二苯乙烯苷标准样品的研制

王尉^1,3，乐胜锋^1,3，林楠^1,3，杜宁^1,2,3，周晓晶^1,2,3，徐双双^1,3，张经华^1,2

（1．北京市理化分析测试中心，北京 100089；
2．全国标准样品技术委员会天然产物标准样品专业工作组，北京 100094；
3．有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京 100094）

何首乌具有增强免疫功能，抗氧化作用，延缓大脑衰老，提高DNA修复功能，延长寿命，降低胆固醇，改善脂肪代谢等多项功能。何首乌的主要成分有羟基蒽醌类（主要为大黄素、大黄酚、大黄酸等葡萄糖苷，均为二苯代乙烯化合物）、醌类、二苯乙烯苷类、酰胺类、色原酮类化合物，卵磷脂，微量元素钙、铁、锌、锰、铜等。其中，二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分，它具有良好的水溶性，且具有多项生理功能，如：抗氧化清除自由基；抗肿瘤；降低胆固醇；抑制动脉粥样状硬化；保护肝脏；具有血管舒张作用；防治老年痴呆；提高记忆等功效^[1-6]。

目前，我国尚无二苯乙烯苷标准样品。为了满足何首乌药材、保健品分析检测及质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备二苯乙烯苷标准样品。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

何首乌提取物（陕西瑞康生物工程有限公司）；蒸馏水（实验室自制）；乙酸乙酯和甲醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（Fisher scientific公司）。LC-20A高效液相色谱仪，配SPD-M20A检测器（日本Shimadzu公司）；TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）；ALPHA 1-2 plus冷冻干燥机（德国CHRIST公司）；UV 1800紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Spectrum400傅里叶变换红外-近红外光谱仪（美国PerkinElmer公司）；1100 Series LC/MSD SL（美国Agilent公司）；500MHz超导核磁共振谱仪（德国Bruker公司）。

1.2　二苯乙烯苷标准样品制备

对何首乌提取物采用高速逆流色谱法（HSCCC）分离纯化，使用乙酸乙酯-乙醇-水（25 : 1 : 25，体积比）体系，收集二苯乙烯苷馏分，旋转蒸发去除溶剂，冷冻干燥后最终得到二苯乙烯苷样品。对二苯乙烯苷样品采用2ml棕色样品瓶分装，分装是在相对独立和洁净空间进行。每瓶10mg，共计得到二苯乙烯苷100瓶，以1—100号计，置于4℃冰箱中长期保存。

1.3　纯度分析方法

色谱柱：Wondasil C18 (5μm, 150mm×4.6mm)；流动相：乙腈-水（体积比17 : 83），流速：1.0ml/min；柱温：30℃；运行时间：30min；检测波长：320nm。

1.4　结构鉴定

采用UV、IR、MS 和NMR方法对二苯乙烯苷进行结构鉴定。UV分析条件：甲醇作为溶剂，扫描范围200～800nm；IR分析条件：KBr压片法，扫描范围400～4000cm⁻¹。MS分析条件：质谱离子源为电喷雾，采用正、负离子模式，喷雾器压力50psi，脱溶剂气为氮气，温度350℃，流量10L/min。NMR分析条件：氘代溶剂为氘代丙酮和重水（D₂O）的混合溶剂，采集¹H NMR和¹³C NMR谱图。

1.5　均匀性、稳定性、定值研究

依据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则（3）标准样品：定值的一般原则和统计方法》^[9]开展均匀性、稳定性、定值研究工作。均匀性：采用单因素多水平试验方差分析法进行纯度均匀性检验，判断二苯乙烯苷的均匀性是否合格。稳定性：将二苯乙烯苷样品避光贮存于4℃，开展12个月长期稳定性的研究。采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，预测二苯乙烯苷的稳定性变化。定值：采用多个实验室协作试验的联合定值方式，分别对随机抽取8个样品进行检测，对所采集的测定结果采用格拉布斯（Grubbs）检验法进行检验，计算二苯乙烯苷标准样品的标准值和不确定度。

2　结果与分析

2.1　纯度分析

采用等度HPLC对二苯乙烯苷样品进行洗脱，DAD 检测器进行全波长扫描，扣除溶剂峰，扫描色谱图未见明显杂质色谱峰。320nm检测波长下，对二苯乙烯苷样品色谱峰进行面积归一化定量，扣除溶剂峰，所得二苯乙烯苷纯度为99.41%。

