第五节　有关物质的检查与鉴定

药物中特殊杂质或有关物质主要采用色谱技术进行分离与检查，并结合联用技术进行鉴定研究。有关物质检查研究是药物质量控制的重要部分，可以为药物的生产工艺优化、质量研究与控制、稳定性考察、药理毒理及临床研究等提供重要的参考依据。所以，药物中有关物质的检查研究直接体现药物的生产和控制水平。

一、有关物质的研究要求

根据ICH的要求，药物中表观含量在0.1%及其以上（或者等于或高于表3-1中的鉴定限度）的杂质，以及表观含量在0.1%以下的具强烈生物效应的杂质或毒性杂质，均要求进行定性分析、鉴定结构。这些杂质一般包括药物合成中的有机杂质和稳定性试验中的分降解产物，即药物中的有关物质。

对药物中的有关物质进行研究与鉴定，可以获得杂质的结构信息，分析其形成机制；以便：①优化生产过程（原料药的合成工艺与精制纯化条件，制剂的处方、相容性和加工工艺），尽量避免有关物质的形成；②优化设置贮藏条件，减少分降解产物的产生，使它们的含量达到合理的限度水平要求。

即使是仿制药品，在其研制和生产过程中，也必须研究其杂质谱与原研药品的一致性。如出现新增杂质，应按上述ICH的基本要求进行全面研究，制定适宜的检查控制项目。

多组分药物中共存的异构体，或抗生素多组分，一般不作为杂质检查项目。必要时，这些共存物质可在质量标准中规定其比例，以保证原料药的质量一致性。

　　　示例3-18　硫酸庆大霉素中“庆大霉素C组分”（C₁、C_1a、C₂、C_2a）相对比例的检查

　　　示例3-19　头孢泊肟酯中 “异构体”A和B的检查

但当共存物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。例如，单一对映体药物中，可能共存的其他对映体，应作为杂质进行检查，并设置“比旋度”或“光学异构体”检查项目；对消旋体药物的质量标准，必要时，则应该设置“旋光度”检查项目。

二、有关物质检查的方法与限度

1.色谱检查法

药物中有关物质/特殊杂质的检查方法，应该专属、灵敏。杂质检查通常应尽量采用现代色谱分离分析手段，主成分与有关物质和强制降解产物均应有良好的分离度；其检测限应满足限度检查的要求；对于需做定量检查的杂质，方法的定量限应满足检测的灵敏度和准确度要求。检查分析方法均需按要求进行方法验证。

有关物质检查研究时，应采用多种不同的色谱分离分析方法或不同测试条件，进行研究比较，并对测定结果进行比对分析，以便选择较佳的方法与条件，满足药品质量控制和标准中相应检查项目设置的要求。

有关物质检查方法的建立，应考虑普遍适用性，所用的仪器和试验材料应当易得。对于特殊试验材料，应在质量标准中明确规定。

在有关物质分析的研究阶段，应使用可能存在的杂质、强制降解的产物，分别或全部加入主成分中，配制供试溶液，进行色谱条件探索、比较和优化，并建立相应的系统适用性要求，保证方法专属、灵敏、准确。必要时，应进行杂质的分离纯化制备或合成制备，以供进行安全性和质量研究。对确实无法获得的杂质和降解产物，应在药物质量研究资料和药物质量标准起草说明中写明理由。

在采用现代色谱技术对有关物质进行分离分析的情况下，对特定杂质中的已知杂质和毒性杂质，应使用杂质对照品进行定位；无法获得对照品时，可用相对保留值进行定位；特定杂质中的未知杂质可用相对保留值进行定位。特殊杂质的含量可按照薄层色谱法（ChP2015通则0502）、高效液相色谱法（ChP2015通则0512）等方法进行测定。

对于立体异构体杂质的检测，可以采用手性的色谱或高效毛细管电泳等方法。 对于立体异构体杂质检查方法的验证，应重点考察立体专属性（选择性）和潜在的手性转化行为。通常，应尽量使立体异构体杂质在主成分峰之前出峰，以利于两者的分离和检测灵敏度的提高。另外，由于手性色谱法不能直接反映手性药物的光学活性，需要与比旋度测定相互补充，以有效控制手性药物的质量。

