- 酶工程(第三版)
- 罗贵民 高仁钧 李正强
- 25989字
- 2024-11-03 00:37:53
第六节 非水酶学的最新研究技术
一、非水酶学中的新型反应介质
1.超临界流体系统
所谓超临界流体(supercritical fluid,SCF),是指温度和压力处于临界温度和临界压力之上的流体。它兼有气体的高扩散系数和低黏度,又有与液体相近的密度和对物质良好的溶解能力,在临界点附近流体的这些特性对温度和压力的变化非常敏感。
超临界流体状态下的酶催化反应,是近年来生物工程开拓的新领域。超临界流体作为酶催化反应的介质,对其有着重要的影响。超临界流体能够改变酶的底物专一性、区域选择性和对映体选择性,并能增强酶的热稳定性,同时,酶在不同超临界流体中的活性也存在极大的差异,因此对超临界流体的选择就显得特别重要。通常,超临界流体的选择首先遵循两个最基本的原则:一是酶在超临界流体中必须具有较高的活性;二是超临界流体的临界温度与酶的最适反应温度接近,因为操作温度通常与临界温度接近,温度过高会引起蛋白质变性,使酶失活。同时还必须考虑临界温度和临界压力在实际生产操作中是否易达到,反应底物在该流体中的溶解度,超临界流体对底物、产物和酶的惰性以及对食品和药物无毒等因素。
(1)超临界流体作为酶催化反应介质的优点 酶作为一种催化剂,专一性强,反应条件温和。但工业化较难,没有合适的反应介质是主要问题,因为酶很易失活,反应物和产物又不易分离。目前广泛开展的非水体系酶反应就是为了解决这一难题。超临界流体(如超临界CO2,scCO2)作为一种特殊的非水溶剂,其优点是显而易见的。①超临界体系中传质速率快。底物从主体溶剂向酶活性中心扩散的速度比在有机溶剂中至少大一个数量级。②在临界点附近溶解能力、介质常数对温度和压力敏感,可控制反应速率和反应平衡。③与水相比,脂溶性反应物和产物可溶于其中,而酶不溶,有可能将反应与分离偶合起来。④产品回收时不需处理大量的稀水溶液。
(2)超临界流体的种类和特性 一些常用的超临界体系主要有CO2、水、氨、甲醇、乙醇、戊烷、乙烷、乙烯等。总体而言,超临界流体的属性介于气体和液体之间。其中,超临界CO2(scCO2)作为一种优良的酶催化反应介质是目前研究中最常采用的超临界流体,主要因为其具有以下独特的优点:①CO2不仅临界点容易实现,而且对人体无害及具有化学惰性的优点,因此特别适于酶催化反应的介质;②scCO2既具有液体的密度,又具有气体的扩散性和黏度,因此显示出较大的溶解力和较高的传质性能,从而大大降低酶催化反应过程的传质阻力,提高了酶催化反应的速率;③反应底物的溶解性对超临界的操作条件(如压力、温度)特别敏感,通过简单地改变操作条件或其他设备就可以达到反应物和底物的分离;④由于酶在scCO2中不溶解,易于实现反应分离一体化,从而使其得到工业化应用的可能性大大增加;⑤scCO2的临界温度低,不会使产物热分解,温和的温度适合酶催化反应,甚至可用于含热敏性的酶催化反应之中;⑥scCO2常压下变为气态,不存在溶剂残留问题,而且不易燃、不易爆、廉价易得等等。
(3)超临界流体中酶的稳定性和失活机制 酶在超临界流体中的稳定性和活性对酶催化反应是至关重要的,因此,超临界流体对酶的稳定性和活性的影响一开始就得到了关注。许多研究表明,在scCO2中许多酶具有很高的稳定性和活性。在温度35℃、压力14MPa的scCO2中,Rhizopus arrhizus脂肪酶催化三月桂酸甘油酯与豆蔻酸连续酯交换反应达80h,该酶仍保持100%的相对活性。Miller的实验也得到了相似的结果,在温度35℃、压力12~16MPa的scCO2中,脂肪酶的操作稳定性至少可保持3d。脂肪酶在scCO2和普通有机介质(如正己烷)中的活性和稳定性基本相类似,在40℃、13MPa的scCO2和40℃、常压下的正己烷溶剂中,分别保存脂肪酶6d,其相对活性都是丧失10%左右。许多酶制剂,特别是经冷冻干燥制成的,在其他超临界流体中也具有很高的稳定性。
虽然超临界流体一般不会引起酶失活,但仍需要寻求较合适的温度、压力和含水量等条件以利于酶催化反应的进行。如果操作条件不合适,超临界流体的性质发生变化也会引起酶的部分或全部失活。Chen等人在研究中发现,CO2能抑制多酚氧化酶的活性,这可能是由于CO2溶于与酶有关的水层而改变了局部的pH值所致。超临界状态下,系统中的含水量对酶活性有很大的影响。一方面,由于酶本身具有结构上的刚性,在非水环境中活性部位呈锁定状态,酶需要维持其催化活性的必需水使其具有一定的柔性,以便使活性中心能够更好地与底物契合;另一方面,过量的水分会引起酶活性中心的内部水簇的生成,从而改变酶活性中心的结构,酶构象将过于柔软和伸展,最终导致酶活性的下降。因此可以推测scCO2中肯定有一最佳含水量,此时能维持酶分子表面有适量的水。scCO2是酶催化反应的一种非水介质,但是如果用干的scCO2对酶进行处理,酶活力会逐渐下降甚至丧失;如果scCO2中含水量过高或者催化反应生成了水,湿度增加到一定程度,酶活性也会丧失。Kasche等人报道,scCO2中的湿度为0.03g/mL时,α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶会部分失活,这主要是在卸压过程中,由于溶解于酶周围水分子层中的CO2迅速释放使酶分子结构部分伸展所造成的。
Yoshimuba等人的研究认为,α-淀粉酶经scCO2处理后的活性丧失与蛋白质中α螺旋的含量有关,因为α螺旋结构经scCO2处理后会发生不可逆的变性。Kamat的研究认为,CO2对蛋白质结构的影响主要是高压下由于酶表面的氨基和CO2形成了氨基甲酸酯络合物,增加了酶的刚性。目前认为酸性蛋白酶经scCO2处理后活性的丧失,不仅是由于pH值下降的作用,而且还与CO2分子的辅助络合引起蛋白质结构的不可逆变性有关。
(4)超临界流体中的酶催化反应 用α-淀粉酶和糖化酶可以在超临界流体介质中水解淀粉。传统的淀粉水解包括高温下糊化以及液化、糖化几个步骤。Lee等在用α-淀粉酶和糖化酶水解淀粉时,使用scCO2,省去了传统工艺过程中的糊化步骤。他们试验了2种方案:①整个液化、糖化过程在scCO2中一步进行;②液化过程在scCO2中,糖化过程则在50℃、常压下两步进行。结果发现,在远低于传统的水解温度的条件下,scCO2中一步水解淀粉所得的还原糖的浓度大约为常压下的5倍。而在两步水解反应中,第一步仅在7.5~8.5 MPa的scCO2中水解6h,最终有70%~80%的淀粉转化为还原糖,比用传统的工艺(有糊化过程)水解75h的效果还好,可见使用scCO2具有一定的优越性。
三酰甘油、脂肪酸或者它们的混合物可溶于scCO2中,其溶解度大小与scCO2的密度有关。温度对溶解度的影响是两个竞争因素综合作用的表现,当温度升高后,溶质的蒸气压上升,使溶解度增加;但同时,温度上升引起CO2的密度下降,从而使物质的溶解度趋向于下降,对一定的溶质而言,存在着一个特定的压力,在此压力点以上,溶质的蒸气压(即温度)对溶解度是主要影响因素;在此压力点以下,CO2的密度对溶解度的影响是主要因素,此时,温度有很小的增加,溶解度下降却很明显。scCO2中加入适当的改良剂可以促进物质的溶解,月桂酸在scCO2(15MPa、40℃)中的溶解度为22.1g/kgCO2,但当往scCO2中加入适量的助溶剂乙醇或水后,月桂酸的溶解度明显提高,这是因为乙醇或水的加入提高了scCO2极性的缘故,在三酰甘油混合物中,溶解度较高的三酰甘油也会促进溶解度较低的三酰甘油在scCO2中的溶解。scCO2中酶反应具有很大的优点,特别是酶促酯交换反应进行油脂改性,可望获得高品位的油脂产品,而且产品中不具有溶剂残留的危险,因此它在食品行业中的发展前景良好。近几年来,scCO2中酶促酯交换反应的研究工作已取得长足的进展,但它仍处在基础研究阶段,有关相平衡、反应动力学、传质阻力方面的数据报道还很少,而这些对于工厂的设计和反应条件的控制都极为重要。另外,虽然油脂可溶解于scCO2中,但相对溶解度还很小,如何提高油脂在scCO2中的溶解度也是未来的研究方向之一。
同样的,酶促手性拆分也可以在超临界流体中进行。超临界流体介质下的酶催化反应还可用于手性对映体的合成和拆分。很多的情况下,在超临界流体中进行手性药物的合成比在有机溶剂中的效果更好,有的ee值甚至达到了99%。目前合成和拆分手性化合物的研究主要集中在scCO2和脂肪酶。
另外,在超临界流体介质中可以进行酶促糖脂的合成。研究表明,在scCO2中(50℃,65bar,1bar=105Pa)加入3%(体积分数)的丙酮和少量水(0.3%,体积分数)有助于Novozyme 435催化葡萄糖和棕榈酸的酯合成反应。
