第二章　影响细胞和体液免疫的免疫缺陷病

第一节　重症联合免疫缺陷病

一、X连锁重症联合免疫缺陷病

【概述】

自1950年重症联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency disease，SCID）被描述以来，已经认识到这组疾病包括不同遗传缺陷，累及T、B细胞发育。最近分子遗传学的进展使大部分SCID患儿的特异基因突变获得鉴定。很久以来认识到T^-B⁺SCID患儿大部分为男孩，提示很多家族为X连锁遗传。然而女性患儿的存在及一小部分患儿父母为近亲提示常染色体隐性变异存在。1993年IL-2受体γ（interleukin-2 receptor gamma，IL2RG）基因被克隆，定位于X染色体，与SCID-Xl定位区域一致，最终在SCID-Xl患儿中鉴定到IL2RG突变。由于突变的严重程度超过预期的明确的IL-2通路缺陷，推测该受体具有其他功能。后来发现细胞因子亚家族包括IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15，IL-21共享这个共同受体亚单位，故被重新命名为通用 γ链（common γ，γc）。

【发病机制】

最初认为IL2RG缺陷源自IL-2信号通路受损，但鼠和人的实验观察提示发病机制复杂。基因标靶鼠的IL2导致外周T细胞稳态破坏和自身免疫，IL-2受体α（IL-2 receptor α，IL2RA）缺陷患儿有免疫缺陷和淋巴增殖，均提示IL-2R通路对外周T细胞稳态至关重要，但对胸腺内分化影响不大。这些数据提示IL-2RG链具有其他的功能。事实上不久即发现IL-2RG是其他细胞因子受体的组成成分。因此SCID-Xl被认为是多个细胞因子介导通路的缺陷。T细胞发育缺陷主要源于IL-7R通路受损，证据源自于IL-7和IL-7R缺陷鼠的经验和IL7RA缺陷患儿导致T^-B⁺SCID的发现。SCID-Xl与IL7RA缺陷表型略不同，前者循环NK细胞缺陷，后者NK细胞分化不受影响。SCID-Xl中NK发育缺陷可能源自于IL-15R通路缺陷，因为IL15RA基因敲除鼠NK细胞发育明显受阻。γc与IL7RA缺陷的鼠和人表型有不同，在鼠模型中B细胞发育受阻，但在人中B细胞发育不受影响，提示IL-7对鼠的B淋巴细胞发生至关重要，而在人并非如此。

细胞因子受体本身无激酶活性，募集和利用细胞内激酶介导靶蛋白的磷酸化。在这些所有受体中，γc与Janus家族激酶3（Janus family kinase 3，JAK3）结合，而大部分细胞因子受体转导亚单位与JAK1结合。JAK3表达于造血细胞，一些SCID-Xl患儿IL2RG突变影响与JAK3相互作用，推测JAK3突变可能导致T^-B⁺SCID。于1995年首次鉴定人类JAK3缺陷，是常染色体隐性T^-B⁺SCID的最常见原因。

细胞因子与受体结合后，受体链二聚体化，将JAK1，JAK3带至附近，允许JAK反式（trans）磷酸化和受体亚单位的酪氨酸磷酸化，产生锚位募集含有SH2的信号转导和转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）。STAT被募集至受体复合体，被自身磷酸化。STAT通过磷酸化的酪氨酸残基和SH2的相互作用二聚体化，运转入细胞核，与细胞因子反应基因的调节单元结合，促进转录。

【分子特征】

IL2RG基因位于Xq^11.3，基因组跨度4.5kb，1 124位核苷酸分为8个外显子。γc是Ⅰ型跨膜蛋白，删除22位氨基酸信号肽后被运转至细胞膜。与其他细胞因子受体相似，细胞外结构域包含4个半胱氨酸残基和近膜的WSXWS模体。外显子6编码细胞质尾部的信号元素（box1/box2）。1/4突变位于外显子5，编码细胞外结构域包括WSXWS模体，可能与WSXWS的5′端的6个CpG有关。错义突变的影响不好预测，因为对蛋白折叠、细胞内转运、表达有不同影响。有时细胞内截断蛋白也导致表达正常。

IL2RG基因R222C位点突变患儿具有正常的胸腺和多克隆的T细胞谱，提示淋巴细胞生成存在和IL-7介导的信号完整性。然而IL-2介导的JAK3和STAT5磷酸化缺陷。R222、R224、R226位于细胞因子结合区域，这些残基的突变可能影响不同细胞因子的结合。一例R226S位点突变患儿具有一定数量的自体的T细胞，一例R226H位点突变患儿NK细胞发育未受损。

即使γc表达缺陷，患儿也可表现不典型的临床和免疫表型。一例L162R位点突变患儿，由于细胞内降解导致细胞表面不表达γc。患儿未行干细胞移植存活至15岁，循环自主T细胞逐渐增加，呈寡克隆性，对丝裂原无反应，易于凋亡。因此推测人类可能存在γc/JAK3非依赖的T细胞发育途径。

【临床表现】

患儿通常3～6月龄出现临床症状。最初为一般感染如鹅口疮，中耳炎，呼吸道病毒感染（呼吸道合胞病毒、副流感3病毒、腺病毒、流感病毒），胃肠道疾病导致腹泻，当对常规治疗无反应时应引起重视。1岁内一致性特征为不生长，口腔/尿布区念珠菌病，无扁桃体和淋巴结肿大，反复感染，机会性病原感染如肺孢子虫病，持续感染。其他常见特征包括皮疹、腹泻、发热、肺炎、败血症和其他严重细菌感染。少见特征包括播散性感染（沙门菌、水痘、巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、卡介苗和活的脊髓灰质炎疫苗株）。可见反复细菌性脑膜炎。母体T淋巴细胞经胎盘输注可引起移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），特征为红皮病、肝大和淋巴结肿大。

