第三章　生物靶标在哮喘领域的研究进展

生物靶标又称为生物学标志物，在疾病研究方面，通常是指可供客观测定和（或）评价的一个生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。目前，生物学标志物已广泛应用于临床基础科研的各个领域。但随着医学的发展，对疾病研究的不断深入和个体化治疗的重视，寻找和发现特异度和敏感度更高的新型生物标志物已经成为医学研究的迫切需要。在此，笔者对哮喘相关生物学标志物的分类和应用以及新型生物靶标进行初步探讨，旨在增加临床医师以及研究者对本领域进一步的了解和重视。

一、支气管哮喘生物学标志物研究的必要性

支气管哮喘（简称哮喘）是一种严重的全球健康问题，这种慢性气道疾病可累及不同国家、不同年龄的人群，重者可致人死亡。哮喘是一种气道慢性炎症、气道高反应性，反复发作的可逆性气道阻塞为特征的疾病。目前哮喘的诊断主要依靠病史采集、临床症状和肺功能的检查，更大程度的依赖于临床医师的“经验”。然而，临床症状和肺功能检测可能无法反映潜在的气道炎症。目前，临床实际工作中监测气道炎症的手段有限，支气管镜活检和支气管肺泡灌洗被认为是评估气道炎症的金标准，但在临床实际工作中太过侵入性，且患者很难接受。另外，哮喘的发病机制复杂多样，临床表现也不尽相同，表现出明显的异质性。因此，需要无创性、重复性好的反映哮喘气道炎症的生物学标志物，以确定哮喘有关的临床表型，优化诊断，并指导治疗。

近年来，由于生物学标志物可靠地反映了气道炎症、多种病理情况及治疗效果，另外有低侵入性、操作简单等优点，支气管哮喘生物学标志物的研究呈逐渐增长的趋势。

二、生物学标志物的分类

哮喘生物学标志物的分类多种多样，按照来源可分为血清（浆）标志物、尿液标志物、痰液标志物、灌洗液标志物和呼出气标志物，按照标志物功能可分为系统生物学标志物、气道炎症标志物和新型标志物等。本文按照生物学标志物的功能分类对其进行叙述。

（一）系统性生物学标志物

1.血嗜酸性粒细胞

通过对血液嗜酸性粒细胞的检测可为哮喘临床前瞻性试验和观察性研究患者的分类作依据，也可用于临床哮喘免疫和药物治疗效果的检测。

哮喘病人外周血中嗜酸性粒细胞数目并不总是升高。无论是成人或儿童，外周血嗜酸性粒细胞数目与临床症状和肺功能均有相关性，并且成人外周血嗜酸性粒细胞数目还与气道高反应性程度以及日呼气流量峰值变化有关。因此，外周血嗜酸性粒细胞数目可以反映成人和儿童患者疾病活动性。

2.血总IgE和过敏型IgE水平

过敏原进入机体诱导产生特异性IgE，IgE结合到肥大细胞和嗜酸性粒细胞，使机体进入对该过敏原特异致敏状态，当过敏原再次接触时，与细胞膜上的IgE受体结合引起一系列生化反应，继而释放出如组织胺等各种与过敏反应和炎症有关的生物活性介质，从而诱发哮喘气道阻塞症状（见彩图1-3-1）。

（1）血清总IgE水平与年龄呈高度的相关性，过敏性婴儿血清总IgE水平高于同年龄段普通婴儿，之后随年龄增长IgE水平逐渐下降。并且，哮喘患者血清总IgE变化与肺功能呈弱相关。但不同个体间血清总IgE浓度范围较广，某些哮喘患者总IgE水平与健康人存在重叠，因此将血清总IgE作为哮喘患者的标志物还缺乏特异性。

（2）相比总IgE，过敏原特异性IgE水平更有助于过敏性哮喘的诊断以及确定过敏原种类，从而进行针对性治疗。并且，通过检测皮肤和血清中过敏原IgE还有助于哮喘发病的预测和评估。有研究证明，血清中猫、狗和尘螨特异性IgE升高的3岁儿童，在5岁时哮喘的发病率要升高1.5倍。因此，对过敏原特异性IgE超标的儿童应进行治疗，以降低过敏性哮喘的发病率。

备注：检测方法：FEIA、ELISA和放射变应原吸附剂试验。参考范围：<0.35KU /L（FEIA法）。

3.骨膜蛋白（periostin）

骨膜蛋白编码基因为POSTN，是由IL-4和IL-13诱导气道上皮和肺成纤维细胞产生的一种细胞外基质蛋白。在哮喘病人气道，骨膜蛋白在细胞黏附、TGF-β产生以及上皮下纤维化过程中扮演着重要的角色。Woodruff等通过基因芯片和实时定量PCR对比哮喘病人和正常人以及哮喘病人治疗前后的上皮细胞，发现POSTN基因在哮喘病人中表达升高，经糖皮质激素治疗后表达下降。随后，多项研究表明骨膜蛋白参与到哮喘炎症和气道重塑的分子生物学信号通路中。在最近的一项研究中，Joseph R.Arron等发现血清骨膜蛋白水平可作为哮喘病人体内嗜酸性粒细胞活动度的生物学标志物（图1-3-2、图1-3-3）。