(5)超临界流体中酶催化的影响因素 在超临界流体中预测酶的稳定性和活性是十分困难的。因为除了介质的影响以外,还有多种因素对超临界流体中酶的稳定性和活性有影响,例如含水量、压力、温度、增压-减压、抑制剂等。
反应体系中的含水量是影响酶活性的重要因素之一。水通过多种途径影响酶的催化反应:通过非共价键和氢键断裂影响酶结构;通过促进反应物的分散;通过影响反应平衡等。有人研究了N-乙酰苯基丙氨酸甲酯、N-乙酰苯基丙氨酸乙酯、N-三氟乙酰苯基丙氨酸甲酯和N-三氟乙酰苯基丙氨酸乙酯在scCO2中由Carsberg枯草杆菌蛋白酶催化的转酯化反应,重点考察了反应中的含水量对酶活的影响。发现酶需要结合一定量的水分以保持其活性,尤其是在非水相介质的生物催化反应中。而在绝对无水的CO2的超临界流体中,酶分子的结合水可能被夺走。根据温度和压力条件的不同,scCO2可以吸收0.3%~0.5%的水分。如果温度太高就有可能导致酶变性失活。将来自Carica papaya的凝乳蛋白酶置于超临界流体中,在30MPa、不同温度的条件下研究其酶活。在高温下,水分被从酶微环境中萃取走并导致酶活降低。粗蛋白酶含水1.53%(质量分数)。但在CO2超临界流体中,333K条件下仅含水0.99%(质量分数)。如果水作为酶促反应的底物,为使反应继续进行,需要足够的水去平衡反应并补偿因超临界CO2吸水而造成的酶分子失水。可是如果在超临界流体中水分充足或者水是其中的一个产物,则过多的水分也可能使酶失活。在酶催化水解反应中有适量的水存在是很重要的,不仅因为水是一种底物,还为了保持酶的催化活力。
在超临界流体反应介质中,酶的催化活性受压力的影响。例如,压力可以通过改变限速步骤或调节酶的选择性来影响酶的催化反应。如果一种酶在超临界流体中稳定,那么这种稳定性不会因压力增加30MPa而受到影响。但反应速率可能会受到压力的影响。在大多数情况下压力增加会对酶促反应产生积极的影响,但也可能不产生影响。压力引起的酶失活大多发生在压力超过150MPa的情况下,300MPa压力可引起酶的可逆性变性,压力再高就会引起不可逆性变性。由固定化的米黑毛霉脂肪酶催化的油酸酯合成在scCO2中的初始转化率因压力由10MPa升高到35MPa而增加,但其在正丙烷和正丁烷混合物中则恒定。使用超临界流体作为酶催化反应介质的优点是可以通过改变流体压力而使反应物轻易地从混合物中分离出来。底物的溶解度随压力的升高而升高。超临界流体的溶解能力可以根据反应的需要而进行调节。产物可以轻松地从反应器中移走。
温度是影响反应的一项重要参数,其影响力要比压力影响高得多。温度的升高会带来两种效应:反应速率随温度的升高而升高;温度升高造成酶的变性失活。在超临界流体中温度还与压力有着密切的关系。底物和产物的溶解度依赖于温度与压力的联合作用。通常,在超临界流体中,较高的溶解度可通过升高温度来达到。但温度太高又会引起酶失活。基于以上原因,酶活的最适温度与反应的最优温度并不需要一致。在scCO2中以30MPa压力为条件测定由黑曲霉中提取的脂肪酶的酶活,其酶活最高值出现在323K时,当温度进一步上升,酶活会迅速下降。其原因与水分在系统中的分布改变有关。当用同一种酶对葵花籽油进行水解时,其最高酶活同样出现在323K时。但有时也会出现在超临界流体中酶活升高的情况。例如,以猪胰脂肪酶为催化剂,催化正丁酸和异戊醇的酯化反应。在大气压条件下,酶活最高值出现在313K时,而在接近临界条件的丙烷中则出现在323K时。在恒定压力下,升高温度可以增加酶活,这或许只是温度作用,也可能是温度和溶剂的联合作用。酶活受热力因素的影响可能服从Arrhenius曲线。当反应速率最高时,酶的活性和非活性形式之间的比率受酶失活常数的影响。如果酶活的熵值高,则表示其受温度的影响大。
在超临界流体中,一种酶通常要在间歇反应器中重复使用好多次,可能直接使用,也可能固定化后使用。增压通常起不到重要的作用,减压才是影响酶活的关键步骤。在增压减压的过程中还要考虑快速减压会不会使酶结构遭到破坏。慢速减压,流体有足够的时间从酶及反应器中流出,但如果减压太快,则会因流体无法及时从酶中流出而在局部造成相对较高的压力。将Carica papaya凝乳蛋白酶置于二氧化碳超临界流体中,在30MPa、323K恒温下研究其酶活。1h后以3种方法将反应条件恢复至常温常压:①快速减压(1min)至0.1MPa,温度降至283K;②温度降至293K(3min)伴随压力快速(1min)减至0.1MPa;③保持温度305K慢速减压(3min),然后降温至293K。结束后再迅速加压,如此反复数次,观察其对蛋白酶活性的影响。在前10次反应中,用3种方法处理的蛋白酶活性基本相似。14次反应后,用前两种方法处理的酶活性显著降低,而以第三种方法处理的蛋白酶其酶活保留时间最长。因为密度的连续变化,所以由超临界状态向常压状态的变化过程对酶来说是“友好”的。从另一方面来说,当酶进入两相区域,由于密度的改变,酶微环境中的液态气体迅速气化而使酶结构展开,从而导致酶失活。
酶在超临界流体中使用的最简单形式是酶粉,但这不利于大规模的工业应用和自动化、连续化生产。将酶固定于比表面积较大的惰性载体表面,可增大酶与底物的接触面积,降低扩散限制,能更充分地发挥酶的高效催化作用,且有利于酶的回收和再利用,增加酶的热稳定性。酶的固定化方法有多种,如吸附法、包埋法、载体偶联法和交联法等。由于超临界流体具有低黏度和高扩散系数的特性,吸附于载体上的酶不易脱落,可使用最简单、最经济的吸附法。选择合适载体的重要性已被充分认识,许多学者对载体的选择作了大量研究。载体的性质可影响被吸附的酶量,并且能改变底物和产物在酶表面的微环境,影响酶分子上的结合水,从而影响酶的活性。因此,可根据底物和载体的疏水性初步选择适当的载体。另外,还应考虑到载体的表面积、颗粒大小和内部孔径等因素。
(6)展望 超临界流体中研究较多的是脂肪酶,它可用于生物分子的合成与修饰,具有很大的前景。超临界流体中酶反应的另一项感兴趣的应用是通过消旋混合物的拆分或手性合成来生产纯的旋光异构体。相信在不久的将来,作为纯的对映体的药物和农业化肥的生产将大大增加。此外,将开发一些新技术,例如在超临界流体中使用具有更复杂酶体系的完整的细胞。当反应底物和产物必须通过细胞壁输送时,能充分体现超临界流体的高传质能力。超临界流体构建了酶反应介质的又一领域,其开发前景在生化工程中将日益受到重视。
2.离子液体
(1)离子液体简介 与传统的液态物质相比,离子液体只有阴阳离子,没有中性分子。离子键强大的库仑力作用使得晶格上的阴阳离子只能振动却不能转动或平动,所以离子液体常温下一般呈固态,并且有较高的熔点、沸点和硬度。但是,如果把阴阳离子做得很大且又极不对称,由于空间阻碍增大使得阴阳离子间的库仑力减小,晶格能减小了,所以这种离子液体不但可以振动,还可以平动和转动,常温下也呈液态形式存在,并且熔沸点都有所降低。离子液体从物理性质上可以分为固态和液态两类;按阳离子母核的结构类型分可以将常见的离子液体分为四大类,即咪唑盐类、吡啶盐类、季铵盐类和季盐类,如图2-9所示。
图2-9 常见离子液体的有机阳离子母体结构
(四种有机阳离子母体依次为咪唑类、吡啶类、季铵类和季类)
离子液体的阴离子种类繁多,主要有、、TA-(CF3COO-)、HB-(C3F7COO-)、TfO-(CF3SO3)、、TfN-[(CF3SO2)2N-]、、、、、等。离子液体不同的阳离子的物理、化学性质不同,不同的阴离子间理化性质也千差万别,所以不同的阴离子和阳离子组成的不同的离子液体的性质更是各不相同,并且性质种类繁多。通过对组成离子液体的有机离子进行调整和修饰,理论上可以组合成数量巨大的离子液体。
(2)离子液体中蛋白质的构象研究 蛋白质(包括酶分子)在不同离子液体中的空间构象可能会受到影响,目前已经有科研工作者采用一些技术手段研究了离子液体中蛋白质的构象变化(表2-1)。
表2-1 用于研究离子液体中蛋白构象变化的技术
(3)离子液体作为酶促反应介质的优点 水、传统有机溶剂、超临界流体、离子液体等都可以作为酶催化反应的反应介质,但与其他各类反应介质相比,应用于非水酶学酶催化反应领域中的离子液体反应介质有着独特的优点。