由于色谱法进行杂质限度检查时，受色谱参数设置值的影响较大，因此，有关操作注意事项，应在起草说明中详细阐述，必要时，可在质量标准中予以规定。

特殊杂质限度的制定，均可以参照本章“残留溶剂的限度要求”中介绍的限度估算方法确定，以保障药品质量可靠、使用安全、疗效明确。

2.杂质含量限度的表示

有关物质检查方法的不同，杂质含量限度结果的表示方法常常也略不同。

杂质的HPLC检查结果表示方法包括：杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、面积归一化法等。通常根据杂质对照品的可及性和杂质限度水平高低的不同进行选取。

　　　示例3-20　ChP2015盐酸大观霉素中有关物质的检查

3.有关物质检查的其他方法

有关物质检查常用色谱法，既可以专属定性，又可以准确定量，被广泛应用。此外，针对一些特定杂质，也可以使用化学、光谱或物理等方法进行检查；这些特殊检查法在色谱法广泛应用之前，也是有关物质检查的重要手段，至今仍然有一些应用。

（1）化学显色法

当药物与其杂质的化学性质相差显著时，可使用与杂质发生专属化学反应的试剂，使杂质反应产生颜色、沉淀或气体，而药物无干扰，从而达到对药物中特定杂质进行半定量限度检查的目的。也可采用滴定法或重量法对杂质进行定量测定。

　　　示例3-21　氯硝柳胺中特定杂质2-氯-4-硝基苯胺和5-氯水杨酸的检查

（2）化学沉淀反应法

当杂质与试剂产生沉淀时，可以采用比浊法控制杂质的限度，也可以采用重量法测定杂质含量。

　　　示例3-22　ChP2015盐酸肼屈嗪中游离肼的检查

（3）化学反应生成气体法

当杂质与试剂反应产生气体时，可以采用相应的气体检查法来控制杂质的限度。

　　　示例3-23　ChP2015对氨基水杨酸钠中硫化物的检查

（4）化学定量反应滴定法

滴定剂只与杂质反应，以一定浓度的滴定液滴定药物中的杂质，可以定量地测定杂质的含量。

　　　示例3-24　ChP2015硫酸亚铁中高铁盐的检查

（5）紫外-可见分光光度法

光谱法依据药物和其杂质对光的选择性吸收差异来进行杂质的限度检查。

如果药物在杂质的最大吸收波长处没有吸收，则可在杂质的最大吸收波长处，测定样品溶液中由于杂质所引起的吸收，从而达到控制供试品中杂质含量的目的。

　　　示例3-25　紫外分光光度法检查苯乙胺类拟肾上腺素药物酮体杂质

（6）红外分光光度法

多晶型药物的不同晶型状态，常常因分子间作用程度的不同，导致不同晶型的红外吸收光谱中某些特征峰的位置、峰形和强度出现特征的差异。利用红外分光光度法对这些差异进行定量测定，可以检查药物中特定的晶型杂质。

　　　示例3-26　甲苯咪唑中杂质A晶型的红外分光光度法检查

（7）原子光谱法

药物中的重金属杂质通常采用原子光谱（AAS，ICP-OES或ICP-MS）技术、标准对照法进行检查。

　　　示例3-27　雷米普利中金属催化剂“钯”的限度检查

一些常见金属元素如铁、锌、铜等，由于测试环境中通常也存在微量的本底含量，所以又常常采用标准加入法控制这些重金属杂质的限度。具体操作为：取供试品，按各品种项下的规定，制备供试品溶液；另取等量的供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照溶液。设对照溶液的读数为a，供试品溶液的读数为b，b值应小于（a－b）。

　　　示例3-28　维生素C中“铜”盐的检查

（8）热分析法

物质在加热或冷却过程中，会发生熔化、凝固、晶型转变、分解、化合、吸附、脱附等物理化学变化，并伴随体系焓（热量的吸收或释放）的改变，而产生热效应。热分析（Thermal Analysis）是在程序控制温度的条件下，精确记录物质的物理化学性质随温度变化的关系，以研究物质在受热过程中所发生的晶型转化、熔融、蒸发、脱水等物理变化，或热分解、氧化、还原等化学变化，以及伴随发生的温度、能量或重量改变的方法。