少数患儿可有不典型表型，免疫表型可为T⁺B⁺NK^-，临床表现为免疫失调节和自身免疫，如皮疹、脾大、胃肠道吸收不良，以及其他自身免疫情况和身材矮小。也有B-SCID报道。一些病例表现为一定量的自身NK细胞，尽管缺乏T淋巴细胞。与经典表型差异的原因目前仅能部分被解释。IL-2结合和/或内吞作用降低、降低的但非取消的γc受体的信号、对细胞因子结合和信号的不同作用、基因逆转等均为不典型表型的可能原因。

【实验室检查】

T细胞数目通常非常低，B细胞通常存在但无功能，NK细胞数目低或缺如，典型SCID-Xl表型为 T^-B⁺NK^-SCID（T^-<300/μl，B⁺ > 400/μl，NK^-<40/μl）。对疫苗（破伤风）和感染病原（念珠菌抗原）的抗体反应缺陷。对丝裂原（植物血凝素、刀豆蛋白A，美洲商陆）的T细胞反应缺陷。血清IgA、IgM浓度低。胸片示胸腺影缺如。胸腺病理特征为胸腺细胞耗竭，上皮细胞呈胚胎管样，胸腺小体消失，纤维化和脂肪浸润。

用患儿来源的EB病毒转染的永生化的B淋巴系研究提示IL-2诱导的JAK3磷酸化缺陷，而JAK3表达正常。用流式检测γc表达用于诊断可能导致错误，需仔细分析。由于母体来源的T细胞很常见，因此必须基于B淋巴细胞的表达，即使如此，表达方式变化也很大。

若测序分析未找到突变，需要做Southern blot检测大的缺失或复杂突变。IL2RG突变继发的偏移的X染色体灭活仅出现于淋巴细胞，而中性粒细胞或其他组织细胞的X染色体灭活仍呈随机性。一些正常女性偶然有偏移的X染色体灭活，因此为判断SCID-Xl女性是携带者，一定是淋巴细胞X染色体偏移灭活，同时中性粒细胞或其他组织细胞X染色体随机灭活。直接测序分析不能检测女性的大的缺失或复杂突变。有作者建议用流式细胞分析检测单核细胞γc表达发现两群细胞协助诊断携带者，但由于正常人单核细胞γc表达变异大，两群细胞表达会有重叠，需要慎重分析。

【鉴别诊断】

1.其他T^-B⁺SCID

JAK3-SCID临床与免疫表型同SCID-Xl无法区别。前者为常染色体隐性异常。后者为X连锁隐性遗传，携带者母亲X染色体可有偏移灭活。EB病毒转染的永生化的B淋巴系IL-2刺激下STAT5磷酸化均缺陷，但前者JAK3表达缺陷，后者表达正常。IL7RA-SCID为常染色体隐性遗传，通常NK细胞发育不受影响，为NK⁺SCID（NK⁺ > 100/μl）。

2.Wiskott-Aldrich综合征

X连锁隐性遗传，伴湿疹和血小板减少的免疫缺陷病。若患儿在血小板减少的同时伴有明显淋巴细胞减少，需要鉴别。WASp蛋白表达分析及WAS基因突变分析有助于诊断。

3.HIV感染

与SCID不同，T淋巴细胞通常存在，主要CD4⁺T细胞受累，免疫表型为CD4⁺T淋巴细胞减少。血P24抗原及核酸检测有助于诊断。

【治疗及预后】

SCID患儿需要立即免疫重建，最佳时机是出生后立即骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）。世界范围内目前很多国家已经开展新生儿足跟血T细胞受体删除环（T-cell receptor excision circle，TREC）检测来筛查 SCID（图2-1-1），在感染出现前行造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）成功率高。来自人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相合同胞供者的HSCT存活率 > 90%，单倍型相合剔除T细胞的HSCT存活率为50%～78%。但在早期无感染情况下，两种移植方式的存活率无差异。相合的无关供者骨髓或脐带血干细胞移植在一些中心也开展，但GVHD是严重问题。NK⁺SCID患儿HSCT后易出现移植物排斥。SCID患儿HSCT的特殊之处在于无需清髓来促进供者细胞植入。HLA相合的同胞供者HSCT后很少出现GVHD。HLA相合的HSCT包含所有骨髓细胞的输入，10～15天可检测到成熟T细胞，具有记忆表型，1～2个月T细胞计数可达正常。单倍型相合的父母供者需要剔除供者的成熟T细胞。单倍型相合的供者仅输入造血前体细胞，检测不到成熟T细胞，3～4个月可检测到原始T细胞。小于3月龄行HSCT或基因治疗，原始T细胞出现于15～30天，细胞上升也快。

SCID患儿经单倍型HSCT后，供者来源的T细胞不能被不相同的宿主HLA抗原所活化，且供者来源的抗原特异性T细胞，在宿主HLA Ⅱ背景下（与供者共享或不共享）及在与受者不共享的供者的HLA Ⅱ背景下，能够识别抗原（破伤风毒素和流感病毒肽链），提示阳性选择可被人类上皮细胞驱动，但也可能被定植于宿主胸腺的供者抗原呈递细胞来驱动。DiGeorge综合征患儿经HLA不相合胸腺移植后，宿主T细胞能识别宿主抗原呈递细胞呈递的抗原，提示定植于胸腺的宿主抗原呈递细胞可介导阳性选择，这些结果提示SCID患儿单倍型HSCT后在新的环境可导致完全功能正常的T细胞发生。