首先,离子液体的溶解范围广,溶解度高。因为有机离子和无机离子都可以组成离子液体的阴阳离子,所以它对许多有机物、无机物,甚至高分子材料都具有很好的溶解性,并且有时溶解度很高。其次,离子液体没有显著的蒸气压,被认为是一种绿色溶剂。因为离子液体的正负离子之间有较强的库仑引力,使得即使在较高的温度和真空度下一般也难以挥发。再次,大多数离子液体具有较好的热稳定性,化学稳定性高,一般不可燃,并且可以重复使用多次,易于制备,原料不贵。然后,离子液体对多数催化剂无毒无害,催化剂可以溶解在其中,溶解后若呈单一均相,催化效率会增高;若多相相容,则催化易分离。最后,离子液体使催化剂的活性更高、稳定性更好、选择性更高,使反应产物的转化率提高。因为离子液体多为非质子溶剂,所以溶剂化和溶剂现象大大减少,使得反应的各项指标均有所提高。
(4)酶在离子液体中的特征 绝大部分的酶都可以在离子液体中催化反应,甚至在几乎无水的情况下酶仍能保持很高的催化活性。无论是从理论还是从实践方面来看,研究各种形式的酶能否溶于离子液体,以及溶解后能否保持活性都是非常重要的。具体来讲,前人曾经研究过离子液体作为反应介质的苯基甘氨酸和乙醇的转酯反应。实验中用到了四种形式的CALB,包括游离酶(Novo SP525)、固定化酶Novozyme435、交联酶晶体(CLEC)以及交联酶聚集体(CLEA)。实验结果表明,CALB在离子液体[BMIM][PF6]和[BMIM][TfO]中的活性与在叔丁醇中的情况相似,而在[BMIM][NO3]、[BMIM][lactate]、[EMIM][EtSO4]和[EtNH3][NO3]中几乎无反应发生(转化率<5%)。对于丁酸甲酯和正丁醇的转酯反应的类似研究也出现类似的情况。研究表明,那些酶在其中不表现活性的离子液体一般包含配位能力较强的阴离子,如乳酸根、硝酸根和乙基硫酸根离子。对这一现象的合理解释是这些阴离子与酶(包括游离酶和固定化酶)表面之间的配位引起酶构象的改变,导致其活性的丧失。然而酶溶解于离子液体中引起的结构改变通常是可逆的,故当CALB溶于[BMIM][lactate]、[EMIM][EtSO4]或[EtNH3][NO3]之中24h后,再用缓冲液稀释50倍,几乎可以恢复全部的催化活性。总的来说,酶溶于离子液体中一般会部分失活(即去折叠),但加入水后即可重新折叠并恢复活性。
酶在大多数的有机溶剂中的稳定性比在含水介质中都高,对离子液体也一样。自Erbeldinger等人证明嗜热蛋白酶能在离子液体中表现很高的热稳定性后,又有一些报道证明了酶在离子液体中比在有机溶剂中有更好的热稳定性,如胰凝乳蛋白酶、CALB脂肪酶和嗜热芽孢杆菌酯酶在离子液体中的热稳定性比在有机溶剂中的热稳定性分别高17倍、3倍和30倍。Sheldon等在研究中发现CALB在离子液体[BMIM][PF6]中80℃条件下水浴20h后,酶活性反而增加了20%。作者估计有可能是离子液体形成了一层膜,保护了酶表面水层微环境而使酶稳定,但这个解释还是不能很好地说明酶在与离子液体恒温共浴后活性反而增加。由于水活度也影响酶的热稳定性,Bornseheuer等控制酶和溶剂的水活度后再比较酶在离子液体和有机溶剂中的热稳定性,发现酶在离子液体中的热稳定性仍高于在有机溶剂中的热稳定性。Bornseheuer等人把这种现象归结为离子液体和酶分子间产生电荷作用,而使酶分子呈现刚性结构,从而表现出高稳定性。从已有文献来看,Bomscheuer等的解释似乎更合理一些,但酶稳定性的提高是不是基于离子液体对酶分子的直接作用,还有待对离子液体中酶的构象进行进一步研究。
有关酶在离子液体中进行催化反应时表现出来的催化选择性的报道不尽一致,在一些报道中脂肪酶和蛋白酶在离子液体中表现出比在有机溶剂中高的选择性,有些则报道酶在这两种介质中催化选择性上的区别并不明显,甚至有些在离子液体中表现出有机溶剂中低的催化选择性。Bomscheuer等人用染料的方法评价了一些离子液体的极性,发现酶催化反应的选择性和溶剂极性之间没有任何关联。值得注意的是,除了酶本身具有的对底物的催化选择性外,底物在溶剂中的溶解度也影响了反应的选择性。Kazlauskas等研究了用CALB在离子液体中催化葡萄糖乙酰化的反应,结果发现目标产物6-乙酰葡萄糖与衍生物3,6-二乙酰葡萄糖的比例高达(13~50):1,而在有机溶剂如丙酮、四氢呋喃中这个比例为(2~3):1,Kazlauskas等人认为产生这种现象的原因在于底物葡萄糖在有机溶剂中的溶解度低,而产物6-乙酰葡萄糖在有机溶剂中的溶解度较高,由此导致了衍生物3,6-二乙酰葡萄糖过多的产生,从而引起反应选择性的下降。
(5)离子液体中酶催化反应的影响因素 离子液体的纯度影响反应中酶的活性。离子液体中残留其他离子会影响酶活力,卤素、银盐等都是降低其纯度的离子。比如,一个科研小组认为在[BMIM][BF4]或[BMIM][PF6]中南极酵母脂肪酶B就会失活,但其他小组则通过实验得出相反的结论,这就可能是由于离子液体的纯度不同引起的。另有研究表明,控制好离子液体的合成温度是减少其生成副产物的关键,丙酮稀释和活性炭吸附等方法是离子液体纯化的有效方法。
酶在离子液体中需要少量的水分子维持脂肪酶的空间构象。在“疏水离子液体-酶”组成的微环境中[图2-10(a)],离子液体的疏水作用导致酶周围的水分子层具有比离子液体更高的介电常数,使得水分子不易与酶分离,空间结构稳定。在一定的范围内,离子液体的疏水性越大,水分子与酶的相互作用力越强,酶的空间结构越稳定;但当离子液体的疏水性超过界限值后,酶活性随着离子液体疏水性的增大而降低,原因在于离子液体的疏水性过高会抑制底物与酶分子的相互接触,降低底物在离子液体中的溶解度,阻碍底物与酶分子的相互作用。而“在亲水性离子液体-酶”组成的微环境中[图2-10(b)],离子液体由于本身具有更高的介电常数,从而取代结合在酶表面的水分子,引起脂肪酶的肽链解折叠,最终表现为酶的活性降低甚至失活。
图2-10 疏水性和亲水性离子液体对酶表面微环境的影响
溶剂极性(溶剂化电荷的趋势)现在多被认为是溶剂完全独立的特性,和亲水性不能混为一谈。离子液体被认为是高极性溶剂。离子液体的极性可以根据某些特殊染料如尼罗红、赖卡特染料等在不同极性溶剂中的可见光最大吸收值来测定,也可以通过内荧光检测法或分配平衡常数法来测定。用不同方法得到的结果有所不同,但总体来说,离子液体属于高极性物质,其极性范围在水和某些醇类之间。然而高极性的离子液体并不像高极性的有机溶剂一样使酶失活,相反却能够保持酶的活性和稳定性,因此,离子液体可以用于极性亲水性底物的反应,也可以用于非极性疏水性底物的反应。不过强极性的离子液体能使酸类物质离子化增强,电解出的H+使反应体系的酸性增强,酶在离子液体酸性的环境中比较容易失去活性。由于酶通常以固定化酶或游离态的形式悬浮在离子液体中,因此,这些酶的活性中心的催化作用会受到其内表面和外表面传质速率的控制,而传质速率又取决于反应介质的黏度,因此,离子液体的高黏度是其在生物催化应用中的一个较大的障碍。一般来说,离子液体的黏度要比有机溶剂(如甲苯)以及水的黏度高很多,离子液体的黏度和组成它的阴阳离子相关,另外值得提出的是,离子液体的黏度随温度变化很大。因此,在生物催化反应中可以通过改变反应温度或者振荡速度来减小黏度的影响。
离子液体中的酶催化反应,水含量、反应温度、pH、底物浓度比和酶量等对酶活力也都有一定的影响,另外,不同形式的酶在离子液体中的催化效果也是不同的。
(6)离子液体作为反应介质在酶催化领域中的应用 一般来说,离子液体作为酶催化反应的反应介质的时候,常常是将酶(水溶液、冻干粉、固定化酶或交联酶晶体)直接加入到离子液体中(图2-11)。与传统的有机溶剂不同,离子液体作为反应介质在许多方面优势明显,如具有几乎可以忽略的蒸气压,很高的热力学和化学稳定性,不挥发,并通过改变阴、阳离子的组成调节其黏度、密度以及与水和一些有机溶剂的混合度。作为传统有机溶剂的替代品,离子液体在生物催化和生物转化研究领域具有很大的潜力,但目前应用于该领域的仅仅包括双烷基咪唑或N-烷基吡啶为阳离子的离子液体。Cull率先报道了在[BMIM][PF6]水两相系统中进行的由完整细胞(Rhodococcus R312)催化的1,3-二氰基苯到3-氰基苯甲酰胺的生物转化,在该反应体系中离子液体[BMIM][PF6]充当了底物和产物的“载体”,降低了底物和产物抑制,从而提高了产率,同时以离子液体代替甲苯减少了溶剂对细胞的伤害。根据Lau等的报道,在离子液体[BMIM][PF6]和[BMIM][BF4]中进行的由Candida antactica脂肪酶(CALB)催化的醇解、氨解反应,其反应速率大大地超过在传统有机溶剂中的情况,并且当使用固定化的CALB作为催化剂时效果更好。Kim等人报道了在离子液体[BMIM][PF6]和[EMIM][BF4]中进行的脂肪酶催化的涉及外消旋底物手性拆分的转酯反应,其对映体的选择率比在传统有机溶剂中的情况高至少25倍。
