第五节　非水介质中酶催化的应用

一、酯的合成

由于酶的来源、有机溶剂以及反应物的不同，脂肪酶催化酯合成反应时的反应体系也各不相同，下面以非水介质中酶促合成短链脂肪酸酯、糖脂以及黄酮类化合物的酶促酰化等为例进行介绍。

1.短链脂肪酸酯

短链脂肪酸酯是一大类十分重要的香味剂，具有多种天然水果的香味和特殊的风味特征，是重要的香精、香料的组分，广泛用于食品、饮料、酿造、饲料、化妆品及医药行业中。酯类香味剂在国际上有重要的地位和影响。

目前全球短链脂肪酸酯的生产中，除了极少数的酯有很少量的产品是从天然植物中提取以外，其他的几乎全部都是通过传统的化学合成方法生产的。也就是在高温、高压条件下，由化学催化剂，如浓硫酸、对甲苯磺酸等催化合成。化学生产不仅存在着化学催化剂可能带来有毒物质的问题，而且在高温、高压条件下很容易发生副反应，副产物大多有毒副作用。有些化学合成产品由于底物不纯，影响了产品的质量，如化学法合成的己酸乙酯产生的极不自然的“浮香”；有些产品提取后有强烈的气味，如棕榈酸异丙酯。这些都给下游提取带来了许多困难，从而造成产品的质量档次低。除此以外，化工生产给环境带来了许多污染与破坏。化学法生产的产品与生物法生产的产品在安全性和品质等方面存在较大的差异，因此在价格上也存在极大的差异。如国际上化学法生产丁酸乙酯的价格仅为2～5美元/kg，而由生物催化剂催化合成的价格高达180美元/kg。尽管目前有些情况下化学合成还比较经济，但随着人们对天然产物的青睐和对生存环境的重视，而直接从植物中提取又无法满足日益增长的需求，例如水果中芳香酯的含量只有1～100mg/kg，因此，人们把研究目光转向了生物化学、微生物学、化学和生化工程等多学科交叉的生物转化的方法上来。

尽管在20世纪初就有用猪胰脂肪酶提取物合成丁酸乙酯的报道，但长久以来，由于酶品种单调，（可用于生物催化反应的酶制剂更少），同时由于化学工业的飞速发展，采用酶作为催化剂的方法并没有引起人们的重视。直到20世纪80年代的中后期，随着有机相酶学的出现和酶制剂工业的发展，酶的品种不断增加，酶催化在有机合成中的应用也不断扩大。目前，国际上脂肪酶催化己酸乙酯的合成，一般底物浓度为0.25mmol/L，利用猪胰脂肪酶和皱褶假丝酵母脂肪酶催化酯合成的转化率为68％。

利用具有高酯化能力的脂肪酶，在有机相中酶法转化短链脂肪酸酯不仅具有一般生物催化合成有机化合物的优点，如酶促反应是在常温常压条件下进行的、反应条件温和、节约能源、酶促反应的特异性高、副产物少、产品品质高等，还具有以下一些特点和优势，如有机相中反应的热力学平衡趋向酯合成方向、反应转化率高、酶不溶解于有机相中而容易回收再利用等。

2.糖脂

糖脂作为一种生物功能分子和化工原料具有重要的价值。高级脂肪酸的糖脂作为一类具有较宽HLB范围的非离子型乳化剂，由于具有无毒、易生物降解及良好的表面活性，被广泛用于食品、医药和化妆品等产品的生产中，是联合国粮农组织推荐使用的食品添加剂。糖脂的来源较广泛，应用面广，安全性高，因此特别适合用作食品乳化剂。另外，糖的衍生物如糖脂、糖蛋白等在体内有重要的作用，近年对糖及其衍生物的研究成为人们研究的热点。Planehon等在1991年发现一些糖脂衍生物具有抗肿瘤的作用，如二丙酮缩葡萄糖的丁酸酯能够抑制肿瘤细胞的生长而不影响正常细胞，同时能够增强干扰素α或干扰素β的抗肿瘤作用。