在非清髓预处理情况下，大部分SCID患儿（> 80%）HSCT后存在嵌合，伴T细胞和NK细胞为供者来源，其他白细胞亚群为宿主来源，不管是HLA相合同胞或单倍型相合父母为供者，经典HSCT这种嵌合方式很少见。由于骨髓中缺乏供者细胞，提示造血为宿主来源的，推测数年后淋巴生成会耗竭。NK细胞重建较T细胞困难。NK^-SCID移植后易于出现慢性皮肤乳头瘤病毒感染。一小部分SCID患儿移植后具有与宿主B细胞相关的长期功能的B细胞免疫，多数是具有正常B细胞的SCID（IL7RA和CD3缺陷）。HSCT后10～12年不能检测到TREC，但并不能提示何时胸腺生成停止，因为原始T细胞会持续一段时间。TREC⁺T的检测和供者骨髓嵌合强相关。16% HLA相合，18%单倍型相合HSCT的SCID患儿存在T细胞免疫缺陷。TREC⁺T与TCR谱多样性强相关。同种异体移植前预处理可能利于供者干细胞植入，但在感染患儿有致命毒性风险。

IL2RG基因表达于造血系统，表达不受精细调节，表达的重建使基因校正的前体细胞具有分化和增殖优势，上述因素使IL2RG基因成为基因治疗的合适标靶。在年长患儿，IL2RG基因治疗不成功，可能由于缺乏功能性的T细胞前体细胞导致胸腺功能的早期丧失，提示基因治疗或干细胞治疗窗口期比较窄。有2例基因治疗SCID-Xl患儿出现克隆T细胞增殖，是由于在LMO-2位点的原病毒插入，导致成熟T细胞LMO-2的异常表达和不受控制的增殖。这种严重副作用在IL2RG基因的背景下风险更高，幼年造血特性利于原病毒在该位点的插入，因此该治疗不建议应用于非常年幼的患儿。与单倍型HSCT比较，IL2RG基因治疗的收益/风险评估提示至少4～6月龄以上是乐观的。潜在的更安全载体的应用，如自灭活的长末端重复、绝缘体和挽救自杀基因，会使更多患儿受益。

临时处置包括感染的治疗、免疫球蛋白的应用和抗生素的预防尤其针对卡氏肺孢菌感染的预防。如果B细胞植入失败需要长期静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）替代治疗。只有巨细胞病毒阴性，辐照（1 500～5 000RADS）的血制品才可以应用。避免接种活疫苗。

二、JAK3缺陷

【概述】

SCID是指一组少见的和遗传的原发免疫缺陷，导致宿主防御中免疫细胞发育和信号缺陷。IL2RG 突变导致 X-SCID，细胞因子亚家族（包括 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21）共享这个共同受体亚单位，故被重新命名为γc。细胞因子刺激诱导底物酪氨酸磷酸化，一组新的蛋白酪氨酸激酶被发现，被称为Janus家族激酶（JAK）。所有Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子受体均与JAK有关。JAK3的鉴定及其与γc的相关性提示JAK3是常染色体隐性SCID的候选基因，后续在SCID患儿中发现JAK3突变，JAK3-SCID患儿具有与X-SCID相似的T^-B⁺NK^-表型。

【发病机制】

在1994年，4个科研小组独立地完整克隆哺乳类的最后一个JAK，JAK3。JAK3的表达比较局限，主要表达于造血细胞、骨髓和淋巴细胞，伴随细胞发育和活化表达明显上调。JAK3基因敲除鼠具有SCID，与γc缺陷鼠类似，与人也一样，具有小胸腺，淋巴结缺如，α/β、γ/δT细胞数目降低，胸腺前体细胞明显降低。γc和JAK3缺陷影响多个细胞因子。淋巴细胞功能的明显缺陷可被IL-7信号缺陷所解释，很多证据提示IL-7对淋巴细胞发生、存活和分化至关重要。IL-7通过允许正确的T细胞受体表达，在胸腺内促进T细胞存活。IL-7对外周成熟T细胞的稳态也至关重要。IL-2对控制外周自身耐受起重要作用，推测机制为IL-2影响活化诱导的凋亡和胸腺选择。IL-2的主要功能是作为调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的原发生长因子。IL-2和STAT5通路在Th细胞分化为Th2或产生IL-4的亚群中起重要作用，可能参与减弱一些免疫疾病。IL-15对NK细胞的发生和存活至关重要，X-SCID和JAK3-SCID中NK细胞缺陷源自于该细胞因子信号缺陷。X-SCID和JAK3-SCID中B细胞功能不正常，B细胞分化受损，类别转换不正常，机制被认为源自于IL-4和IL-21信号缺陷。

【分子特征】

JAK激酶是非受体酪氨酸激酶。在哺乳动物，家族有4个成员：JAK1、JAK2、JAK3、TYK2。JAK的三维结构尚不清楚。所有JAK家族成员特征为7个不同的JAK同源（JH）结构域的存在，从羧基端命名。JH1是激酶结构域，缺乏src同源结构2或3（SH2或SH3），激酶活性与结合ATP的Lys855残基有关，活性受推测的活性环上的酪氨酸残基磷酸化调节。紧跟着一个相似的，非催化的假激酶结构域（JH2），具有调节功能。这种串联结构域使人想起双面的罗马神Janus，得以命名整个家族。JH2与激酶结构域JH1相互作用，也与特殊的信号蛋白相互作用，如STAT。JAK氨基端包含一个SH2样结构域（JH3～JH4）和一个Band-4.1，ezrin，radixim，moesin（FERM）同源结构域（JH6～JH7）。这个 300位氨基酸长度的FERM结构域，参与介导跨膜蛋白如细胞因子受体的相互作用。FERM与激酶结构域结合，正性调节催化活性。JH3、JH5参与JAK的装配，JH4具有一个SH2模体，意义不明。