图2-11 (a)离子液体中酶促反应示意图(包括回收以及产物分离)和(b)酶在水不溶的离子液体中
1—水溶液中的酶;2—冻干酶粉;3—固定化酶;4—交联酶晶体
很多酶都可以在离子液体中进行酶促反应,包括脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶以及全细胞生物催化剂等。其中使用最多的是脂肪酶,用脂肪酶催化的反应包括转酯化(醇解)、酯化、动力学拆分手性醇、水解、氨解(酰胺合成)。
用CALB在不同的离子液体中催化丁酸乙酯和1-丁醇的转酯化反应(图2-12),反应速率在与酶不相溶的离子液体中同在叔丁醇中的相当,而在与酶相溶的离子液体中反应速率至少减慢为原来的1/10。起初研究者认为离子液体和酶相溶,可能使酶的结构发生改变,从而导致酶的活性降低。但后来研究发现CALB在与其相溶的[Et3MeN][MeSO4](其中Et3MeN——triethyl methyl ammonium)中并没有使酶的活性降低。由此可见,离子液体是否与CALB相溶,与CALB是否具有活性并不完全一致。
图2-12 丁酸乙酯和1-丁醇的转酯化反应
糖类在反应介质中的低溶解度制约了脂肪酶催化的糖类酯化。在有机介质中,单乙酰代产物较反应物更易溶,使得该产物进一步酰化成二酯。与此不同的是,在[EMIM][BF4]中,CALB催化葡萄糖酯化则具有相当高的选择性,而在另一种[MOEMIM][BF4]中反应更快(图2-13)。这可能是因为55℃时葡萄糖在[MOEMIM][BF4]中的溶解度为5g/L,是丙酮中的100多倍。由此可见,离子液体的溶剂特性可能是影响脂肪酶对糖类酯化反应结果的主要原因。
图2-13 离子液体和传统介质中葡萄糖的区域选择性酰化反应
脂肪酶催化的手性醇的羧化拆分是脂肪酶的主要工业应用方式之一。例如用CALB和PCL脂肪酶在离子液体中拆分芳香基链烷醇(图2-14)。反应中常用乙酸乙烯酯作为酰化剂,常用的离子液体如[BMIM][PF6]、[BMIM][CF3SO3]、[BMIM][Tf2N]。以脂肪酶在离子液体中的催化动力学拆分外消旋1-苯基乙醇为例,反应中脂肪酶表现出高的活性,而且通过蒸馏易分离产品,使催化剂可循环使用。
图2-14 利用脂肪酶动力学拆分手性醇
辛嘉英等人研究了[BMIM][PF6]-水及异辛烷-水中皱褶念珠菌假丝酵母脂肪酶催化萘普生甲酯的不对称水解反应(图2-15)。发现酶的活性在离子液体-水两相体系中与在传统有机相-水两相体系中相比没有明显的变化,但酶的立体选择性有了显著提高。特别是当IL相和水相的体积比为1:1时,酶的活性和立体选择性最好。而且离子液体-水两相体系比传统有机相-水两相体系更安全,同时避免了有机溶剂与水发生乳化。进一步的研究发现,在水饱和的[BMIM][PF6]中酶具有更高的操作稳定性。
图2-15 离子液体中萘普生甲酯的水解反应
由上可见,脂肪酶催化的转酯化(醇解)、酯化、手性醇拆分、水解在离子液体中往往较有机溶剂中的反应速率和选择性高。但脂肪酶催化的酰胺合成在离子液体中的产率却比有机溶剂中低。Lau等用CALB在[BMIM][BF4]和[BMIM][PF6]中催化辛酸乙酯和氨的酰胺化反应(图2-16),辛酸乙酯在离子液体的转化率只有在叔丁醇中的40%~70%。
图2-16 脂肪酶催化辛酸乙酯和氨的酰胺化反应
Lau等在[BMIM][BF4]中以CaLB(Nov435)催化辛酸和60%的H2O2水溶液原位生成过辛酸对环己烯进行环氧化反应(图2-17),在[BMIM][BF4]中能平稳进行,反应24h得到产率为83%,相比在乙腈中为93%。
图2-17 在离子液体中CaLB催化环己烯的环氧化反应
3.超临界CO2-离子液体双相体系
超临界流体和离子液体对许多有机物都有较好的溶解度,目前被认为是许多化学反应和物质分离的绿色介质,而且得到了广泛的应用。二者的有机结合也已引起研究者的极大重视,研究者从理论和应用方面开展了一系列的工作。
(1)IL-scCO2两相体系的特性 体系相行为、分子间的相互作用及热力学性质等是该体系应用研究的基础。Brennecke等研究了6种离子液体([BMIM][PF6]、[C8-MIM][PF6]、[C8-MIM][BF4]、[BMIM][NO3]、[EMIM][EtSO4]、[N-bupy][BF4])与CO2的高压相行为。结果发现在高压条件下CO2在这些离子液体中有很高的溶解度,而离子液体不溶于高压CO2;CO2在离子液体中的溶解度随温度和压力的变化而变化。如40℃、8.495MPa时,CO2在离子液体([BMIM][PF6])中的溶解度以摩尔分数计高达0.698。随着体系温度的升高,溶解度下降。实验还发现,在低压(<8MPa)时,少量水分的存在会大大降低CO2在IL中的溶解度。例如在40℃、5.7MPa时,CO2在无水的[BMIM][PF6]中的溶解度以摩尔分数计为0.54;在被水饱和的离子液体中的溶解度以摩尔分数计仅为0.13。随后该小组又研究了9种常见的气体和水汽在[BMIM][PF6]中的溶解度、亨利常数及其他热力学(溶解焓和溶解熵)性质。相比较而言,CO2有较小的亨利常数,其值为5.34MPa,而O2为800MPa,CO则大于2000MPa。Kamps等也在这方面进行了研究,结果表明:在20~120℃的范围内,CO2在IL中的质量摩尔浓度随压力(小于9.7MPa)的增大几乎呈线形关系增大,并且通过理论计算作了进一步的说明。
离子液体的结构决定了离子液体在常温条件下具有较大的黏度,这也给离子液体的应用带来了很大的限制,但CO2溶于离子液体后,可以较大程度地降低离子液体的黏度。因此,在高压条件下,在离子液体中加入CO2可有效提高离子液体的传质、传热效率。
实际上,IL-scCO2两相体系无论是应用于物质的分离还是化学反应中,都要涉及到多种物质,如反应物、产物等,那么这些物质对体系的相态影响是一个值得研究的课题。吴卫泽等研究了极性溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、乙腈)对IL-CO2相态的影响,结果表明:虽然IL([BMIM][PF6]、[BMIM][BF4])不溶于scCO2,但当体系存在极性溶剂、且极性溶剂在CO2中的含量较高[大于10(mol)%]时,IL在scCO2中的溶解度不可忽略,溶解度随溶剂极性的增大而显著增大,这可能对scCO2从IL中萃取分离反应物或产物造成交叉污染;但非极性溶剂(如己烷)的存在对IL在scCO2中的溶解度可以忽略。Scurto等发现,在一定的温度下,一定组成的[BMIM][PF6]和甲醇溶液,在高压CO2的作用下,该溶液分离为三相,富IL相(下层)和富甲醇相(中层),而最上层为富CO2相。当CO2的压力继续上升时,中间相消失,三相体系转变为两相体系。随后他们研究了压力对CO2和[BMIM][BF4]的水溶液的相态的影响,发现存在着类似的规律。Najdanovic-Visak等研究了高压CO2对水、乙醇、[BMIM][PF6]混合溶液的影响,在一定的CO2压力范围,同样可以观察到三相存在。这一有趣的现象表明用高压CO2可以将IL和有机溶剂(或水)混合液简单地分离;同时也表明CO2、IL和有机溶剂(或水)组成的体系相态是复杂的。吴卫泽等对该三相体系的相组成和存在条件进行了详细研究,并对用高压CO2分离IL([BMIM][PF6])和甲醇的混合溶液的分离系数进行研究,结果表明:降低温度和提高压力有利于分离。对于高压CO2、水、[BMIM][BF4]三组分体系,存在类似的规律。与前面的体系略有不同的是:前者三相存在的压力范围较小,如40℃、在压力6.95~8.21MPa的范围可以观察到三相;后者在3.0MPa到实验装置承受压力20MPa时,均可观察到三相。
(2)IL-scCO2两相体系酶催化反应 近年来利用IL-scCO2两相体系作为酶催化反应介质引起了研究人员的极大兴趣,因为这种两相体系可以充分发挥酶的高活性和绿色分离的特点。IL可以溶解酶从而提高酶的催化活性,超临界CO2作为流动相可以将反应产物带出,实现了低温分离,既不污染环境,又保持了催化剂的活性。IL-scCO2两相系统作为酶催化反应介质为非水环境中酶催化反应的绿色工艺发展提供了新机遇。