4.超氧化物歧化酶（SOD）

越来越多的研究证据表明，氧化应激反应在介导哮喘发生、发展过程中起到重要作用。受各种内源性或外源性因素刺激的气道上皮细胞和趋化到肺部的炎性细胞释放出活性氧和活性氮自由基（ROS/RNS），引起细胞膜脂质和核酸蛋白等大分子的氧化损伤，并进一步促进气道炎症反应和其他病理生理改变。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，起到对抗氧化应激反应，维持机体氧化/抗氧化平衡的重要屏障。

研究证实，哮喘患者肺内SOD活性下降，当哮喘急性发作时SOD活性进一步下降。在哮喘小鼠模型和哮喘患者中均有证据表明，SOD活性的下降与气道重塑相关。此外，二手烟暴露与肺功能下降等也可以使血清中SOD的活性降低。

Comhair研究组研究了74例非重症哮喘受试者、40例重症哮喘受试者和20例健康对照者的SOD活性，结果显示哮喘患者体内SOD活性下降，并且与肺功能下降呈正相关，提示SOD活性测定可能作为哮喘患者总体氧化应激的一种敏感和定量的功能性指标（图1-3-4）。

5.尿白三烯E4（LTE4）

LTE4等正二十烷类产生于过敏性炎症相关的各类细胞，包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。尿液LTE4应该在样本留取24小时内检测，检测方法为质谱法。

尿液LTE4是肺半胱氨酰白三烯活性的直接标志物。尿液LTE4升高主要见于哮喘急性发作和支气管激发试验阳性哮喘患者。并且LTE4与病程、肺功能和血嗜酸性粒细胞数目相关，病史超过12年的患者尿液中LTE4水平明显高于刚发病者。美国国家卫生研究所（NIH）推荐其用于区分哮喘表型，如阿司匹林敏感型、成人发病型或嗜酸性粒细胞型哮喘。

备注：参考值：<50ng/ml

6.溴酪氨酸（BrY）

酪氨酸是蛋白质氧化的主要位点之一。在氧化应激反应时，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞中的过氧化物酶（MPO和EPO）将酪氨酸氧化为溴酪氨酸。因此溴酪氨酸可反映与过敏和炎症相关的组织损伤程度（见彩图1-3-5）。

（二）气道炎症标志物

1.呼出气一氧化氮（FeNO）

NO是人体呼出的气体中的一种固有成分，称为呼出气NO，主要由气道上皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞中的一氧化氮合酶合成。而气道发生炎症时，炎症细胞内可诱导NOS大量合成，导致FeNO在呼出气体中含量上升，且呼出气一氧化氮上升水平与炎症反应呈正相关。

嘱所有患者在测定前一小时内禁食、禁水，无主动和被动吸烟，无剧烈运动。且本测试需安排在肺通气功能检查或支气管激发试验之前进行。测定前向病人解释测定过程中呼吸方法并观看录像。待病人平静后坐下，先排空肺中的气体，夹鼻，然后用口含紧滤器，以缓慢稳定的速度深吸气以保证过滤除去外源性NO。然后引导患者呼气并保持呼气压力维持在稳定范围，呼出气流速度要求控制在50ml/s。标本收集的平台时间自动选择在呼气中期的3秒，测定结果仪器以ppb（百亿分之单位，Parts Per Billion）表达。

呼出气一氧化氮主要反映呼吸道炎症，因此哮喘患者呼出气一氧化氮明显升高，经糖皮质激素治疗后其水平降低。呼出气一氧化氮检测为无创性，易为患者接受且安全性较高，可以用于儿童和重症哮喘患者（见彩图1-3-6）。

2.呼出气冷凝物成分分析

呼出气冷凝物（EBC）是收集患者呼出的气体到冷凝管中，然后对其成分进行分析，是近年来出现的用于评价气道炎症及氧化应激程度的新型手段。其检测指标主要有pH和花生四烯酸代谢产物等。

患者呼出气冷凝物（EBC）中pH可以反映哮喘患者气道酸化情况。健康人EBC中pH在7.5～7.7范围内，但是哮喘急性发作者EBC中pH显著下降至5.5～6.0，并且某些哮喘患者EBC pH与痰中嗜酸性粒细胞数目、总硝酸盐/亚硝酸盐以及氧化应激相关联。

呼出气冷凝物（EBC）的pH检测在经过多年的重复操作中显示了很好的稳定性，没有受到季节因素的影响，但是并不能准确反映患者的临床肺功能。

呼出气冷凝物（EBC）检测的标记物中与疾病的严重程度和治疗效果相关联的是过氧化氢、白三烯、8-异前列烷、硝酸盐和亚硝酸盐。

研究中的各种炎性介质浓度都非常低，因此需要高度灵敏的分析方法。这就限制了呼出气冷凝物（EBC）在临床应用的有效性和实用性。此外，呼出气冷凝物（EBC）中检测的生物标记物与支气管肺泡灌洗液中生物标记物并不相关联。未来的研究应该着眼于标准化的采集程序，敏感的分析验证方法，并建立标准的参考值。