受体被合适的配体配置后，受体亚单位或者重定向或寡聚化，使受体相关的JAK进入到合适的位置促进两个并列的JAK激酶反式磷酸化和活化酪氨酸残基，然后磷酸化受体亚单位细胞质尾部远端的多个酪氨酸残基，产生锚位来募集特殊的包含SH2结构域的STAT。依据受体和锚位，6个STAT家族成员之一通过SH2结构域被募集。一旦被募集到细胞因子受体复合体，STAT在单一的700位酪氨酸处被磷酸化，通过磷酸酪氨酸-SH2结构域的相互作用而二聚体化，转入细胞核，调节基因转录。

JAK3基因位于19p^12-13.1，开放阅读框为3 372bp，翻译为1 124位氨基酸的125kDa蛋白。JAK3突变导致7%～14%的SCID，表现为T^-B⁺NK^-表型。至少30余种突变被描述，分布于所有蛋白亚单位，大部分突变对蛋白表达和稳定有影响。极少数突变可导致突变的无功能蛋白。错义突变和小的框内突变可允许蛋白表达，但影响激酶活性、γc结合或细胞内转运。980和981位残基具有不同的功能，980位残基对正常催化活性是必要的，981位残基突变增加催化活性。JAK3的FERM结构域有2个关键功能：受体相互作用和激酶完整性的维持，突变抑制受体结合和消除激酶活性，提示FERM和激酶结构域间相互作用，如N端的JH7中del58A、JH7中D169E抑制受体结合和催化活性。JH2中G589S消除激酶活性，但不影响与γc相关。尽管JAK3催化活性对受体结合可有可无，星孢菌素（staurosporine）可改变激酶结构域的结构，破坏受体结合。单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）位点包括C759R和R582W。

【临床表现】

鹅口疮、难治性腹泻和严重反复呼吸道感染是最典型的临床表现。患儿一旦出现严重感染（尤其是肺部）（图2-1-2），即使进行骨髓移植，存活的概率也明显下降。骨髓移植时年幼是存活的最主要预测指标。

【实验室检查】

JAK3-SCID患儿具有典型的T^-B⁺NK^-表型。一些患儿具有相对正常的或高的循环T细胞，经常无功能。大部分JAK3缺陷患儿，淋巴细胞或永生化EBV转染的B细胞中的JAK3蛋白表达缺陷或明显降低。突变JAK3蛋白残余表达的患儿，适当的细胞因子体外刺激不能诱导JAK3和STAT5蛋白的酪氨酸磷酸化。事实上，Western检测JAK3蛋白表达正常也不能除外功能性JAK3缺陷。突变均导致B细胞的JAK3依赖的IL-2诱导的STAT5磷酸化缺陷。JAK3-SCID患儿的B细胞活化、成熟和抗体类别转换缺陷。

【治疗及预后】

JAK3-SCID患儿移植后非功能的宿主B细胞仍高，导致可变的宿主B细胞重建和经常无效的体液反应。移植后NK细胞也经常降低，伴NK细胞活性差或未重建。然而来自HLA相合供者的T细胞成功植入也可以获得好的体液免疫反应，由于供者T细胞和自主B细胞的相互作用。JAK3基因校正的细胞具有优势生长，JAK3基因治疗成功应用于动物模型。唯一一例JAK3-SCID患儿行基因治疗，2次植入基因校正的CD34⁺细胞最终未能重建免疫功能，作者推测可能与长期病毒感染损伤胸腺结构有关。

三、IL7RA缺陷

【概述】

IL-7最初被鉴定为由骨髓基质细胞和胸腺分泌的可溶性因子，对胸腺内T细胞发育、维持和恢复成熟T细胞稳态是重要的，但不影响B和NK细胞发育。IL-7受体α（interleukin-7 receptor α，IL7RA）基因突变导致T^-B⁺NK⁺SCID。除了经典SCID表型，IL7RA突变患儿也表现晚发的轻症临床表现和极少情况下出现免疫失调节如自身免疫性血细胞减少或Omenn综合征。

【发病机制】

IL-7Rα蛋白以膜结合形式或可溶性蛋白形式存在。在细胞膜，IL-7Rα是两种明显不同的细胞因子受体的组成成分，一个是IL-7，一个是胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）。高亲和力的 IL-7R 由 IL-7Rα 和 γc组成。TSLP受体由IL-7Rα和一个TSLP特异的亚单位TSLPR组成。用嵌合受体系统结构和功能分析证实IL-7Rα和γc细胞质内异源二聚体结构域为活化IL-7特异信号事件所必需。

IL-7与受体配置导致至少三个信号级联的始动：JAK/STAT通路的活化、PI3K的促发、Ras和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路的诱导。IL-7与IL7R结合后，主要事件之一是与IL-7Rα相关联的JAK1和与γc相关联的JAK3的活化，JAK可磷酸化IL-7Rα，允许STAT5和PI3K的募集。STAT5被JAK磷酸化，形成二聚体转入细胞核，调节IL-7依赖的基因转录。PI3K促发Akt活化，通过抑制Bad阻止细胞死亡。PI3K也可调节Tor激酶活性，最后导致几个核标靶的诱导，如活化的T细胞的核因子、NF-κB和cyclin D1。Ras/MAPK/ERK通路导致其他核标靶的诱导，如c-myc、STAT1/3、Ets转录因子。细胞因子活化抑制性负反馈对控制细胞因子介导的信号和避免持续细胞刺激至关重要。IL-7和STAT5控制CIS1、SCOS1、SCOS2的表达，这些分子阻断IL-7Rα介导的STAT5活化。