(3)展望 超临界二氧化碳和离子液体的结合,充分利用了两者在溶解性和催化反应方面的优点,为开发绿色化学过程提供了新的机遇。超临界二氧化碳可以从离子液体中萃取分离出产物,而且两者不会交叉污染,催化剂留在离子中循环利用。另外,IL-scCO2独特的两相性质可以促使反应的转化率和选择性得到提高。总之,当IL-scCO2两相体系作为溶剂或介质时,其相行为是复杂的,其相态的复杂性势必对IL-scCO2两相体系的应用产生影响。正是由于其性质的复杂性,才预示其应用的广泛性,合理的应用,可以变复杂为有利,从而开辟更为广泛的应用,推动绿色化学快速发展。IL-scCO2两相体系的缺点一是为了使用scCO2需要耐高压的设备,二是人们目前对离子液体的毒性和其他生理影响还不了解。纵观文献,目前对IL-scCO2与其他物质共存时两相体系的相态和热力学性质的研究较少,这将制约该体系的进一步应用,是值得深入研究的一个方面。有些气体,如氢气、氧气、CO等在IL中的溶解度很小,可能影响IL-scCO2两相体系中均相反应的速率。研究新型离子液体或者给离子液体中加入助溶剂来调整离子液体与不同反应物的溶解性,也将是研究的方向之一。
二、非水酶学中的新技术
1.微波技术
“非水酶学”研究领域发现,酶在有机相中催化反应有许多在水相催化中没有的优点,而且许多反应也只能在有机相中实现,这使有机相酶催化反应成为研究热点,但是有机相中的酶催化反应往往反应周期长、速度慢,制约了它在工业上的应用,所以研究者急于寻找一种既不破坏酶活性又能加快反应速率的方法。1986年,Gedye等将微波技术应用于有机化学反应领域,发现微波能加快有机反应的反应速率,之后随着研究的深入,人们发现微波辐射还能加快反应速率、改变反应选择性、减少催化剂用量等。20世纪90年代以来,人们将微波辐射应用于有机相酶催化反应中,希望它在不破坏酶生物活性的前提下提高酶促有机反应的反应速率,结果发现适当的微波辐射优于传统的加热方式,它不但加热速度快,而且对酶催化反应还有提高酶活性和反应速率等促进作用。
(1)微波简介 微波(microwave,MW)是一种频率在300MHz~300GHz之间的电磁波,频率比无线电波高,比红外光波低,介于无线电波和红外波谱之间,波长在1m~1mm的范围内,具有“波粒二象性”。微波有吸收、反射和穿透三个基本性质,对于介质损耗因数大的物质如水等,它们会吸收微波使自身加热;金属则会反射微波;微波几乎是穿透玻璃、塑料,没有吸收。由于微波的独特性质,使得它在微波加热与催化、微波遥感、现代多路通信系统、物质内部结构探索等领域广泛被应用。目前,生物化学领域主要利用微波的辐射特性对物质及反应进行加热。通常,微波的加热频率是2.45GHz(波长是12.12cm),依靠物质吸收微波后将微波的电磁能转化为自身的热能的原理完成加热。生物化学领域中的样品很多都是由水、蛋白质、脂肪、糖类等极性物质组成的,它们在微波高频变化的电磁场作用下,反复快速地改变在电场中的取向从而发生快速转动,分子间摩擦、碰撞的概率增多生热;此外,在微波的作用下,离子会振动加剧,普通分子也会吸收微波能量,增加的动能和微波能随后都会转化为自身的热能,物质热能增加后又不能及时散出,使得物质温度上升从而被加热。
(2)微波加热的特点 首先,由于微波加热是因为极性分子在高频变化的电磁场内快速转动后将动能和微波能转化成了自身的热能,所以它是内源性热源,不同于外源性热源的加热方式,不需要传导或对流。其次,微波加热有快速、全面、均匀等特点。由于微波加热是内源性加热,介质内部和外部几乎是同时被加热,不需要热传导或对流,所以介质被全面均匀地加热,温度也会迅速上升,省去了由外到内热传导的时间。再次,选择性加热物质。物质吸收微波的能力取决于物质的介质损耗因数,两者成正向关系,因数大则吸收能力强,反之,因数小则吸收能力弱。每种物质的介质损耗因数不同,对微波的吸收性也不同,产热效果也不同,所以微波就表现出选择性加热的特点。对于高分子材料、各种气体等非极性介质,其介质损耗因数微弱或者没有,微波对其没有加热作用;对于水等极性介质,它们的介电损耗因数也较大,有很强的微波吸收能力,能被快速均匀地加热。最后,微波加热还有催化作用。微波的催化作用表现为“非致热效应”,有机反应经过微波辐射后,能加快反应的进行,还能提高催化剂的选择性和活性。虽然微波的催化机制至今尚未清楚,但其催化性能已经被广为认同接受。
(3)微波辐射对酶蛋白的影响 在酶催化反应中,抑制剂、溶剂、电磁场或者金属离子及配合物对酶的构象都会产生影响,从而影响酶的催化活性。微波辐射可以用来消解蛋白质,也可以用来加速酶催化反应,而后者是在不损伤酶的一级结构的低功率辐射下进行的。由于酶的催化活性与酶的结构密切相关,因此,研究微波辐射对于酶构象的影响将有助于研究微波在微波偶合酶促反应中的非热效应。
有研究发现,微波辐射下酶的稳定性比常规加热下的酶稳定性高,且在极性较强的溶剂中,微波辐射比常规加热更具优势,酶的稳定性可达常规加热下的6倍。微波辐射的时间、功率及酶促反应体系对酶的结构和活性有重要影响。高频电磁场的作用下,酶分子构象的变化使活性部位裸露,易于与底物结合,但过长时间或过高频率的微波辐射会破坏蛋白质的二级结构。热效应达到一定程度时,酶分子动能使基团的振动能增加,破坏酶的立体构象,活性下降。另有研究表明微波辐射可以导致蛋白质二级结构发生变化,使其β折叠的含量增加,α螺旋结构亦变得混乱,使蛋白质的有序结构无序化。通过对比同样温度下经微波辐射预处理过的酶液和经常规热处理的酶液的荧光强度可以发现:经微波辐射或者常规加热预处理过的酶,波峰的位置未变,而其荧光波峰的强度发生了变化。波峰的位置未变说明微波辐射或者常规加热并没有导致酶结构中发色基团结构的改变,荧光强度变化是因为发色基团含量的变化,由此可推测酶的蛋白部分经微波辐射后更加“裸露”。这在一定程度上也可以解释微波辐射后酶活增加的原因之一可能是由于“裸露”的酶蛋白能更好地与底物接触。
微波辐射可以提高固定化米赫根毛霉脂肪酶在有机溶剂中催化辛酸和丁醇的酯化反应初速度,而微波辐射可以增强醇与酶的亲和力,但是对微波辐射下LRI的构象变化不甚明了。众所周知,酶的活性部位与底物的诱导契合是酶催化的先决条件。由于不同底物、溶剂的物理性质不同,受物理场的影响也不同,对酶的作用程度可能也不相同。由于微波对物质极性的敏感性,酶蛋白构象在不同环境下(例如不同功率微波、不同溶剂、不同底物)受到微波辐射的影响也一定不同。酶蛋白分子的内源荧光强度与发射峰位置的变化在一定程度上可揭示酶分子肽链的伸展及构象变化,特别是揭示酶蛋白分子裸露程度的变化;而酶蛋白分子的适度裸露对酶与底物的契合是很重要的:适度的酶蛋白分子更加裸露有利于酶蛋白分子更好地与底物结合,从而加快反应速率;过度的裸露使酶的结构过于松散,可能会破坏酶特有的疏水袋结构,有利于竞争性副反应的发生。
(4)微波辐射-酶偶合催化技术 微波辐射-酶偶合催化(microwave irradiation-enzyme coupling catalysis,MIECC)技术是一种将微波辐射和酶催化两种催化方法结合起来在生物催化反应中一同使用的新型催化方法,此方法一方面利用了微波的“致热效应”和微波辐射伴随的“非热效应”,另一方面也可以发挥酶独有的催化作用。酶是一种高效催化剂,它具有催化速率快、用量少、反应条件温和等特点,而且一定条件下的微波辐射对酶没有负面影响。微波辐射能改善酶的“微环境”,从而可能提高酶催化的专一性和催化速率。酶分子及其周围的微环境在微波场中经过微波辐射后,被加热的速度比周围介质更快,在酶表面微环境处形成了“活化点”,此外,微波辐射增强了酶的活性中心和底物的诱导和定向作用,底物的反应基团与酶的活性中心更加接近、结合更加紧密,所以微波提高了酶的选择性和酶活力。此外,微波还可以防止催化剂中毒,延长催化剂的寿命,提高催化剂的机械强度。
①微波辐射对酶稳定性的影响 微波辐射能够影响脂肪酶Novozym435在有机介质中的稳定性。以丁酸乙酯和丁醇的酯交换反应为模型,在酶促反应前(储存条件下)和反应中(反应条件下)分别施行微波辐射和常规加热。两种情况下微波辐射下酶的稳定性均高于常规加热模式下的。其中不同底物(丁酸乙酯或丁醇)中微波辐射对酶稳定性的影响并不相同,在强极性底物(丁醇)中微波效应更为明显,微波辐射下酶的稳定性是常规加热下的6倍。作者认为极性溶剂能更好地耦合微波能量,改变了酶与其微环境的相互作用,增加了酶的稳定性。而在无底物条件下,微波辐射和常规加热对酶稳定性的影响基本相同。
②微波辐射对酶催化反应初速度的影响 多聚半乳糖醛酸、木聚糖、羧甲基纤维素经微波预辐射后,其反应初速度提高了1.5~2.3倍。电镜分析显示:微波辐射后,底物形态的改变使其易于与酶结合从而使反应初速度提高。微波辐射下固定化脂肪酶Novozyme 435催化合成脂肪酸酯的反应初速度比常规加热模式下的初速度提高了2.63倍。在微波辐射辅助催化枯草杆菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在不同温度不同溶剂中的酯交换和酯化反应时,反应初速度增加2.1~4.7倍,微波辅助加热和常规加热下的酶促反应初速度都随溶剂的lgP的增加而增加。