当前，糖脂的合成方法可以分为两大类：化学合成法和酶促合成法。化学合成法已很成熟并已工业化，多用二甲基甲酰胺（DMF）、酰氯、吡啶等作溶剂以及甲基苯磺酸、金属钠等作催化剂，反应温度一般在140℃左右，能耗大，溶剂毒性大，产品易着色，副反应多，这是因为糖分子上有多个羟基可以被酯化，产生了众多的同分异构体，Fregapane等用气相色谱分析食用山梨醇酯发现其中有65种同分异构体，其中一些成分的致癌性和致敏性也引起了人们的关注。酶作为生物催化剂，具有高度的区域选择性和相对的底物专一性，酯化反应一般只发生在特定的羟基上，并且同一种底物相对于不同来源的酶的酯化位点不同，同一种酶对不同的底物的酯化位点也不同。因此可设计出不同的反应，得到不同的产物，满足人们多方面的需要。为了克服酶法生产糖酯转化率低的问题，科研人员不断探索新方法，如使用介质工程、减压法、减压法除去副产物、固相合成和全蒸发法等完善了糖脂的酶法合成。

3.黄酮类化合物的酶促酰化

黄酮类化合物是广泛分布于植物界的一类重要的天然产物，已经用于食品、化妆品及其他日用品中。有人对黄酮类化合物的生物学、药理学及医疗特性进行了详尽的阐述。据报道，黄酮类化合物除具有清除自由基和抗氧化等功能外，还具有多种生理活性，包括扩张血管、抗肿瘤、抗炎、抗菌、免疫激活、抗变应性、抗病毒、雌激素样作用等，另外，黄酮类化合物还作为磷酸酯酶A2、环氧合酶、脂肪氧化酶、谷胱甘肽还原酶和黄嘌呤氧化酶等多种酶的抑制剂。但黄酮类化合物在脂及水相中的低稳定性和低溶解性限制了它们在这些方面的应用。有人用化学法、酶法及化学-酶法对它们的结构进行修饰，以改善它们的性质。其中糖基化和酰基化两类修饰反应受到特别的关注。前一种修饰通过加入糖基提高黄酮类化合物的亲水性，而第二类反应通过连接脂肪酸使之疏水性更强。应用化学法对黄酮类化合物进行酰基化已经申请了专利，但这些方法无区域选择性，从而使黄酮类化合物起抗氧化作用的酚羟基产生非期望的功能。而用脂肪酶催化黄酮类化合物的酰基化反应，其酚羟基较化学法具有更高的区域选择性，不仅可以提高它们在不同介质中的溶解性，还可以提高它们的稳定性及抗氧化活性。

已经有诸如蛋白酶、酰基转移酶、脂肪酶、枯草杆菌蛋白酶等用于黄酮类化合物的酰基化反应。研究表明，酶的来源及种类对转化率和酰化初速度有很大的影响；而作为糖基配体的黄酮类化合物，其酯化作用的位置主要取决于酶的种类及来源以及黄酮类化合物的主链骨架等。同时可以发现，Novozym 435和PCL脂肪酶似乎分别是合成糖基化酯类和糖苷黄酮酯类的最佳酶。

二、肽的合成

所谓肽键的酶促合成，在目前来说是指利用蛋白水解酶逆转反应或转肽反应进行肽键合成。在有机介质中酶促肽键的合成，其中包括较大肽段间的缩合，尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段，较传统的化学合成法具有明显的优势。它的主要优点表现在反应条件温和，立体专一性强，不用侧链保护基和几乎无副反应等。最近几年，利用各种来源的蛋白水解酶在非水介质中合成了各种功能的短肽或其前体，其中包括一些具有营养功能的二肽和三肽、低热量高甜度的甜味剂二肽以及具有镇静作用的脑啡肽五肽等；甚至于一些具有生物功能的蛋白质如胰岛素、细胞色素C和胰蛋白酶抑制剂等也可以用酶技术进行重合成和半合成。利用酶反应器，连续合成某些功能短肽已接近生产规模。此外，也有研究表明，脂肪酶也可以应用于肽键的形成，而且有一些蛋白酶没有的特性，如没有酰胺酶活性，可以更好地应用于多肽的合成。也有文献报道说在纯水体系中一些蛋白酶也可以进行肽键的合成，其方法原理与有机介质中应用蛋白酶进行肽合成大致相同。