IL-7参与胸腺细胞存活和终末成熟，尤其在CD8⁺T细胞阳性选择过程中。IL-7也参与T细胞分化。PI3K主要参与存活和增殖，STAT5主要参与分化。在鼠而非人类中，早期B细胞发育需要IL-7，IL-7刺激前体B细胞增殖。IL-7可调节免疫稳态。IL-7Rα表达是记忆T细胞的标志。IL-7Rα是TSLPR的组成成分，人类TSLPR主要表达于单核细胞、树突状细胞和一些T细胞克隆。在人类，B细胞发育不需要IL-7介导的信号。IL-7信号通路缺陷不影响NK细胞发育和功能，对此鼠和人类的结论一致。

【分子特征】

人类IL7RA基因位于5p¹³，具有8个外显子，占据18kb基因组DNA。cDNA包括1 379个核苷酸，编码440个氨基酸组成的80kDa的Ⅰ型跨膜蛋白。由细胞内结构域、跨膜结构域、细胞外结构域组成。细胞外结构域与其他细胞因子受体Ⅰ型家族成员近似。尤其四个恒定的半胱氨酸残基位于细胞外结构域的氨基端，参与链间的二硫键形成。与跨膜结构域较近的细胞外结构域包含一个Trp-Ser-X-Trp-Ser（WSXWS）模体，参与蛋白的正确折叠。细胞外结构域也包括2个纤维连接蛋白Ⅲ型样的结构域。虽然细胞质结构域缺乏内在激酶活性，尾部包含几个结构和功能模体参与募集信号转导分子：一个酸性区（acid，A）位于跨膜结构域的近端，接着是含有丝氨酸（serine，S）区，更远的是含有酪氨酸（tyrosine，T）区。S区据推测与JAK1相互作用，T区的磷酸酪氨酸残基作为STAT5的锚位。T区Tyr449磷酸化对IL-7依赖的PI3K的活化至关重要。src家族酪氨酸激酶p56^lck和p59^fyn被募集至细胞质结构域的A区。各种类型突变均可见：剪接区突变、无义突变、错义突变、缺失突变。通常无建立者效应。所有的错义突变均累及高度保守的氨基酸残基。累及WSEWS模体的错义突变，影响蛋白的正确折叠、有效的细胞内转运和细胞表面膜受体的结合。目前所有突变均位于前5个外显子。无突变出现于跨膜区和细胞质结构域。具有几个多态位点，一些可以导致氨基酸改变。

【临床表现】

大部分患儿表现典型SCID的特点，前6月龄内起病，包括发热，反复感染，卡氏肺孢子菌肺炎，迁延性腹泻和生长不良，若不行HSCT，通常于1岁内夭折。散见部分型、不典型和延迟发病的患儿报道，甚至有自然逆转的情况出现。患儿可出现Omenn综合征表现。体细胞突变和母体嵌合共同存在有报道。

【实验室检查】

血清IgG水平变异大，IgA经常检测不到或降低，IgM水平变异大。患儿外周血淋巴细胞减少常见。B细胞正常或升高，CD3⁺T细胞明显降低，CD16⁺NK细胞正常或升高。对丝裂原和同种异体细胞的增殖反应缺陷。针对K562靶细胞的NK杀伤正常。

【治疗及预后】

HSCT是SCID治疗的基石。欧洲B⁺SCID患儿经HSCT后，HLA-相合的存活率为85%，HLA-不相合的存活率为64%，新生儿期行HSCT结果更好。干细胞主要来源于骨髓，也可来源于脐带血或外周血。所有HLA-相合的家庭成员供者，不用预处理。所有HLA-不相合家庭成员供者，均用化疗。马里兰和环磷酰胺最常用。一些患儿加用抗胸腺球蛋白。GVHD的预防或者用T细胞剔除，或者用环孢素A。移植后GVHD见于11%（2/19）患儿，比较轻。尽管所有患儿T细胞均重建，供者来源的B细胞仅在11%（2/19）患儿中检测到。自体B细胞持续存在，Ig水平正常，提示尽管遗传缺陷的B细胞存在，如果供者T细胞正常植入，正常抗体产生也可出现。

四、CD45缺陷

【概述】

在B⁺SCID中，B⁺NK^-SCID由X连锁隐性的γc和常染色体隐性JAK3缺陷引起；B⁺NK⁺SCID由常染色体隐性IL-7RA、CD45、CD3D、CD3E、CD3Z和Coronin1A缺陷引起。CD45是白细胞共同抗原，为高度糖基化的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸磷酸酶活性，在T、B细胞抗原受体信号转导中调节Src激酶活性。

【发病机制】

CD45分子在血细胞来源的所有有核细胞上都有表达，被称为白细胞共同抗原（leuekocyte common antigen，LCA），是大分子量的糖蛋白家族。缺乏白细胞共同抗原的T细胞克隆，TCRαβ、CD3、CD4、IL-2 受体（p55）、LFA-1、Thy-1 和 Pgp-1（CD44）表达正常，针对抗原或CD3桥连的增殖反应缺陷，但对IL-2增殖正常，提示T细胞针对抗原反应的细胞循环需要白细胞共同抗原。

