存于干燥器中备用。

1.3.2　标准溶液的制备

精密称取白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸标品各5mg，用甲醇溶解后定容到50ml棕色容量瓶中得到浓度均为100μg/ml的混合标准储备液。分别取5ml、2ml、1ml、0.5ml和0.2ml的混合标准储备液用甲醇定容到10ml棕色容量瓶中，得到浓度分别为50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的系列标准工作液，过0.45μm膜后避光保存于4℃冰箱中备用。

1.3.3　供试品溶液的制备

精密称取1g枣粉加入15ml 70%乙醇，温度50℃、功率100%的条件下超声提取30min，然后在4500r/min的条件下离心15min，收集上清液，残渣再按上述条件重复提取两次后，合并三次提取液定容到50ml容量瓶中，过0.45μm膜后避光保存于4℃冰箱中备用，以保留时间定性，以外标法定量。

1.4　数据处理

色谱数据分析采用仪器自带软件进行处理。所有线性方程、精密度、重复性、稳定性及回收率实验的数据均由Excel 2007处理得出，样品检测结果方差分析通过SPSS17.0分析得出。

2　结果与讨论

2.1　色谱条件的优化

2.1.1　检测波长的确定

分别配制一定浓度的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸标准溶液，于紫外可见分光光度计中进行全波长扫描，结果显示白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的最佳吸收波长均为210nm左右，参考相应的文献最终确定本实验的检测波长为210nm。

2.1.2　色谱柱的选择

由于白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸三者结构差异较小，分离较为困难，因此色谱柱的微小变化，如粒子填充疏密程度的微小差异等都会导致分离情况的较大变化。本实验比较了Hypersil ODS2（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱、Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱以及Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱对于三种三萜酸分离效果的影响，尽管三种柱子填料不同但都以硅胶为主要成分，且填料粒径均为5μm，结果显示Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱分离效果明显优于另外两种色谱柱，分离度大于1.5且保留时间适中。这可能是由于Kromasil C18色谱柱相比于其他两种柱子含碳量更高、表面极性更小，且Kromasil的表面由独特的硅羟基基团组成，硅烷的覆盖率更高，在酸性条件下更稳定、更有利于三萜酸这一酸性物质的分离。因此，本实验最终选择Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱进行分离。

2.1.3　流动相的选择

不同的流动相系统对于三种三萜酸的分离具有显著的影响。本实验研究了甲醇-水系统、乙腈-水系统和甲醇-乙腈-乙酸铵系统对于三种三萜酸分离效果的影响。又由于三种三萜酸均呈弱酸性，在中性条件下易发生电离，因此实验比较了磷酸和冰醋酸调节流动相pH值对分离效果的影响。结果显示乙腈-水系统保留时间较短且使用磷酸和冰醋酸调节pH值均不能实现良好的分离；使用甲醇-水系统和甲醇-乙腈-乙酸铵系统均能实现三种三萜酸的基线分离，但甲醇-乙腈-乙酸铵系统保留时间较长且该系统较为复杂，对色谱柱污染较大不利于长期使用。因此，实验选用甲醇-水系统为流动相。并比较了磷酸和冰醋酸对于调节pH值的影响，结果显示磷酸分离效果明显优于冰醋酸，这可能是由于冰醋酸除了调节pH值外本身还具有洗脱能力，不利于三萜酸的分离，因此实验选用磷酸调节流动相pH值。不同的pH值对于峰形和保留时间也有影响，pH值升高峰形变窄保留时间变短，pH值降低峰形变宽保留时间延长，实验结果显示当pH=3时分离效果最好且保留时间适中。实验还研究了不同的流动相比例对分离效果和保留时间的影响，结果显示当甲醇 : 水=91 : 9时最为理想。因此本实验最终确定流动相为甲醇 : 水=91 : 9，磷酸调节pH=3。

2.1.4　柱温的选择

资料显示适当降低柱温有助于齐墩果酸和熊果酸这一同分异构体的分离。实验研究了当柱温分别为15℃、20℃、25℃、30℃以及处于室温条件下对于三种三萜酸分离效果的影响，结果显示当温度逐渐降低时分离度有所提高但变化不是很明显，因此实验最终确定在室温（25℃左右）条件下操作，这样更有助于系统的稳定性。