由于酶法合成肽是利用蛋白水解酶的逆反应或转肽反应来进行肽键的合成，因此，酶既可以催化一个化学反应向正方向进行，也可以催化其向逆反应进行，反应平衡点的移动取决于反应条件。有机介质能改变某些酶的反应平衡方向。例如，水解酶类，在水介质中，水的浓度高达55.5mol/L，使热力学平衡趋向于水解方向。如水含量极低的有机介质，能使热力学平衡向合成方向移动，则这些水解酶行使催化合成反应的功能。

1898年，Hoff就提出蛋白酶可以催化肽合成这个概念，他认为胰蛋白酶可能具有催化蛋白水解物的蛋白合成反应。1937年，Bergmann和Fraenke-l Conrat等人第一次用木瓜蛋白酶酶促合成了硅胺Z-GlyNHC6H5，产率达80％；随后他们又先后用木瓜蛋白酶、糜蛋白酶等催化合成了设计好的肽。在此之前，人们相继发现木瓜蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的转肽作用，并利用它们的转肽作用催化合成了一系列的小肽及其衍生物。20世纪70年代，Morihara、Kullmann等小组利用蛋白酶合成生物活性肽的工作，再次验证了利用蛋白酶进行肽合成的价值。他们的结果引起了人们对此项技术的兴趣，在此之后合成出了一些重要的生物活性肽。

近三十年的合成工作向人们展示了酶法合成相对化学法的明显优点：①反应条件温和，降低了化学和操作上的危险性。②酶高度的区域选择性允许使用保护程度很低的底物，这样的底物既便宜又易得到。这也使得合成过程中的中间产物的保护、脱保护的步骤得到简化。③肽的酶法合成是立体特异的，并且观察不到外消旋的发生。这样可以使用外消旋的起始反应物，并通过合成反应得到拆分，而回收未反应的异构体。蛋白酶同样也能催化由化学法合成的寡肽片段的无消旋缩合，这一工作用化学法时则效率较低，且产生很高的消旋率。

三、高分子的合成与改性

1.聚酯类可生物降解高分子的酶促合成

利用线性单体的缩合反应可以合成具有可生物降解性的聚酯，反应的模式主要如下所示：

式中，A和B各代表一种具有反应性的功能基团，如羟基和羧基、羧基和酰氯等。

Klibanov等人利用黑曲霉脂肪酶在甲苯中以1，6-己二醇和2，5-二溴代丁二酸-（2-氯代乙醇）酯为单体，聚合成（+）聚己二醇-2，5-二溴代丁二酸酯，得到的聚合物虽然分子量不大（只有800），但是寡聚物有光学活性，生物相容性好。Gilboa利用更易得的底物反丁烯二酸酯与1，4-丁二醇，以Canclida cyclndracaea等10种来源的脂肪酶作催化剂，在四氢呋喃和乙腈中合成全反式构象的聚酯，它具有生物可降解性。

利用内酯的开环聚合反应也可以合成具有可生物降解性的聚酯。反应模式如下：

Gutman研究了ε-己内酯的开环聚合反应，他采用ε-己内酯加入少量甲醇（作为亲核供体）以正己烷为溶剂，在猪胰脂肪酶的催化下，合成了聚己内酯，聚合度为10。MacDonald利用猪胰脂肪酶（PPL）催化ε-己内酯在二氧六环、甲苯、庚烷等溶剂中的开环聚合，反应温度为65℃，单体的含量为10％，用正丁醇作为亲核供体，得到聚酯的分子量为2700。日本的Kobayashi等人采用无溶剂体系，用P seudomonos fluorescens脂肪酶催化ε-己内酯的开环聚合，得到了较高分子量的聚合物，数均分子量达7000。曹淑桂等用P seudomonos fluorescens脂肪酶和Candida cylindracaea脂肪酶在60℃条件下直接催化ε-己内酯、β-丁内酯、ε-壬内酯聚合，分子量达25000。

2.酚及芳香胺类物质的酶促聚合

辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）是催化合成聚合物方面很有潜力的一种酶。它能够以过氧化氢作为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。Kaplan和Dordick分别对多种底物在不同介质中进行了聚合反应的研究。由于底物的反应性和结构的差别，因而获得的聚合物的分子量有明显的不同。正是由于辣根过氧化物酶具有如此广泛的底物专一性，使其在合成聚酚以及芳香胺类物质方面有极大的应用潜力。为了更好地控制聚合反应的过程，Ruy等对辣根过氧化物酶催化酚类物质的聚合过程进行了Numerical和Monte Carlo模拟，并和试验结果进行了比较，指出采用低浓度的和具有给电子能力强的酚，在反应过程中有益于形成高分子量的聚合物。