跨膜的酪氨酸磷酸酶CD45以多种异构体的形式表达于所有有核血细胞，异构体源自于可变外显子的替代剪接。用同源重组的方法建立CD45基因纯合的可变的外显子6的突变鼠，B细胞和大部分T细胞不表达CD45。尽管Igμ诱导的增殖完全缺失，B细胞发育正常。在从不成熟的双阳性阶段到单阳性的过渡阶段胸腺细胞发育阻断，仅有少量的T细胞可以在外周淋巴器官检测到。超抗原诱导的反应性T细胞的克隆删除仍出现。对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的细胞毒T细胞反应缺陷。这些数据提示CD45参与B和T淋巴细胞发育和功能的机制不同。CD45敲除鼠示CD45在调节受体阈值中具有正性和负性作用，作用不同与细胞系和发育阶段有关。

CD45是淋巴细胞信号转导机制的重要组成部分，在T淋巴细胞抗原刺激的增殖和胸腺发育中起关键作用。蛋白酪氨酸激酶Src家族的2个成员，p56lck和p59fyn是CD45的生理底物，提示白细胞特异的蛋白酪氨酸磷酸酶如何影响T细胞抗原受体信号。酶活性所需的催化亚单位的结构特征已获得鉴定，但CD45的活性如何受调节仍不清楚。细胞外结构域不被T细胞受体信号转导所必需。

CD45与TCR复合体的基本生化相关性部分受CD45异构体表达的影响。CD45/TCR相关性的维持被TCR肽链配置不同所调节：部分激动剂肽链诱导CD45/TCR解离，而激动剂肽链以CD4依赖的方式促进持续相关，提示TCR信号通路被T细胞活化过程中的CD45到TCR相关的底物变化所调节。

【分子特征】

CD45基因位于1q^31.3-32.1，占据118 508bp，共有33个外显子，第一个外显子不编码肽链，第二个外显子包含起始ATG密码子编码信号肽，外显子3和外显子5～15编码细胞外结构域。外显子4、5、6的不同利用产生5个不同的同源异构体，外显子16编码跨膜肽链，外显子17～24编码细胞质的第一个同源结构域，外显子25～32编码第二个结构域，外显子33编码羧基端和完整的3′非翻译序列。

启动子活性位于高度保守的内含子1，非组织限制性，在3′端活性最强，该序列与已知启动子和始动子缺乏相似性。外显子1有替代的1a，和1b类似，可剪接至外显子2，该结构在鼠中仍存在。

CD45糖蛋白包含一个严重糖基化的细胞外结构域，单一的跨膜结构域，一个大的具有酪氨酸磷酸酶活性细胞质结构域。细胞外结构域包括黏液素样区，一个新的含半胱氨酸的区和含有三个假定的纤维连接蛋白Ⅲ结构域的区，主要有β片层二级结构，而没有α螺旋。

CD45糖蛋白以多种异构体形式存在，依赖于外显子4、5和6的替代剪接。相应的蛋白结构域被结合的单克隆抗体的特异性所识别，如CD45RA（外显子4）、CD45RB（外显子5）、CD45RC（外显子 6）和 CD45RO（外显子 4～6被剪接）。在 T细胞，CD45的替代剪接被调节，原始或未接触过抗原的T细胞主要表达CD45RA阳性的异构体，活化后转换为表达CD45RO。CD45RO表达与记忆T细胞表型有关。

Tchilian等于2001年证实1997年Cale报道病例1为CD45基因纯合的位于外显子6的6bp（339glutamine-340tyrosine）缺失，位于细胞外结构域的纤维连接蛋白Ⅲ型模块。2000年Kung报道病例2为CD45基因复合杂合的突变，位点1为母源的3′端的缺失，位点2为13号外显子供体+1G > A突变，导致内含子13中48bp的插入。2012年Roberts报道病例3为CD45基因含有c.1618A > T（p.K540X）突变的整个1号染色体的母源的单亲同二体。

【临床表现】

Cale等于1997年报道土耳其近亲父母的第一个男孩，2月龄表现为发热，皮疹，肝脾肿大，淋巴结肿大，肺炎和全血细胞减少。在血细胞层、肝脏病理组织、鼻咽分泌物和尿中均检测到巨细胞病毒。Kung等于2000年报道一例男孩，2月龄表现为SCID，最后2岁时死于B细胞淋巴瘤。Roberts等于2012年报道一例6月龄男孩出现严重的胃食管反流，生长不良，10月龄出现肺孢子虫病，其母亲在生产该患儿一年前，曾在怀孕7周时流产全三体胚胎。

【实验室检查】

病例1（1997年Cale报道）T细胞和免疫球蛋白降低。B细胞正常。所有有核的血细胞CD45表达明显降低，表达少量CD45RA和CD45RB，表达一些CD45RO。病例2（2000年Kung报道）淋巴结病理缺乏组织结构和生发中心，不表达CD45，所有白细胞CD45表达均缺失。外周血单核细胞计数在正常范围，T淋巴细胞明显降低。γδT细胞比例正常，αβT细胞比例明显降低。外周存在少量不活化的T细胞（CD25⁺细胞）。骨髓涂片示细胞形态正常，但白细胞不表达CD45。患儿细胞不出现增殖反应（< 1%正常对照）。B细胞升高，血清免疫球蛋白水平随年龄下降。患儿EBV转染的永生B淋巴细胞用流式细胞分析检测不到CD45表达，用Northern blot未检测到mRNA表达。病例3（2012年Roberts报道）有全血细胞减少，低丙种球蛋白血症，B、NK细胞正常，基本无T细胞。对植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）无增殖反应。骨髓涂片示细胞形态正常，但白细胞不表达CD45。

【鉴别诊断】

其他T^-B⁺SCID：γc，JAK3缺陷所致者通常NK细胞缺失。CD3D、E、Z缺陷所致者通常γδT细胞缺失。CD45缺陷与IL-7RA缺陷免疫表型最接近。根据CD45表达及基因测序来鉴别。

