自制硅胶柱分离提纯混合对照品-GC法测定辽细辛中3, 5-二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚的含量研究

盖崴，高虹，刘征雨

（辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心辽宁省分析科学研究院，沈阳 110015）

辽细辛挥发油主要成分为3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚（safrole）和甲基丁香酚。目前，对辽细辛进行质量评价的主要手段是用GC-MS法确定辽细辛挥发油中的成分^[1,2]。在对主要有效成分甲基丁香酚和有毒成分黄樟醚的同时测定上研究^[3,4]很少。而且黄樟醚是易制毒，对照品不容易买到，所以，很多报道都是用面积归一法测定其相对含量，或者用单一对照品，测定黄樟醚对其相对峰面积进行定量。由于细辛中成分较为复杂，面积归一化法及相对峰面积法都无法实现其准确定量。本文利用通过气液相连续萃取^[5,6]，自制硅胶柱分离提纯的3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚，制得3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚的混合对照品，实现了细辛中3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚的同时测定。

1　实验部分

1.1　试剂及仪器

1.1.1　实验仪器

气液相连续萃取塔，自主研发，专利号：200420070324；GC-4000A气相色谱仪，北京东西电子分析仪器有限公司；电子天平BSA124S，赛多利斯科学仪器有限公司；离心机，上海安宁科学仪器厂；超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司。

1.1.2　试剂及样品来源

正己烷、二氯甲烷、丙酮（天津康科德科技有限公司）色谱纯；对照品：3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚混合对照品（自制）；样品：辽宁省新宾县辽细辛培植基地人工种植辽细辛（全），2009年9月采收。粉碎过100目筛，装袋密封后置于干燥器中备用。

1.2　实验方法与结果

1.2.1　混合对照品的提取

本实验运用气液相连续萃取法提取辽细辛挥发油，通过自制硅胶柱进一步分离杂质提纯得到3,5-二甲氧基甲苯、甲基丁香酚和黄樟醚混合对照品。

气液相连续萃取样品制备方法是依托于我单位具有自主知识产权的“气液相连续萃取塔”（图1）建立起来的一种样品制备方法。气液相连续萃取样品制备方法提取的挥发油中几种主要成分的含量均比药典法提取的要多。

1.2.2　混合对照品的含量

本实验提取的混合对照品中3个组分之间分离度较好，同辽细辛挥发油中其他组分之间分离度较好，见图2和图3。完全满足定量分析辽细辛挥发油中3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚3种成分含量的要求。经过计算3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚3种组分的总含量占混合对照品的73.96%。混合对照品储备溶液在室温下密封放置两周稳定性良好。

1.2.3　色谱条件

安捷伦HP-INNOWAX石英毛细管柱（30m×0.53mm）；柱温130℃；气化室温度260℃；载气为氮气；氢火焰离子化检测器（FID），检测器温度280℃；进样量2.0μl。

1.2.4　实验方法

精密称定样品粉末约1g，置于50ml离心管中，移取4.0ml丙酮，超声提取30min后放入离心机离心10min，取上清液置于10ml容量瓶中，再移取4.0ml丙酮于离心管中，超声提取30min后放入离心机离心10min，合并上清液于10ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀。取上清液过0.45μm有机相微孔滤膜，取滤液1.0μl注入气相色谱，记录色谱图。

取2.0ml混合对照品储备溶液，置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀释至刻度，摇匀。吸取1.0μl注入气相色谱仪，结果见图4，记录峰面积积分值。按外标定量法计算样品中3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚的含量，见图5。

2　结果与讨论

2.1　供试品溶液的制备

2.1.1　提取溶剂的考察

精密称取样品粉末3份，每份约1g，分别置于50ml离心管中，分别精密移取4.0ml丙酮、二氯甲烷、正己烷，密封。超声30min后，放入离心机离心10min。取上清液至10ml容量瓶中，再分别移取4.0ml丙酮、二氯甲烷、正己烷于离心管中，密封。超声30min后，放入离心机离心10min。合并上清液于10ml容量瓶中，分别用丙酮、二氯甲烷、正己烷稀释至刻度，摇匀。提取液过0.45μm有机相微孔滤膜，取滤液2.0μl注入气相色谱进行分析（n=3）。结果见表1，根据考察结果提取溶剂选为丙酮。