Parker等考察了角质酶在微波辐射和常规加热下催化丁醇与丁酸乙酯的酯交换反应。结果显示微波加热对酶催化反应初速度的影响与酶所处的微环境有关。在不同温度下,初始水活度为0.58和0.69时,微波辐射增加反应初速度2~3倍;而在初始水活度为0.97时,微波辐射条件下的反应初速度却相应低于常规加热条件;这种微波辐射导致较低反应初速度的效应是可逆的。
将枯草杆菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶置于六种不同溶剂中在不同温度下催化酯交换和酯化反应,微波辐射可使得反应初速度增大2.1~4.7倍。两种加热模式下的反应初速度均随溶剂的lgP的增加而增大(苯为溶剂时例外),但不同溶剂中两种加热模式的反应初速度比(vm/vc)不同,且vm/vc与溶剂的lgP无明显的相关关系。作者将微波辐射与pH调节和盐活化等方法结合来探讨其综合效应。结果显示这三种方法结合的反应初速度最大,大于单纯pH调节和单纯微波辐射等方式所得的初速度。
与常规加热相比,微波辐射下固定化脂肪酶Novozyme 435催化有机相中合成脂肪酸酯的反应初速度提高了2.63倍。两种加热模式下反应活化能并未改变,作者将微波促进反应归结为微波辐射下分子间的有效碰撞增加。
③微波辐射对酶催化反应选择性的影响 微波辐射改善酶周围“微环境”的情况下可能会提高酶催化的专一性。微波辐射会加强酶活性中心与底物的诱导和定向作用,利于酶与底物的结合,提高了酶促反应的专一性和催化效率。微波辐射还可降低某些反应的活化能或熵函数,从而改变了酶的催化专一性和立体选择性。Zarevucka等在微波辐射下,通过反向水解法和转糖基,酶促合成了烷基β-D-吡喃葡萄糖苷和烷基β-D-吡喃半乳葡萄糖苷,发现微波辐射能够提高酶催化的区域选择性。Bradoo等和Vacek等研究了微波辐射和常规加热两种加热模式下不同酶的酶催化反应时发现,两种加热模式下的酶促反应具有相似的底物选择性。微波作为一种化工领域广泛应用的技术,可以大大提高合成速率,加速酶促反应进程,虽然其中的具体原理还有待进一步的研究,但加速反应速率已得到公认,尤其是微波与相关技术的结合,已成为研究的热点。
对微波辐射提高酶催化反应的对映选择性这一行为可初步解释为:微波辐射可以改善酶的“微环境”,从而可能提高酶催化的专一性。酶催化体系经过微波辐射后,增强活性中心的立体结构与相关底物基团的诱导和定向作用,使底物分子中参与反应的基团与酶活性中心更加相互接近,并严格定位,使酶催化反应具有更高效率和专一性。而且微波同时也是一种电磁波。其交变电场对蛋白质等极性分子的洛伦兹力作用,会强迫其按照外加电磁场作用的方式运动,从而迫使反应向生成某一构型产物的方向进行;另外,微波辐射降低了某些反应的活化能或熵函数,从而改变了酶的催化专一性和立体选择性。
Bradoo等发现不同脂肪酶在催化不同甘油酯和不同甲酯的水解反应以及不同脂肪酸和甲醇的酯化反应时,微波辐射和常规加热下脂肪酶表现出相同的底物选择性。Vacek等用四种固定化酶催化丁醇和不同脂肪酸的酯化反应,也发现微波辐射条件下的反应产率高于常规加热下的,另外,微波辐射条件下四种酶的底物选择性与常规加热下的并无明显差别。
Zarevucka在微波辐射条件下通过葡(萄糖)基转移作用和反向水解法,用酶催化选择性合成了烷基β-D-吡喃葡萄糖苷和烷基β-D-吡喃半乳葡萄糖苷,发现微波辐射可以提高酶催化的区域选择性。以正辛酸与甘油为底物,利用1,3专一性的脂肪酶(Novozyme 435)在无溶剂条件下催化甘油和十辛酸的酯化反应。通过考察不同水含量、不同配比以及不同加热方式下各产物量的变化来探讨微波对该反应的区域选择性的影响。发现实验范围内各种条件下的微波辐射均削弱了Novozyme 435的1,3专一性。
有人研究了微波辐射条件下酶促葡萄糖基的转移反应。实验结果表明,微波辐射相对于传统加热条件,酶催化有机合成的选择性大大提高,反应时间明显缩短,酶催化效果更好。
(5)微波和离子液体联用技术 目前微波催化是国际上研究辅助催化手段的热点之一,由于其加热速度快、提高反应速率和选择性、节能高、污染小等特性,备受学者关注。在生物体的新陈代谢过程中,作为生物催化剂的酶起着关键作用。在生物体内,酶催化的化学反应十分复杂,但是不同于普通的化学催化剂,酶催化反应时有高度的选择性、反应条件温和、催化效率高。微波和生物催化剂联合使用催化反应的方法即微波辐射-酶耦合催化法在生物化学领域中得到极大的应用。微波技术作为一种新型绿色技术已经广泛应用于化学反应的辅助催化领域,而离子液体也被看作是绿色溶剂,在非水酶学酶催化领域也崭露头角,微波技术和离子液体的联合使用更为非水相酶催化领域开辟了新途径。微波技术要发挥其加热效应和催化效应必须要求介质为电介质,而离子液体有较高的极化潜力、较高的微波能吸收率,这使得微波技术能应用于离子液体。另外,离子液体独特的优点,如没有显著的蒸气压、热稳定性好、物质在其中的溶解度高,使得离子液体优于其他传统的微波吸收介质,可以与微波协同使用。微波辅助离子液体法能发挥两者各自的优点,为非水酶学酶法催化反应开辟新途径。
于等人选择了Novozym 435催化拆分(R,S)-2-辛醇和Novozym 435催化合成脂肪酸甲酯这两个酶催化转酯反应作为研究对象,考察了微波和离子液体对酶催化转酯反应的影响。通过比较四种条件下的酶活力和选择性,即无离子液体传统加热、有离子液体传统加热、无离子液体微波加热和有离子液体微波加热四种条件,证明了微波和离子液体对Novozym 435催化的转酯反应有协同促进作用。随后又筛选得到了微波和离子液体条件下的最佳反应条件,还研究了该条件下酶的热稳定性和重复利用性,结果表明Novozym 435和离子液体在微波条件下均具有较好的稳定性和重复利用性。通过研究,证明了微波和离子液体对Novozyme435催化的转酯反应有协同促进作用,为酶催化反应提供了一种新的催化手段。
孙国霞等在成功构建离子液体共溶剂体系的基础上,采用微波辐射代替传统加热方式,考察了微波辐射效应对酶催化芦丁选择性水解产异槲皮苷的酶促效率的影响。微波辐射温度30℃、微波辐射时间5min、pH9.0时,[Bmim][BF4]反应体系的芦丁转化率为89.18%、异槲皮苷得率为84.74%、槲皮素得率为2.79%,反应时间从原来的10h缩短为5min,反应效率提高了120倍,显著降低了生产成本。他们所构建的微波强化离子液体共溶剂选择性水解芦丁产异槲皮苷的新体系显著地提高了转化率、得率和反应效率。
陈格等考察了微波辐照下离子液体共同冻干的脂肪酶在有机溶剂中催化α-硫辛酸的立体选择性的酯化反应。他们发现微波辐射技术能够大幅度地提高酶促拆分α-硫辛酸的催化效率,并且离子液体共同冻干的脂肪酶在微波下具有良好的重复使用性。他们的实验结果也进一步证明了微波和离子液体联用技术有助于提高非水介质中酶催化反应的催化效率。
2.超声
超声波作为一种机械能量形式,可以改变物质的组织结构、状态、功能,适宜强度的超声可以在不破坏细胞的情况下提高整个细胞的新陈代谢速率,而高强度的超声作用于细胞时,会使细胞内含物失活或细胞破碎。另外,超声波作为一种能量传播形式,具有效率高、价格低、无污染、易获得等优点,可将能量释放到介质中,从而使介质中的分子产生物理变化和化学变化,因此也可以引发或强化机械、物理、化学、生物等过程,提高这些过程的质量和效率。因此,目前超声技术已经广泛应用于工业、农业和医药等领域。近年来,人们把超声技术与酶催化技术结合起来进行研究,利用超声波产生的物理能量作用于酶分子,使酶分子的构象发生改变,从而影响其催化活性。这在一定程度上反映了声学技术向生物技术领域的积极渗透,使两个研究领域交叉融合,从而对这个边缘学科的发展造就了强大的生命力。
(1)超声技术在非水酶学中的应用 目前利用超声技术对酶进行处理主要有两种方式:一种是超声预处理,即首先在超声介质中对酶进行超声处理,酶干燥后再在反应介质中催化酶促反应;另一种是直接对反应介质中的酶进行超声处理,超声处理同酶促反应同时进行。