【治疗及预后】

治疗原则同SCID，尽早移植重建免疫。病例1于8月龄行骨髓移植，55天后死于巨细胞病毒再活化。病例2于2岁时出现B细胞淋巴瘤。病例3行母亲单倍型剔除T细胞的骨髓干细胞移植，未行移植后GVHD预防，移植后5年T细胞功能正常，继续给予丙种球蛋白替代治疗。

五、CD3缺陷

【概述】

SCID是T、B淋巴细胞功能缺失的综合征，如果无成功的免疫重建，婴儿期为致死性。目前报道4种主要发病机制：不正常嘌呤代谢导致的不成熟的淋巴前体细胞死亡（ADA）；细胞因子信号阻断（γc，JAK3，IL7-Rα）；TCR和BCR的 VDJ重组缺陷（RAG1，RAG2，Artemis）；Pre-TCR/TCR信号缺陷（CD45，CD3）。T 细胞受体复合体包含 α 和 β，或 γ和 δ　的可变链，与恒定的CD3的γ，δ、ε、ζ的异源二聚体配对。任何恒定的CD3异源二聚体链的缺乏在人类引起一组少见的T淋巴细胞免疫缺陷病。虽然CD3缺陷占SCID的一小部分3%，表型分析提示TCR/CD3复合体相关的功能的复杂性。

【发病机制】

多聚的TCR复合体由克隆性的TCRαβ或TCRγδ异源二聚体组成，与恒定的CD3链相关（CD3γ，CD3δ，CD3ε和 CD3ζ）。具有 α 和 β 链的 T 细胞，被称为 αβT 细胞，具有 γ和δ的T细胞，被称为γδT细胞。在发育过程中，CD3蛋白复合体在胸腺细胞从阴性不成熟前体，进展为双阳性阶段，最终发育为成熟的单阳性CD4⁺T或CD8⁺T细胞过程中起重要作用。TCR表达对胸腺内T细胞发育至关重要。CD3亚单位与胸腺细胞表达的Pre-TCR有关，后者由TCRβ和替代pTα链组成。Pre-TCR信号被进展为双阳性阶段和TCRα基因重组所需要。胸腺内T淋巴细胞分化需要来自Pre-TCR（PreTα/TCRβ）和/或TCR（TCRαβ或TCRγδ）的合适信号。Pre-TCR、TCRαβ和TCRγδ与3个信号转导复合体相关联，被命名为CD3δε、CD3γε异源二聚体和一个二硫键连接的 CD3ζζ。

成熟T细胞的TCR复合体在内质网中组装，最后的步骤是与同源二聚体CD3ζζ相关联，伴不完全的TCRαβ-CD3γ-CD3δ-CD3ε复合体。CD3ζ亚单位的加入对T细胞存活和TCR复合体转运至浆膜至关重要，因为不完全TCRαβ-CD3γ-CD3δ-CD3ε复合体迅速在溶酶体内被降解。TCR复合体配体结合的特异性由克隆性的TCRαβ或TCRγδ异源二聚体决定，CD3链通过ITAM作为信号转导亚单位。CD3γ，CD3δ，CD3ε链各具有一个ITAM，CD3ζ具有三个ITAM。这些ITAM由被9～12个残基分隔的2个酪氨酸组成。在配体与TCR结合后，ITAM在酪氨酸上被src-相关的激酶lck磷酸化。磷酸化的ITAM募集ZAP-70，启动TCR介导信号的下游事件，包括SLP-76和LAT适配子的募集。完整的αβTCR/CD3复合体在化学计量上最可能为αβ/γεδεζζ。每一个CD3链的细胞内基质可能不同，可引起不同的信号通路。

在鼠中，通过基因敲除使CD3γ、δ、ε或ζ选择性缺陷，引起不完全的轻度到重度T细胞发育阻断。CD3δ^-/-的鼠，胸腺细胞可发育到双阳性阶段，在外周可检测到一些成熟的正常表型的T细胞，具有TCRγδ⁺T细胞。CD3ε^-/-的鼠具有明确的双阴性阶段（CD44^-CD25⁺，DN3）阻滞，提示pre-TCR介导的信号缺陷。CD3ζ^-/-的鼠示双阳性，单阳性和外周T细胞明显降低，双阴性T细胞正常，外周T细胞表达低水平的CD3ε和无功能，在胸腺细胞和外周T细胞可检测到TCRβ基因重组。CD3γ^-/-的鼠，胸腺细胞分化阻断于双阴性阶段，无TCRγδ T 细胞，类似于 CD3ε^-/-鼠模型。

【分子特征】

用连锁分析的方法进行基因绘图，发现与疾病共分离的11q²³上的标志覆盖CD3D、E、G基因。在另一家系，用胸腺微阵列基因表达分析发现CD3D表达降低。CD3D基因外显子2纯合的C202T（C68X）突变，产生细胞外结构域截断的蛋白影响膜相关和表达。另一家系CD3D基因外显子3的纯合C279A（C93X）突变，位于细胞外结构域。受累婴儿的胸腺病理示 CD4、CD8 αβ mRNA、TCRα、β mRNA 和蛋白表达均减低，CD3亚单位的 mRNA 可检测到，提示发育阻断处于双阴性向双阳性过渡阶段。胎儿胸腺细胞具有中间的单阳性表型特征，如表达CD4⁺CD8^-CD45RO^-，该类细胞数减少，具有增殖功能的细胞部分明显降低（Ki67⁺）。上述数据提示CD3δ缺陷表型诱导的阻滞位于pre-TCR信号阶段，尽管胎儿细胞可进一步分化为中间的单阳性阶段（但不能增殖）。