2.1.2　提取方法的考察

精密称取样品粉末4份，每份约1g，分别置于50ml离心管中，分别精密移取4.0ml丙酮，密封。分别采用超声15min，超声30min，以及超声30min两次和超声30min三次，取提取液过0.45μm有机相微孔滤膜，取滤液2.0μl注入气相色谱进行分析（n=3）考察。结果见表2。

根据考察结果供试品溶液的制备方法为：精密称定样品粉末约1g，置于50ml离心管中，移取4.0ml丙酮，超声提取30min后放入离心机离心10min，取上清液置于10ml容量瓶中，再移取4.0ml丙酮于离心管中，超声提取30min后放入离心机离心10min，合并上清液于10ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀。

2.2　线性关系的考察

混合对照品储备液：精密称取31.8mg混合对照品，置于10ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀。混合对照品储备液浓度为3,5-二甲氧基甲苯0.67mg/ml，黄樟醚0.77mg/ml，甲基丁香酚0.91mg/ml。

精密移取混合对照品储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀释至刻度，摇匀。各吸取1.0μl注入气相色谱仪，记录对照品的峰面积，结果见表3。

以混合对照品3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚进样量（mg）为横坐标，峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图6。

线性回归方程分别为：3,5-二甲氧基甲苯Y=8×10⁸X−4014.9(R²=0.9995)，线性范围为0.000067～0.000335mg；黄樟醚Y=8×10⁸X+726.2(R²=0.9997)，线性范围为0.000077～0.000385mg；甲基丁香酚Y=9×10⁸X−3534.4(R²=0.9996)，线性范围为0.000091～0.000455mg。

2.3　精密度试验

取2.0ml混合对照品储备溶液，置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀释至刻度，摇匀。吸取1.0μl注入气相色谱仪，重复进样5次，3,5-二甲氧基甲苯峰面积积分值的相对标准偏差为0.95%，黄樟醚峰面积积分值的相对标准偏差为1.25%，甲基丁香酚峰面积积分值的相对标准偏差为1.85%，结果表明本方法精密度较好。

2.4　重现性试验

精密称取样品粉末5份，每份约1g，按1.2.4方法制备成供试品溶液，分别取1.0μl注入气相色谱仪，按外标法定量计算样品中3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚的含量，见表4。

5份样品中3,5-二甲氧基甲苯含量相对标准偏差为1.90%，黄樟醚含量相对标准偏差为1.60%，甲基丁香酚含量相对标准偏差为1.64%，结果表明本方法重现性良好。

2.5　稳定性试验

取供试品溶液，在配制后0,4,8和24h于同一色谱条件下分别取1.0μl注入气相色谱仪，记录峰面积，见表5，结果表明样品溶液在室温24h稳定。

2.6　加样回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末5份，每份约1g，精密称取混合对照品加入其中，每份约15mg，按1.2.4制成供试品溶液，分别取1.0μl注入气相色谱仪，按外标法定量计算样品中3,5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚的量，结果见表6～表8，结果表明本方法回收率较好。

3　结论

方法学验证用自制硅胶柱分离提纯混合对照品-GC法测定辽细辛中3,5二甲氧基甲苯，黄樟醚和甲基丁香酚的含量，精密度RSD分别为0.95%、1.25%、1.85%，重现性RSD分别为1.90%、1.60%、1.64%，加样回收率分别为99.16%、94.99%、102.57%；HPLC法测定辽细辛中3,5二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚的含量，精密度RSD分别为1.77%、1.07%、1.39%，重现性RSD分别为1.98%、2.52%、2.21%，加样回收率分别为95.07%、94.30%、98.26%。结果令人满意。

参考文献

[1] 周长征, 杨春澍, 等. 中国药学杂志, 1999: 12.

[2] 施文奎, 施勃. 连续萃取塔, 中国专利, 20042007032, 2006-5-17.

[3] 刘玉红易进海, 等. 药物分析杂志, 2012: 5.

[4] 段鹤君, 付朝晖, 等. 中药材, 2010: 4.

[5] 杜成智, 陈玉萍, 等. 中国实验方剂学杂志, 2011: 7.

[6] 潘红亮, 欧阳天贽, 等.食品科学, 2011, 10

作者简介：盖崴：男，助理研究员，Tel：13840450477, E-mail: gaiwei0305@163.com