邱树毅等比较了固定化脂肪酶Lipozyme经超声作用预处理后,再置于恒温振荡反应器中进行振荡反应与未经超声作用预处理振荡反应两种情况下脂肪酶催化反应的转化率,他们发现超声作用后振荡反应比未经超声作用而直接振荡反应的固定化脂肪酶在反应12h的转化率约高了1.68倍。显然,经超声作用预处理后固定化脂肪酶的催化活性大大提高。吴虹等在研究超声作用下的酶促废油脂转酯反应的过程中也报道了反应前对酶进行超声预处理能在一定程度上缩短酶被激活所需的时间,并使其充分激活,从而加速酶催化反应。他们推测其作用机制是由于超声预处理一方面促进了Novozym 435活性中心三元复合物“盖”或“罩”的打开,减少了酶被激活所需的时间,另一方面疏通了酶内扩散的传质通道,有助于高黏度的油脂扩散到酶的活性位点。同时,他们还发现超声预处理时间对Novozym 435催化废油脂转酯反应也有一定的影响,并且认为超声预处理过程需要一定的时间才可以达到激活固定化酶或疏通内扩散的孔道的目的。
大量的研究表明,不管采取何种方式,适宜的超声可以提高酶的催化活性,加速有机相中的酶促反应。林家立等发现超声辐射作用可以使猪胰脂肪酶在催化萘酚衍生物的转酯反应中的反应速率提高83倍。宗敏华等发现超声辐照能显著地加速有机相中脂肪酶促有机硅醇与脂肪酸的酯化反应,在超声辐照条件下的固定化酶Lipozyme的反应转化率为对比实验的4.5倍。他们比较了超声作用对固定化酶和游离酶的促进作用的差别,发现超声辐射对固定化酶的促进作用远远大于对游离酶的作用,他们认为两者的差异是由于固定化酶反应的控制步骤是内扩散,而超声所产生的声流可疏通固定化载体内部的通道,加速底物及产物分子的运动,故强化了内扩散,从而使酶反应速率有较大幅度的提高;超声辐照对悬浮在有机介质中的游离酶粉催化反应的促进作用主要是由于酶粉颗粒的分散度提高,增大了酶与底物接触的比表面积所致。邱树毅等在研究固定化脂肪酶催化正辛烷中1-三甲基硅-1-丙醇与脂肪酸的酯化反应时,发现当酰基供体为戊酸,超声作用比振荡反应在3h的酯化反应转化率高约4倍,而当酰基供体为辛酸时,超声作用比振荡反应在3h的酯化反应转化率高约3倍。可见超声作用对非水介质中酶催化反应的促进作用是十分明显的。
大量的研究表明有机溶剂的疏水性是影响超声作用下酶稳定性的重要因素,介质疏水性越强,反应体系中的酶分子抗超声变性能力越强。如刘耘等发现,在相同功率的超声处理下,以四氢呋喃作为介质时,脂肪酶的活力损失较大;在甲苯中,酶失活现象不明显;在正己烷和正辛烷中,酶的相对活力反而提高到了106.3%和111.5%。他们推测,可能是由于酶在疏水性强的有机介质中具有较大的刚性,不易发生构象变化而失活的缘故。然而疏水性有机介质并不总是最合适的反应介质,因为溶剂还能够直接或间接地与底物和产物相互作用,影响酶的活力。Yong-mei Xiao等在研究酶促糖脂合成的时候发现在超声辐射的作用下吡啶是最适反应介质,他们推测是由于糖是一种亲水性底物,在疏水性比较强的反应介质中溶解性不理想,从而使酶分子与底物分子相互碰撞的机会大大降低,因此导致酶活性降低。
超声作用下酶在非水介质中的催化活性与体系含水量也有很大的关系。如刘耘等用水含量分别为0%、1%、2%、5%和10%的四氢呋喃作为超声介质,他们发现在脱水的四氢呋喃中,经超声辐照60min,酶活力损失24.6%,随着四氢呋喃含水量的增加,脂肪酶活力急剧下降,当含水量为10%时,酶活力仅存4.8%。因此,当利用超声作用提高酶在有机介质中的催化反应效率时同样需要严格控制反应介质中的含水量。
超声波对反应的影响不仅取决于反应介质的含水量及有机溶剂的性质,而且与超声条件有很大关系。Tadasa等发现反应体系中脂肪酶的催化活性在很大程度上依赖于超声作用强度。邱树毅等的研究结果表明在超声作用频率为20KHz的条件下,一定范围内,超声作用输出功率愈大,则固定化脂肪酶催化酯化反应的催化活性越大。吴虹等发现当超声输出功率小于80W时,酶促转酯反应速率随超声功率的提高而增大;当输出电功率进一步提高到100W时,已经有部分Novozyme 435出现变性失活。目前普遍认为,在较低强度的超声作用下,超声强度同酶活力呈正相关;随着强度的增大,酶逐渐被激活,强度越高,酶的催化活力越高。若进一步加大强度,酶开始变性失活,酶催化活力也开始降低,超声强度越高,失活率越高。刘耘等研究有机相中Lipozyme进行超声辐照处理时,发现连续超声时间对酶活力也有一定的影响。在其他条件相同的情况下采用60s/30s和120s/30s两种作用方式和30s/30s方式进行比较,可以发现Lipozyme的活力随着连续超声辐照时间的延长而大幅度提高,在120s/30s的形式下,相对酶活力高达247.7%。
(2)超声的作用机制 实际上,有关超声对酶促反应的影响的研究还处在萌芽阶段,对超声作用于酶促反应的机制的研究将十分有助于推动超声技术与非水酶学的进一步结合。
目前一般认为,超声对酶促反应的作用主要包括机械传质作用、加热作用和空化作用等三方面的作用。机械传质作用是指超声作为弹性介质中的一种机械波使介质中的质点进入振动状态增加了质点的振动能量。加热作用是指超声在介质中传播时,其能量不断地被介质吸收,转变成热能,从而使介质的温度升高。空化作用则是指超声激活介质中的气泡。酶的反应速率主要取决于两个因素:传质效率和酶分子的构象。超声通过机械传质、加热和空化三种作用影响着这些因素。
胡松青等的研究证实,适宜的超声作用可降低溶液的黏度和表面张力。一般来说,超声产生的机械传质作用和加热作用能够增加底物分子与酶分子的能量,使其运动性加强,相互间碰撞的概率增大;同时也能够加强介质与酶之间的传质扩散过程,所以能够提高酶的催化活性。另外,当超声作用于酶分子时,超声释放的能量可能导致酶分子的空间构象发生变化,从而影响到酶催化活性的变化。较低强度的超声处理可引起酶分子构象的微小变化,使酶分子的超微结构更具柔性、更合理,表现出较高的催化活性。然而在较高强度的超声作用下,酶分子的能量进一步加大,构象进一步改变,趋向不合理的构象,导致酶分子本身的催化活力受到阻碍,表现为酶的失活。
超声作用下产生的振动的气泡的周围界面有利于介质中的底物分子进入酶活性中心,也有利于产物分子进入介质,从而提高了酶促反应速率。另外,超声使反应生成的水再分配,避免了新生成的水在酶分子表面形成较厚的水化层而影响底物分子和产物分子的传质。在较低强度超声下产生稳态空化作用,这种空化作用较为缓和且有规律,形成的空化泡可使其周围的酶分子受到微流产生的切力的作用,也许对疏通酶内外扩散的传质通道有利。较高强度的超声则会产生瞬态空化作用。高强度的超声产生的空化作用激烈而短暂,称为瞬态空化。当瞬态空化产生的空化泡崩裂时,会产生5000℃以上的高温和50000kPa的高压,导致大量自由基的产生,同时在均相液体介质中伴有强大的冲击波,在非均相介质中伴有射流。高能量的自由基将直接攻击酶分子,使酶分子发生化学变化,使酶活力下降甚至失活。而酶分子在强大的冲击波或射流的作用下,分子结构容易被破坏甚至被剪切成小碎片而表现出活力下降甚至失活。超声处理能提高有机溶剂中酶的活力,其原因可能还有:①超声作用使酶的有效表面积增加;②持续的超声作用会导致有机溶剂中少量水分子的重新分布,阻止了酶分子周围水膜的形成。
将超声作用处理过的酶制剂用扫描电镜观察(图2-18),可以发现超声作用可以使悬浮于有机溶剂中的酶制剂更加细小,因此大幅度提高了酶制剂的表面积,不但可以降低底物和产物的扩散限制,也可以大幅度提高酶活。
图2-18 (a)超声以前;(b)超声处理后
另有研究表明,超声作用可以在一定程度上改变酶制剂的二级结构,从而改变了其空间构象,最终影响了其立体选择性和催化活性。
三、寻找和改造耐有机溶剂的酶
1.耐有机溶剂菌的发现
一般认为有机溶剂对微生物具有极大的毒害作用,但Inoue和Horikoshi发现了一株可以在高浓度甲苯中存活的恶臭假单胞菌,改变了人们对微生物生存能力的认识。耐有机溶剂微生物具有多样性的适应调节机制(如溶剂泵出系统、细胞膜快速修复机制、细胞膜低溶剂渗透性和增加细胞表面亲水性等),因此可以生存于高浓度的有机溶剂中。
目前已报道的耐有机溶剂微生物多为革兰氏阴性菌,其中很大一部分属于假单胞菌属,近年来也报道了不少耐有机溶剂革兰氏阳性菌,如杆菌、葡萄球菌、红球菌和节杆菌等菌属。这些发现不但扩大了耐有机溶剂微生物种类的多样性,也为有机相生物催化剂的选择提供了更为广阔的来源。
2.非水相耐有机溶剂微生物的全细胞生物催化
非水相耐有机溶剂微生物的全细胞生物催化也属于非水酶学的范畴,具有不需要添加昂贵的辅酶、同时实现多步的偶合催化和制备方法简单等优点。特别是将其应用于有机相生物催化以及有机溶剂污染物的降解上,利用耐有机溶剂微生物进行的全细胞催化具有显著的优势。