常用的热分析法为热重分析法（Thermogravimetric Analysis，TG）和差示扫描量热分析法（Differential Scanning Calorimetry，DSC），广泛应用于药物的多晶型、物相转化、结晶水、结晶溶剂、纯度、热稳定性，以及基于相容性的固体分散系统、脂质体、药物辅料相互作用（预测药物与赋形剂间的可配伍性）等的研究。

① 热重分析法　热重分析法是利用热天平在程序控制温度的条件下，测量物质重量随温度变化的曲线（热重曲线，TG曲线）。物质在加热过程中有升华、气化、分解出气体或失去溶剂等时，重量就会发生变化。通过热重分析测得与重量变化相应的温度和程度，可以估算出被分析物在加热过程中，失去的组分特征和失去的量值。TG分析样品用量少，测定速度快。常用于药物中所含水分或溶剂的吸附或结晶状态的鉴定，也适用于贵重药物或在空气中极易氧化药物的干燥失重测定。

　　　示例3-29　USP40中硫酸长春新碱干燥失重的TG测定

② 差示扫描量热分析法　在程序控温条件下，对供试品与热惰性参比物（在测量温度范围内，不发生任何热效应的物质）进行同时加热或冷却时，当供试品发生物理或化学变化时（熔点或分解点等），将使热效应改变，供试品与参比物之间将产生温度差（ΔT）。测量传送给供试品与参比物的热量差（dQ/dT）与温度关系的技术称为差示扫描量热分析（DSC）。

差示扫描量热分析中，可使用α-氧化铝作为惰性参比物，实际测量时，常常直接使用α-氧化铝空坩埚或其他惰性空坩埚作为参比物。仪器应根据操作规程，定期使用标准物质对温度（高纯铟或锌等）进行校准，以保证检测结果的准确性。

DSC适用于测量物质在物理变化或化学变化中焓的改变。如果参比物和被测物质的热容大致相同，而被测物质又无热效应，两者的温度基本相同，此时测到的是一条平滑的直线，该直线称为基线。一旦被测物质发生变化，因而产生了热效应，在差热分析曲线上就会有峰出现。热效应越大，峰的面积也就越大。DSC曲线的各种吸热和放热峰的个数、形状和位置与相应的温度，可用来定性地鉴别待测物质或其多晶型，亦可检查待测物质的纯度，或用于制剂热特征行为研究。

固体有机药物通常具有特征熔点，有些药物则在加热过程中熔融分解同时失重，或由于化学反应产生挥发性物质失重。DSC与TG联合使用，既可以测定药物的熔点验证真伪，又能够根据药物的熔融分降解特性确定药物的受热稳定性。

　　　示例3-30　培哚普利的热分析试验

三、特殊杂质研究的策略

药物中的微量特殊杂质，大都首先使用现代联用技术检测和分析解析，推测其可能的结构；并结合药物的合成工艺路线、化学反应机制等，分析杂质的引入环节，推定或确证它们的结构。

当然，必要时应当尽可能制得它们的单体对照品，进行全面的色谱和光谱测定，并解析确证它们的结构。

药物特殊杂质（有机杂质）的制备，通常有两种方法：分离纯化制备法和合成制备法。在获得足够量的情况下，可以对特殊杂质进一步进行安全性评价和质量控制研究，为药品质量标准指标的制定提供参考依据。

（1）杂质对照品的分离纯化

当药物中待鉴定杂质的含量较大或者采用适宜的强制降解方法可选择性提高相应杂质的含量时，可以使用制备色谱法进行分离纯化，得到特定杂质，然后再通过色谱和光谱分析确证结构。

（2）杂质对照品的合成制备

当样品中的杂质量较小，且杂质的分离纯化较为困难时，可以设计适宜的合成路线，选择性地合成杂质对照品，通过比较供试品中未知杂质与合成杂质对照品的色谱和光谱特征，判断未知杂质与合成杂质对照品是否完全一致，从而确证杂质的结构。