聚合物的结构是由该催化反应的机制所决定的，这种聚合反应主要是在酚及芳香胺的邻、对位发生的，因而获得的是一种芳环上碳碳相连的结构。Kaplan等对聚合物的结构及基本的高分子性质做了比较系统的研究，NMR与IR的研究结果表明，在二氧六环体系中催化联苯酚聚合可以获得图2-5中的几种结构。其中图2-5（a）为主要部分，而通过化学法来获得这种碳碳相连的聚酚类结构是十分困难的。这种具有大π共轭体系的聚合物在功能材料方面具有极大的应用前景。

3.旋光性高分子

聚合物的旋光性来源于两个方面，一方面是单体单元中含有的手性元素，另一方面则是聚合物分子的手性构象，有时则是这两者的共同作用。近年来，人们已逐渐认识到，影响高分子材料物理性能及加工性能的不仅仅在于组成高分子的一级结构，其二级结构和三级结构也是高分子物性及加工业的重要因素，而聚合物的旋光特性也是影响聚合物微观结构的一个主要因素。

旋光性聚合物由于在其分子中存在着构型或构象上的不对称因素，与具有相应结构的非旋光聚合物相比，两者在分子识别和组装上具有明显的区别，从而使两者在熔点、溶解性、结晶特性上存在着较大的差异，但其内在规律尚未明确。另外，在其他光、电、磁等物理特性上也具有一定的差异，尚待深入研究。

不对称合成实例如下：

利用水解酶在非水介质中可以合成多种手性聚合物（图2-6）。这些手性聚合物具有广阔的应用前景。

4.高分子的酶促改性

（1）天然高分子的酶催化改性　天然高分子，特别是多糖类，因其主链上往往含有大量的羟基而被视为一类难以进行化学加工的材料。然而，用酶法或化学与酶法相结合的方法来进行天然高分子改性的研究，改变了人们传统的观点。例如，在酶的催化作用下，通过对多糖的选择性酰化，可以得到更多、更清洁的亲水亲油的材料、生物可降解材料、生物可侵蚀及生物相容性材料。

天然高分子改性中常用的酶有脂肪酶、蛋白酶、半乳糖氧化酶、β-半乳糖苷酶等。应该注意的是，即使是同一种酶，来自于不同的菌种，其性质就会有很大的差异。脂肪酶是高分子改性中应用较多的一种酶，主要用于高分子的酰化、酯化及接枝反应。20世纪90年代初有文献报道，脂肪酶（来自于假单胞菌属）可用于催化侧链含有羟基的梳状的甲基丙烯酸聚合物的酰化反应。近年来，相关的文献逐渐增多。Li等用脂肪酶PPL（来自于猪胰脏）催化ε-己内酯对羟乙基纤维素（HEC）的接枝反应。在这一过程中，PPL在HEC薄膜上催化ε-己内酯的开环聚合，生成聚ε-己内酯，并与HEC发生接枝反应。产物取代度为0.10～0.32（以每个脱水葡萄糖单元计）。关于PPL催化ε-己内酯开环聚合的研究另有报道。脂肪酶PPL催化的另外一个反应是甘油和果胶之间的酯化反应。PPL对这一反应有高度的专一性，产物中甘油仅以单酯形式存在，并无任何交联结构（二酯）存在。

（2）合成高分子的酶催化改性　在相对温和的条件（<45℃，3～5h）下，来自于假丝酵母的脂肪酶Novozym 435能够催化甲基棕榈酸和聚乙二醇（Mw为500～2000）之间的反应，从而得到一种表面活性剂——聚乙二醇的棕榈酰单取代物和少量的双取代物。关于用生物法来有选择性的催化高分子的某一特定的反应也有一些文献报道。Jarvie等用固定化脂肪酶Novozyme 435成功地催化了聚丁二烯（Mn≈1300）微结构cis-1，4为20％，trans-1，4为35％，trans-1，2为45％的环氧化反应。结果表明，这一酶催化反应对聚丁二烯分子链主链上的双键有较高的选择性，约有60％的双键被环氧化，而侧链上的双键则未被环氧化。