2.1.5　流速的选择

随着流速的增加色谱峰保留时间变短同时柱压升高，反之随着流速的减小色谱峰保留时间延长同时柱压降低。实验研究了当流速分别为0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min和1.0ml/min时对三种三萜酸分离效果的影响，结果显示适当降低流速有助于齐墩果酸和熊果酸这一同分异构体的分离但同时保留时间相对延长，因此实验最终选择流速为0.6ml/min，在此条件下三种三萜酸在25min内实现了良好的分离且分离度均大于1.5。

2.1.6　色谱分析

按以上优化出的色谱条件分别对标准品和样品中的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸进行检测，色谱图见图1。

2.2　三萜酸检测方法的建立

2.2.1　标准曲线的绘制及检出限和定量限

取浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的混合标准工作液，按照最优色谱条件每个浓度值重复进样三次取平均值，以响应值峰面积y对质量浓度x作线性方程：y=ax+ b，进行线性回归分析。检出限（limit of determination，LOD）为3倍信噪比，定量限（LOQ）为10倍信噪比，结果如表1所示。

2.2.2　精密度试验

取浓度为10μg/ml的混合标准工作液按最优色谱条件连续进样6次，以白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的峰面积的相对标准偏差（RSD）来表征方法的精密度，RSD分别为2.67%、3.25%和3.29%，表明该方法精密度良好。

2.2.3　稳定性试验

以赞皇大枣为样品按照1.3.3供试品溶液的制备方法制备一份供试品溶液，按照最优的色谱条件分别在0h、4h、8h、12h和20h时测定其中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量，结果显示RSD分别为4.08%、1.23%和3.26%，表明供试品溶液在20h内是稳定的。

2.2.4　重复性试验

以赞皇大枣为样品按照1.3.3供试品溶液的制备方法分别制备5份供试品溶液，在最优色谱条件下测定其中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量，结果显示RSD分别为5.64%、3.51%和5.55%，表明该方法重复性良好。

2.2.5　回收率试验

精密称定已知三种三萜酸含量的5份枣粉样品，准确加入一定量的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸标品，按照1.3.3供试品溶液的制备方法分别制备5份加标溶液，在最优色谱条件下测定其中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量，计算加标回收率，结果如表2所示，由表2可知该方法准确度良好。

2.3　不同品种枣果样品的检测

精密称定不同品种大枣、酸枣和酸枣仁样品各3份，按照1.3.3供试品溶液的制备方法分别制备 3 份供试品溶液，在最优色谱条件下测定其中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量，结果如表3所示。

由表3可知，不同品种、不同产地大枣、酸枣和酸枣仁中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸含量均存在显著性差异。就大枣、酸枣和酸枣仁而言，总三萜酸含量最高的为辽宁产区小酸枣仁，其含量达到2921.48μg/g，明显高于大枣中总三萜酸含量最高的新疆产区特级骏枣（1090.28μg/g）和酸枣中总三萜酸含量最高的保定产区酸枣（1120.68μg/g），且含量之间均存在显著性差异；白桦脂酸含量再高的为辽宁产区小酸枣仁（2890.23μg/g），与其他品种间均存在显著性差异；齐墩果酸含量最高的为延川产区酸枣（400.95μg/g），与其他品种间均存在显著性差异；熊果酸含量最高的为白家庄酸枣（538.70μg/g），与其他品种间均存在显著性差异。酸枣仁中总三萜酸含量较高主要取决于其中白桦脂酸含量较高，占到三种三萜酸含量总和的95%左右，是齐墩果酸和熊果酸总含量的20倍左右，是大枣和酸枣中白桦脂酸含量的6倍左右，可见酸枣仁中白桦脂酸含量极为丰富，为进一步开发酸枣仁中白桦脂酸这一活性物质奠定了良好的基础。同时也发现核小肉厚的小酸枣仁中三萜酸含量约是核大肉薄的大酸枣仁中三萜酸含量的2倍，可见不同类型酸枣仁间三萜酸含量差异较大，同一类型不同产地之间差异相对较小但都存在显著性差异。