2.2　结构鉴定

采用UV、IR、MS和NMR等方法对二苯乙烯苷进行结构鉴定，数据如下：：320nm；：3311(-O-H)，1605，1514，1460(Ar)，1255，1066(-C-O)，835(=C-H)；ESI-MS：m/z 429.2 [M+Na]⁺，m/z 405.1 [M−H]⁻。¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。以上数据与文献[7,8]比较，确定该样品为二苯乙烯苷。

2.3　均匀性检验

采用随机顺序重复测量的方法，根据随机数表，分别抽取10瓶样品进行均匀性检验。二苯乙烯苷样品瓶号为19、3、42、78、73、54、37、14、90、93，按照3 种顺序（第1组：19-42-73-37-90-3-78-73-37-93；第2组：93-90-14-37-54-73-78-42-3-19；第3组：3-78-73-37-93-67-19-42-73-37-90）进行测定。分别从每瓶中称取0.25mg样品3份，每份样品分别用1.0ml色谱纯甲醇溶解，按1.3纯度分析方法，以面积百分比读取样品的纯度值。检测数据进行方差分析，以F值检验，确定二苯乙烯苷样品的均匀性数据是否符合正态分布。检验结果见表2。

根据F临界值表，，由于＜，说明制备所得的二苯乙烯苷样品是均匀的。

重复性标准偏差可由计算：。

瓶间方差用下式计算：，瓶间标准偏差是该方差的平方根：。均匀性检验引入的不确定度。

2.4　稳定性检验

将二苯乙烯苷样品于4℃冰箱冷藏避光保存，以一年为期，对制备的二苯乙烯苷样品每3个月取样，按 1.3 纯度分析方法，峰面积归一化法进行纯度计算，每份试样平行测试 3 次，采用 t检验对数据进行分析，稳定性检验结果见表3。

采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测。斜率可用下式计算：

截距由下式计算：

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

取其平方根=0.253%，与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为和（95%置信水平）的分布因子等于3.128，由于 ，故斜率是不显著的，因而未观测到该样品的不稳定性。个月的长期稳定性的不确定度为：。

2.5　定值

采用多个实验室协作定值，参加实验室的数目为8 个。随机抽取16瓶样品，每个定值实验室送2瓶，每瓶平行测定3次。定值实验室将样品配成0.25mg/ml，用高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。对所采集的测定结果，采用Grubbs检验法进行检验，未发现异常值。经过数据统计，计算得出二苯乙烯苷标准样品的标准值和不确定度。定值结果见表4。

总平均值由下式计算：

总平均值的不确定度等于

式中：

制备所得标准样品定值结果的不确定度由以下几部分组成：（1）均匀性检验引入的不确定度；（2）稳定性检验引入的不确定度；（3）多个实验室定值引入的不确定度。

在置信概率为95%时，k=2，则扩展不确定度。

3　讨论

针对我国尚无二苯乙烯苷国家实物标准样品的现状，开展了二苯乙烯苷准样品的研制工作，成功地建立了二苯乙烯苷样品的制备方法。并依据GB/T 15000标准样品工作导则，对制备得到的二苯乙烯苷样品进行均匀性检验、稳定性检验及定值研究，最终申报获批成为国家实物标准样品。

二苯乙烯苷标准样品的标准值为99.43%，扩展不确定度（95%置信区间）为0.20%。该标准样品符合GB/T 15000标准样品工作导则要求，填补了国内该领域研究的空白。二苯乙烯苷标准样品不仅可以满足何首乌及相关产品分析检测、质量控制工作的需求，同时，也为检测结果的准确性、可比性，以及溯源性提供了技术支撑。

参考文献

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[2] Sheng Z, Xu G. Journal of Fudan University (Medical Science), 1998, 25(5): 327.

[3] Mei M Z, Zhuang Q Q, Liu G Z, et a1. Acta Pharmaceutica Sinica, 1979, 14(1): 8-10.

[4] 叶翠飞, 张兰, 李斌, 等. 中国康复理论与实践, 2003, 9(10): 593-595.

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[8] Gen-ichiro N, Naoko M, Itsuo N. Phytoehemrstry, 1982, 21(2): 429-432.

[9] GB/T 15000.3—2008/ISO Guide 35:2006. 标准样品工作导则(3) 标准样品定值的一般原则和统计方法[S].

作者简介：王尉，男，助理研究员，Tel：010-58717639，E-mail: wangwei_1217@126.com