特殊杂质的研究涉及药物开发研究各方面的协调配合。它包括原料和/或制剂的工艺过程研究、分析方法的开发和选择、工艺杂质和分降解产物的分析和结构鉴定等。杂质结构的准确鉴定，还需要色谱分离与有机光谱综合分析，以及研发相关人员从不同技术角度密切配合的分析讨论，才能有效完成，从而保障质量控制的科学性和先进性。特殊杂质的具体研究策略流程如图3-10所示。

四、特殊杂质鉴定实例

泊马度胺[4-氨基-2-（2，6-二氧代-3-哌啶基）-1H-异吲哚啉-1，3（2H）-二酮，分子式为C₁₃H₁₁N₃O₄，分子量为273.24]是在沙利度胺的结构基础上加以修饰合成（图3-11）研发成功的免疫抑制剂，其具有更强的抗血管新生、抗肿瘤、抗炎症反应和抗骨髓瘤作用。其特殊杂质采用联用鉴定和合成杂质对照品对照法进行鉴定。

1.联用鉴定

针对供试品中潜在的中间体杂质和分降解杂质，建立了适用于杂质HPLC-MS联用鉴定的挥发性流动相梯度HPLC条件。

（1）色谱条件

采用Inertsil ODS-SP（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（90∶10）为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱（A∶B）：0min（100∶0）→5min（100∶0）→25min（50∶50）→30min（20∶80）→30.1min（100∶0）→40min（100∶0），流速1.0mL/min，柱温35℃，进样量20μL，检测波长240nm。

（2）特殊杂质的高分辨TOF/MS母离子准确质量鉴定

采用ESI正离子检测模式。喷雾电压3.5kV，雾化氮气275kPa，氮气流量8L/min，加热毛细管温度350℃，碎片电压135V，参比离子m/z 121.0508（嘌呤，[C₅H₅N₄]^＋）和922.0098（氟代膦嗪HP-921，[C₁₈H₁₉O₆N₃P₃F₂₄]^＋），质量数扫描范围m/z 100～1500。

（3）特殊杂质的二级质谱碎片离子鉴定

采用ESI正离子检测，二级质谱扫描子离子模式。喷雾电压5kV，雾化氮气压310kPa，辅助雾化气气压10kPa，加热毛细管温度350℃，二级质谱CID氩气压力0.2Pa，能量20eV。

（4）测定结果

供试品溶液及其强制降解样品溶液的HPLC分析色谱图如图3-12所示（供试品溶液的浓度均约为0.2mg/mL）。根据测得的各杂质ESI质谱高分辨母离子的准确质量，可以鉴定各杂质的元素组成；根据测得的各杂质母离子的二级质谱裂解碎片，可以鉴定各杂质的主要结构单元和（或）基团。综合解析分析，可以推测它们的结构。鉴定结果见表3-5。

2.泊马度胺及典型特殊杂质的质谱解析

首先，针对泊马度胺及已有中间体杂质，进行质谱测定与解析分析，总结与母核结构或类似结构特征相关的裂解规律，可为未知杂质结构的推断提供依据。

其次，对泊马度胺供试品进行检测，识别含量超过限度规定的特殊杂质，并进行初步的结构分析推断。

然后，对泊马度胺进行强制性降解试验并进行液质联用分析，对降解试验中含量明显增加的杂质进行归属与结构解析推断，用以验证或推测原料药中所含的或潜在的杂质来源。

（1）泊马度胺

泊马度胺的质谱测定及裂解途径分析对于解析确证其有关物质具有参考意义。

图3-14表明，ESI-TOF/MS测得泊马度胺[M＋H]^＋的准确质量为274.0754，与离子式[C₁₃H₁₂N₃O₄]^＋相应。其[M＋H]^＋二级质谱的主要碎片m/z 246、229、201、163、145和84，分别与泊马度胺[M＋H]^＋中性丢失CO（246）、HCO-NH₂（229）、HCO-NH-COH（201）、2，6-二氧代哌啶部分（163和145）、羰基与4-氨基-异吲哚-1，3-二酮共同丢失部分（84）的结构相应。