不同品种大枣中白桦脂酸含量最高的为新疆特级骏枣（483.97μg/g），除了与无核小枣差异不显著外与其他品种间均存在显著性差异；齐墩果酸含量最高的也为新疆特级骏枣（184.03μg/g），除了与一级骏枣和一级阜平大枣差异不显著外与其他品种间均存在显著性差异；熊果酸含量最高的同样为新疆特级骏枣（422.28μg/g），除了与一级骏枣、二级阜平大枣和无核小枣差异不显著外与其他品种间均存在显著性差异。同时也发现同一产区同一品种不同级别的特级骏枣和一级骏枣以及一级阜平大枣和二级阜平大枣之间在总三萜酸含量上存在显著性差异。同一产区同一级别不同品种的新疆一级骏枣和新疆一级灰枣之间也存在显著性差异。同一品种同一级别不同产地的三种灰枣，新疆灰枣与库尔勒灰枣之间不存在显著性差异但与若羌灰枣之间都存在显著性差异。

不同产地酸枣中白桦脂酸含量最高的为保定产区酸枣，含量达到523.92μg/g；齐墩果酸含量最高的为延川产区酸枣，含量达到400.95μg/g；熊果酸含量最高的为白家庄酸枣，含量达到538.70μg/g，且三种三萜酸含量与其他产区酸枣间均存在显著性差异。与上文大枣中三萜酸含量相比可见酸枣中白桦脂酸（523.92μg/g）、齐墩果酸（400.95μg/g）和熊果酸（538.70μg/g）含量均高于大枣中白桦脂酸（483.97μg/g）、齐墩果酸（184.03μg/g）和熊果酸（422.28μg/g）的最高含量。考虑可能是由于相比于大枣，酸枣特殊的生长环境更有利于白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸这些酸性物质在枣果内的积累。

育种园新培育的枣品种中白桦脂酸含量最高的为33-jx-8，含量为583.79μg/g；齐墩果酸含量最高的为24-D-48，含量为296.33μg/g；熊果酸含量最高的为49-39，含量为475.93μg/g，均高于大枣中白桦脂酸（483.97μg/g）、齐墩果酸（184.03μg/g）和熊果酸（422.28μg/g）的最高含量，可见新培育的枣品种更加有利于白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的提取，具有很大的开发价值。

由上述结果可知，在大多数大枣、酸枣和酸枣仁中，三种三萜酸含量的排布规律是白桦脂酸含量最高，其次是熊果酸，之后是齐墩果酸，这与高娅等^[17]和胡芳等^[19]的检测结果一致。

3　结果与讨论

（1）本研究建立了一种简单、快速、准确可同时检测不同品种大枣、酸枣和酸枣仁中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的HPLC法。结果显示白桦脂酸含量再高的为辽宁产区小酸枣仁（2890.23μg/g）；齐墩果酸含量最高的为延川产区酸枣（400.95μg/g）；熊果酸含量最高的为白家庄酸枣（538.70μg/g），且不同品种的大枣、酸枣和酸枣仁中三种三萜酸含量存在显著性差异，为选育高三萜酸含量的枣品种和枣果功能性产品的开发奠定了良好的理论基础。

（2）值得注意的是，酸枣和育种园新培育的枣品种三萜酸含量均高于大枣中三萜酸含量最高的特级骏枣，有必要进行深层次的研究讨论以开发新型的功能性产品。另一点值得注意的是酸枣仁中白桦脂酸含量最高达到2890.23μg/g，远远高于普通枣果中白桦脂酸的含量，有很大的市场开发价值。

（3）为了保证枣果中的三种三萜酸能够被完全提取出来，试验比较了不同提取溶剂包括甲醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿等对提取效果的影响，结果显示甲醇、丙酮和无水乙醇提取效果最佳，但考虑到甲醇和丙酮均为有毒试剂不利于长期使用，实验最终选择无水乙醇作为提取溶剂。比较了不同乙醇浓度包括30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%对提取效果的影响，结果显示当乙醇浓度为70%时提取效果最佳。实验还比较了不同提取方式包括浸泡提取、回流提取、索氏抽提、微波提取和超声提取对提取效果的影响，结果显示超声提取相比于其他提取方式不但节省时间、节省溶剂而且提取率更高，因此实验最终选择超声作为提取方式。其他条件还有待进一步研究讨论。

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^*通信作者：牟德华，男，教授，研究方向为农产品加工。E-mail：dh_mou@163.com