(1)水-有机溶剂单相体系中的全细胞生物催化 在水-有机单相体系中,经常使用的有机溶剂多为亲水有机溶剂,包括二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇和甲醇等。在反应过程中由于底物能溶解于反应体系中与催化剂(微生物细胞)充分接触,不存在任何传质障碍,可以大大提高反应效率。Wang等在微生物催化11-脱氧皮甾醇-21-乙酸酯制备氢化可的松的过程中加入12.5%(体积分数)1,2-丙二醇以增加底物的溶解度。
(2)水-有机溶剂双相体系中的全细胞生物催化 水-有机溶剂双相体系是目前全细胞生物催化中运用最广泛的方法。与水-有机溶剂单相反应体系相比,微生物细胞在该体系中可以大幅度减少与有机溶剂接触的机会,从而降低有机溶剂对微生物细胞的伤害。理想的水-有机溶剂双相反应体系是高浓度的底物溶解于有机相中,而微生物细胞存在于水相体系中。在反应过程中底物从有机相中缓慢的分配到水相中或在两相界面进行反应,此后生成的产物又被萃取到有机相中,避免产物在水相中的积累,从而大大提高了产物的生成率,同时可以简化产物的纯化方法,但传质速率往往成为限制这种反应的重要因素。
甾体类化合物的水溶性极低,而易溶于有机溶剂,所以采用双相催化体系可以大大提高该类底物的反应浓度。如Suzuki等利用一株耐二甲苯的Pseudomonas putida ST-491菌在20%(体积分数)二苯醚的双相体系中催化转化石胆酸(lithocholic acid,LCA),生成固醇类激素的前体化合物,其转化效率可以达到60%,产率比不加有机溶剂的反应体系增加了9倍。与单相反应体系相比,水-有机双相更适用于有毒底物或产物的催化转化,因为在反应过程中有毒的底物或产物大多存在于有机相,从而减少了细胞的伤害,同时也可以提高转化的浓度和效率。利用耐有机溶剂微生物双相发酵制备靛蓝(indigo)是一个非常典型的例子。耐有机溶剂Acinetobacter sp.ST-550能有效转化吲哚制备靛蓝,在全水相体系中,因吲哚的细胞毒性,其添加量必须控制在最小生长抑制浓度(0.3mg/mL)以下,靛蓝产量仅为0.01mg/L,在含10%(体积分数)二苯基甲烷的双相体系中吲哚的细胞毒性显著下降,反应24h后靛蓝在二苯基甲烷相中达到饱和并析出,靛蓝的产量为0.292g/L,比不添加有机溶剂的反应体系提高了近3万倍。
3.筛选耐有机溶剂的酶
生物催化反应中,使用对有机溶剂耐受的酶可以明显提高底物浓度及生物催化反应速率,在工业生产上具有较大的应用价值。随着耐有机溶剂微生物的发现,人们开始推测这些极端微生物所产生的酶类(特别是一些胞外酶,如脂肪酶、酯酶和蛋白酶等)也具有一定的有机溶剂耐受性。这一推测在后续的实验中得到了证实。1994年,Ogino等首次报道了耐有机溶剂微生物产生的脂肪酶在多种有机溶剂中具有高度催化活性和稳定性,随后又陆续有研究者报道了能够产生耐有机溶剂酶类的菌株。耐有机溶剂微生物的研究推动了这类催化剂越来越广泛的应用。在过去二十年中,通过定向筛选等方法发现了许多具有有机溶剂耐受性的酶,其中包括脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷转移酶等。
(1)耐有机溶剂脂肪酶 脂肪酶(lipase)是普遍存在于自然界的酯键水解酶。1992年,Shabtai等报道了一个来自于菌株Pseudomonas aeruginosa YS-7的脂肪酶,该酶在多种亲水有机溶剂如乙醇、DMF、DMSO和异丙醇中能保持很好的稳定性,特别是在DMF和DMSO中不但具有良好的稳定性,而且随着有机溶剂含量的增加,酶活力也不断增加。当DMSO浓度达到90%(体积分数)时,酶活力约为水溶液中的12倍,而当DMF的含量高达80%(体积分数)时,酶活力为水溶液中的4倍。Hun等也报道了Bacillus sphaericus 205y所产的耐有机溶剂脂肪酶在DMSO、甲醇、二甲苯和癸烷中均能增加酶活力。Fang等报道了腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus M36脂肪酶在25%的二甲苯、甲苯、苯和正己烷溶液中24h后活力维持不变。Ogino等报道了一株P seudomonous aeruginosa LST-03耐有机溶剂脂肪酶生产菌,该菌株所产的脂肪酶在多种有机溶剂中显示了良好的稳定性,在含有25%(体积分数)的亲水有机溶剂如DMSO、甲醇和乙醇溶液中的半衰期分别达到36.2d、11.3d和7.6d,而在许多烷烃中的半衰期都大于10d。Zhao等报道了一株Serratia marcescens ECU1010,其所产的脂肪酶在多种有机溶剂中具有良好的有机溶剂耐受性。
(2)耐有机溶剂蛋白酶 耐有机溶剂蛋白酶(protease)是另一类报道较多的水解酶,1995年,Ogino等首次报道了一株耐有机溶剂蛋白酶产生菌P seudomonous aeruginosa PST-01,该蛋白酶在各种极性的有机溶剂中都表现出良好的稳定性,不但在多种50%(体积分数)有机溶剂体系中的半衰期均大于50d,并且在含有高浓度DMSO(60%,体积分数)和DMF(50%,体积分数)的溶液中能合成多种二肽。Sareen等从突变的地衣芽孢杆菌中筛选到一株能分泌耐有机溶剂蛋白酶的菌株Bacillus licheniformis RSP-09-37,该蛋白酶可以在高浓度的乙腈溶液中保持稳定,其在50%(体积分数)乙腈溶剂中的半衰期大于10h。在90%(体积分数)乙腈的溶剂中,该蛋白酶仍然能够高效催化合成京都肽前体,产率达93%。此外,该蛋白酶还能在有机相中催化酯交换反应,进一步拓宽了该酶的催化类型。何冰芳所在的研究室发现了一株耐有机溶剂蛋白酶菌株Pseudomonous aeruginosa PT121,该菌株所产的蛋白酶不但产量很高,而且在多种含50%(体积分数)有机溶剂的体系中显示出良好的稳定性,该酶在50%(体积分数)的DMSO体系中可以催化阿斯巴甜前体的合成,且转化率高达85%以上,产物从体系中析出直接达到反应分离偶合的效果,该蛋白酶在有机相催化中显示出良好的前景。Akolkar等发现嗜盐杆菌属Halobacterium sp.SP1蛋白酶在甲苯、二甲苯、正癸烷、正十二烷及正十一烷中都十分稳定。
(3)耐有机溶剂氧化还原酶 近年来耐有机溶剂氧化还原酶类也渐渐成为研究的热点。Kosjek等从Rhodococcus rubber DSM 44541纯化得到一个耐有机溶剂的醇脱氢酶,该酶可以耐受50%(体积分数)的丙酮和80%(体积分数)的异丙醇,更重要的是,该脱氢酶的催化不但具有很强的立体选择性,并且通过调整反应体系中的溶剂含量可以改变反应的平衡。实验表明,该酶在50%(体积分数)以下的丙酮体系中催化还原苯乙酮(acetophenone)、2-辛酮(2-octanone)和6-甲基-5-烯基-2-庚酮(6-methyl-5-heptene-2-one)等生成S构型的仲醇化合物,ee值均大于99%;而该酶在有机溶剂大于60%(体积分数)的异丙醇中只能将S构型的仲醇化合物氧化生成酮类,而不转化R型的对映体,其反应的对映体比率(E)大于200,从而获得不同构型的产物。Lavandera等发现了一个来自于Paracoccus pantotrophus菌株的醇还原酶,15%(体积分数)DMSO可以促进该酶的活力。该酶也可以催化多种酮类化合物还原生成手性醇化合物,并且产物都具有很高的ee值。Chen等使用基因突变的方法从Bacillus sphaericus菌中获得一个耐有机溶剂苯丙氨酸的脱氢酶,该酶可以在10%(体积分数)甲醇体系中催化多种苯丙氨酸酮酸化合物生成非天然L型苯丙氨酸衍生物。不过,由于多数氧化还原酶类在催化体系中需要添加昂贵的辅酶或辅基,所以人们更倾向于利用可再生辅酶的全细胞体系催化氧化还原反应。
(4)其他耐有机溶剂酶 Doukyu等筛选到一个耐有机溶剂的环糊精葡萄糖转位酶,该酶可以用来生产β-环糊精,它在10%(体积分数)乙醇体系中可以将β-环糊精的产量提高1.6倍。Castillo等发现的耐有机溶剂蔗糖6-果糖基转移酶可用于有机相制备果聚糖。Hao等利用定向进化技术获得一个耐有机溶剂的果糖二磷酸醛缩酶,而Fukushima等筛选到一个耐有机溶剂的α-淀粉酶。Doukyu等从耐有机溶剂的Brachybacterium中获得淀粉酶,该酶在DMSO及乙醇体系中,其催化的麦芽寡糖产量和产物选择性均显著提高。这些研究丰富了耐有机溶剂酶催化反应类型的多样性,为拓展酶在有机相中的催化应用提供了新的催化剂来源。