（2）有关物质6（E）和7

图3-15表明，ESI-TOF/MS测得有关物质6（E）的[M＋H]^＋准确质量为292.0859；与离子式[C₁₃H₁₄N₃O₅]^＋相应，该离子式与泊马度胺相比，元素组成与增加了H₂O，与泊马度胺的水解相应。其保留时间（t_R＝13.77min）与泊马度胺的相比，在反相HPLC条件下，保留时间更短，表明其极性比泊马度胺的极性更强。其[M＋H]^＋二级质谱的特征碎片离子m/z 275、274、247、246、229、201和84，除高质荷比区域的脱氨（292－275）和脱水（292－274）中性丢失的碎片离子，其他大都与泊马度胺的碎片离子相同。

由此推测，有关物质6为泊马度胺结构中二酰氨基的水解产物。泊马度胺结构中存在2种二酰氨基单元。故采用定向合成制备对照品，确证有关物质6与有关物质E对照品的色谱和质谱特征一致。故确证有关物质6为已知杂质E。

同时测得，有关物质7的离子组成、[M＋H]^＋二级质谱的特征碎片，均与有关物质6一致，并且色谱保留时间相近。故推测有关物质6和7为同分异构体。它们分别确证为：泊马度胺结构中2，6-二氧代-3-哌啶环中酰胺键的不同羟基化水解产物。

3.有关物质13（F）的对照品制备与验证

泊马度胺的合成粗品和极限条件下的影响因素试验均表明，供试品中有关物质13的含量较高。故对其首先进行了联用鉴定，初步推测其结构（图3-16）；然后，通过制备色谱获得单体进行了主要光谱鉴定确证结构；最后，分析合成工艺路线确证其反应机制，并合成确证。

（1）有关物质13的联用鉴定

ESI-TOF/MS测得有关物质13的[M＋H]^＋的准确质量为419.0919，与离子式[C₂₁H₁₅N₄O₆]^＋相应，该离子式与泊马度胺的相比增加了C₈H₃NO₂，结合合成工艺路线（图3-11），初步推测该有关物质与泊马度胺结构中4位芳伯氨基的进一步氨基邻苯二甲酰化[即：形成4-氨基-1H-异吲哚啉-1，3（2H）-二酮单元]相应。

保留时间（t_R＝24.47min）与泊马度胺的相比，在反相HPLC条件下保留增强，表明其极性与泊马度胺相比更弱，并与上述结构单元增加，分子结构极性减弱相应。

其[M＋H]^＋二级质谱的特征碎片离子m/z 391、374、346、308、265和84，均与泊马度胺结构中4位芳伯氨基的进一步的氨基邻苯二甲酰化[即：生成4-氨基-1H-异吲哚啉-1，3（2H）-二酮单元]相应。

（2）有关物质13的色谱制备对照品确证

有关物质13的结构在上述推测的基础上，进一步使用制备色谱分离富集该杂质对照品，并经光谱测定（图3-17），解析确证。

结果表明，与泊马度胺的¹H-NMR谱相比，有关物质13的NMR谱中，增加了1组化学位移明显向低场移动的三取代苯环质子共振峰，结合NMR相关谱测定与分析，可确证有关物质13为泊马度胺4位氨基的进一步3-氨基邻苯二甲酰化的产物。

（3）有关物质13的合成对照品确证

根据合成工艺路线，缩合反应制备的泊马度胺仍然具有伯氨基特性，过量的3-氨基邻苯二甲酸可与泊马度胺进一步缩合而成副产物4-[4-氨基-1H-异吲哚-1，3（2H）-二酮-2-基]-2-（2，6-二氧代-3-哌啶基）-1H-异吲哚-1，3（2H）-二酮（图3-18），等。

本品通过加入过量的3-氨基邻苯二甲酸起始物料，合成制得了有关物质13的单体（杂质F），并进行了色谱和光谱测定确证，为其合成工艺优化和质量控制提供了参考依据。