3.痰细胞分类计数

诱导的痰液裂解、离心、涂片、染色，之后以类似的方法对组织活检、细胞染色，来比较二者炎性细胞的差别。我们手动计数400个细胞（嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，上皮细胞等），算出不同的炎性细胞所占的百分比。

正常人嗜酸性粒细胞所占百分比的上限是1.9%，但是哮喘患者嗜酸性粒细胞的比例可能会上升7倍，在吸入糖皮质激素治疗后，嗜酸性粒细胞的比例降至正常水平。该项技术已被用于区分嗜酸性粒细胞型与中性粒细胞型哮喘，但应用于吸入糖皮质激素控制的重症哮喘患者与中性粒细胞型哮喘患者的痰细胞分类数很难区分（见彩图1-3-7、见彩图1-3-8）。

4.痰上清液检查

除了细胞分类以外，痰上清液中多种蛋白质检测在哮喘的诊断中具有一定价值。尿激酶纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂在哮喘患者痰上清液中含量升高，而神经激肽A在哮喘急性发作时显著上升。Saha等测定痰和支气管组织中IL-13水平，结果发现IL-13在哮喘患者痰中含量升高，但是并不是所有患者均是如此，而且痰液IL-13水平和哮喘严重程度上没有关系。除此之外，骨桥蛋白、血管生成素、VEGF等多种蛋白质陆续被证明与哮喘的诊断和病情变化相关。

（三）新型生物学标志物

1.哮喘的转录表型

诱导痰化验是目前检测哮喘患者气道炎症最简便的无创性手段之一，人们可以通过对痰液内的细胞进行计数和分类进行哮喘表型的判断。近年来，研究者们试图通过不同哮喘患者体内基因表达的差异对哮喘表型进行新的划分。

在最新一项研究中，Baines等提取哮喘患者痰液中的RNA进行序列分析，发现可以根据RNA含量的不同将入组哮喘患者分为3类：TAP1、TAP2和TAP3。

Baines团队还对这3类哮喘患者的临床数据进行分析，发现TAP1、TAP2和TAP3组患者肺功能、痰中炎性细胞和FeNO之间存在差异，因此认为基因表达不同可以作为划分不同哮喘人群从而针对性治疗的依据（图1-3-9、表1-3-1）。

2.microRNA

microRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。microRNA长度约18～25个核苷酸，具有发夹结构，能够与特定基因转录而来的mRNA分子3′UTR端相结合，阻碍mRNA的翻译或直接使mRNA降解，这种特定性结合的结果就是导致基因的沉默。microRNA调节方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因，与肿瘤的发生发展、炎症反应以及细胞的凋亡与分化等密切相关。研究表明，microRNA不但可作为哮喘诊断和病情检测的特异性标志物，还可通过对特定microRNA水平的调控达到治疗哮喘的目的。

Lu等发现，miR-21在小鼠哮喘模型的呼吸道中表达上调，并可通过作用IL-12表达调节过敏性炎症反应。miR-29、miR-126和miR-155可抑制Th2细胞释放IL-4、IL-5、IL-10和IL-13生成，被认为与哮喘气道重塑有关。miR-133a负性调节支气管平滑肌中RhoA蛋白的表达，可降低气管对变应原的高反应性。另外，microRNA还被当做治疗支气管哮喘的靶点。Collison等在尘螨诱导的小鼠哮喘模型中用microRNA抑制剂抑制miR-145水平，可取得与糖皮质激素治疗相似的效果。而上调Let-7（microRNA的一种）可下调过敏性哮喘小鼠Th2细胞中IL-13的水平，从而减轻IL-13依赖的呼吸道炎症。

在最新的一项研究中，Milger和Dehmel等通过Exiqon-LNA实时定量PCR平台对不同年龄段正常、特应性和哮喘小鼠模型血清中microRNA进行检测。结果显示，与正常小鼠相比，特应性和哮喘小鼠模型血清中共有包括mir-146a和mir-29c在内的23种microRNA含量发生变化。而与特应性小鼠相比，哮喘小鼠血清中有7种microRNA含量发生变化。此结果显示microRNA作为一种潜在的极具价值的生物学标志物，可为哮喘疾病早期诊断与治疗提供依据。

3.蛋白组合

澳大利亚的研究人员在一项研究中确定了4种血清中新型生物标志物——触珠蛋白、血液结合素、铜蓝蛋白和α2-巨球蛋白，并且通过不同蛋白测量值的组合可用于哮喘、COPD的鉴别与诊断。

附图：其中3个蛋白在不同疾病患者血清中的水平（图1-3-10）。

附表：触珠蛋白、铜蓝蛋白和α2巨球蛋白等不同蛋白组合后对疾病诊断的价值（表1-3-2）。

（彭丽萍）

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