四、光学活性化合物的制备

光学活性化合物是指那些具有旋光性质的化合物，它们的化学组成相同，但是立体结构不同而成为恰如人的左右手一样的对映体，因此也称为手性化合物。光学活性化合物的制备一直是有机合成的难题，至今尚未走出困境。酶作为生物催化剂，可以用于光学活性化合物的合成和拆分。由于它具有高对映体选择性，副反应少，所以产物的光学纯度和收率高。此外，酶催化反应条件温和，无环境污染。酶催化光学活性化合物的合成是将有潜手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的光学活性化合物，如氧化还原酶、裂解酶、羟化酶、水解酶、合成酶和环氧化酶等，它们可以催化前体化合物不对称合成得到具有光学活性的醇、酸、酯、酮、胺衍生物，也可以合成含磷、硫、氮及金属的光学活性化合物。酶还可以催化外消旋化合物的拆分反应，如脂肪酶、蛋白酶、腈水合酶、酰胺酶、酰化酶等能够催化外消旋化合物的不对称水解或其逆反应，以拆分制备光学活性化合物。手性药物是一类非常重要的光学活性化合物，下面将列举几个这方面的实例。

1.普萘洛尔的酶法拆分

Berinakatti等在有机溶剂中，利用PSL（假单胞菌脂肪酶）对外消旋的萘氧氯丙醇酯进行水解，得到了（R）-酯的ee值大于95％；而利用PSL对消旋的萘氧氯丙醇进行选择性酰化，也得到了ee值大于95％的光学活性的（R）-醇（图2-7）。

2.非甾体抗炎剂类手性药物

非甾体抗炎剂类手性药物被广泛地用于人联结组织的疾病如关节炎等。其活性成分是2-芳基丙酸的衍生物（CH3CHArCOOH），如萘普生、布洛芬、酮基布洛芬等。

中国台湾的Tsai对有机溶剂中脂肪酶（CCL）催化的酯化反应进行了研究，实验证实在80％的异辛烷与20％的甲苯组成的有机溶剂中，酶反应获得了较高ee值的光学活性萘普生（图2-8）。

Duan等在有机溶剂中对布洛芬进行酶促酯化反应时加入少量的极性溶剂，使酶的选择性有了明显的提高，如加入了二甲基甲酰胺后，最后得到（S）-布洛芬的ee值从57.5％增加到了91％。加拿大的Trani等对布洛芬的酶法拆分做到了克级规模。另外，Gradillas等对布洛芬酯化的反应速率进行了研究，当未加任何添加剂时，反应进行30h，（S）-布洛芬的产率为43％，而加入了苯并-［18］冠-6后，同样的反应时间，产率提高到68％，而加入内消旋的四苯基卟啉后，其反应产率提高到79％，而且对映体选择性没有受到大的影响。

3.5-羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物

5-羟色胺（5-HT）是一种涉及各种精神病、神经系统紊乱，如焦虑、精神分裂症和抑郁症的一种重要的神经递质。现有一些药物的毒性就在于它不能选择性地与5-HT受体反应（已发现至少7种5-HT受体）。事实上，那些具有立体化学结构的药物在很大程度上能影响其与受体结合的亲和力和选择性，其中一种新的5-HT拮抗物MDL就极好地显示了这一特性。（R）-MDL在体内的活力是（S）-MDL的100倍以上，是以前5-HT拮抗物酮色林活力的150倍，更为重要的是，（R）-MDL对5-HT显示了极高的选择性。

在制备MDL的过程中，第一次成功地在酶法拆分时实施了同位素标记。其中一个主要的手性中间体的拆分如下：

在转酯化反应中，脂肪酶选择性地催化反应生成了（R，R）-酯，残留的为（S，S）-醇。

从以上实例我们可以看出，几乎都是脂肪酶在拆分中起重要作用，但事实上一些其他种类的酶也能进行拆分反应，如酯酶、蛋白酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、ATP酶、胆固醇氧化酶和细胞色素氧化酶等。另外还有一些蛋白工程酶和抗体酶。只不过这些酶有的不易获得，价格昂贵，而且有的还需要辅酶，因此利用这些酶进行拆分反应的研究比较少。