在完全CD3ε缺陷家系，连锁分析提示疾病座位位于11q²³，外显子5的128位置的纯合2bp缺失，导致移码突变和截断的蛋白，由于缺乏跨膜结构域，推测蛋白不能表达于细胞膜，由于材料缺乏，不能进一步分析。部分CD3ε缺陷患儿免疫检查示T细胞表面TCR/CD3表达弱，CD3介导的活化受损，针对抗原的增殖反应正常。复合杂合的CD3E突变，包括位于细胞外结构域外显子6的一个无义突变，内含子7受体的一个剪接区突变使外显子8被剪接，使CD3ε表达量为正常对照的10%。

CD3ζ缺陷的纯合411insC突变导致T^-B⁺NK⁺-SCID表型。患儿缺乏成熟T细胞，外周有大量的CD3ε^lowCD4^-CD8^-细胞，外周有不同寻常的CD56^-CD16⁺的NK细胞。CD3ζ缺陷患儿由于体细胞突变使表型被部分纠正，患儿表现为反复感染和外周T细胞降低。90% T细胞表面TCRαβ和CD3ε表达降低，CD3ζ蛋白表达更低，只在细胞质内能检测到。剩余的10%T细胞TCRαβ、CD3ε、CD3ζ表达正常，但缺乏CD3ε介导的ZAP-70的磷酸化。患儿低TCR表达的T细胞检测到纯合的Q70X突变，患儿正常TCR表达的T细胞的Q70X突变被另一等位基因上的三个错义突变中的一个部分校正。

轻的CD3γ免疫缺陷与TCR/CD3复合体表达降低有关，TCR/CD3复合体在细胞表面表达比例为正常的1：4到1：5。CD8⁺T细胞计数降低。体外T细胞活化轻度降低。大部分细胞为记忆表型。复合杂合的CD3G突变，外显子1的第一密码子的A > G，使转录起始受损，内含子2的受体G > C，启动下游17个核苷酸后的隐藏的位点，使5个核苷酸后出现蛋白截断。

【临床表现】

完全性CD3δ缺陷患儿具有与SCID特征相关的表现，由于外周无成熟的T细胞，包括TCRαβ⁺和TCRγδ⁺T细胞，患儿表现早发的严重感染。完全性CD3ε缺陷患儿临床表现同其他SCID，为早发的严重感染：巨细胞病毒肺炎、腹泻和念珠菌病。部分性CD3ε缺陷的2岁患儿表现为反复流感嗜血杆菌所致的支气管肺炎，经过丙种球蛋白替代治疗后，目前已经18岁，除了严重的鼻窦炎外，其健康状况良好。一例完全性CD3ζ缺陷所致的T^-B⁺NK⁺-SCID婴儿于4月龄出现不明原因肺炎，后来出现慢性咳嗽，反复中耳炎，不生长，慢性轻度皮疹和沙门菌胃肠炎。10月龄因血小板减少入院，发现有巨细胞病毒感染。循环T细胞明显降低，淋巴增殖缺陷。一例复杂的CD3ζ缺陷患儿由于体细胞突变使临床表型部分被纠正，患儿表现为反复感染。

CD3γ缺陷患儿临床表现相对轻。一个CD3γ缺陷家系的一个同胞32月龄时死于自身免疫性溶血性贫血和肠病，另一同胞19岁基本正常，仅有轻微的自身免疫性疾病如白癜风和抗甲状腺抗体阳性。另一家系患儿7岁时仍健康，抗甲状腺抗体也能检测到。一例家系的2例健康者分别为20岁和30岁，仍存活，但另一例同胞死于SCID样症状。最近有报道2例完全性CD3γ缺陷患儿，具有致命的SCID样症状，但仅部分T淋巴细胞减少。

【实验室检查】

CD3δ、ε、ζ缺陷所致SCID患儿外周血具有严重选择性αβ T和γδ T淋巴细胞减少，缺陷的αβTCR/CD3和γδTCR/CD3表面表达。CD3γ缺陷患儿允许相当数量外周多克隆T淋巴细胞选择，表达相对高的功能性的αβTCR/CD3复合体，有不正常的化学计量（αβ/δεδεζζ），与 ζζ 二聚体的相关性受损。

【鉴别诊断】

1.导致T^-B⁺NK⁺SCID的其他基因突变

如IL-2RG、IL-7RA、JAK3、CD45突变。B淋巴细胞IL-2RG表达协助诊断IL-2RG突变，携带者母亲淋巴细胞X染色体非随机灭活支持IL-2RG突变可能。流式细胞检测IL-7RA表达协助诊断IL-7RA突变。STAT5磷酸化及JAK3表达协助诊断JAK3突变。二代基因测序有助于鉴别诊断。

2.完全性DiGeorge综合征

患儿通常具有甲状旁腺功能减退、低钙、先天性心脏病及异常面容等。原位杂交、芯片、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、二代测序均有助于检测22q11.2的杂合缺失。

【治疗及预后】

SCID表型者需要立即行干细胞移植来恢复免疫功能。临床相对轻的CD3γ缺陷患儿给予对症治疗，但需注意CD3γ缺陷患儿也有预后不良者，需积极治疗。

六、RAG1/2缺陷

【概述】

RAG1/2突变引起V（D）J基因片段重组缺陷，导致B和T细胞发育阻断，临床上经典患儿表现为T^-B^-NK⁺SCID。残留V（D）J重组活性与Omenn综合征（Omenn syndrome，OS）有关。

【发病机制】

所有的免疫球蛋白和TCR蛋白链包含2个结构域：恒定区和可变区，后者负责与抗原的特异结合。V（D）J重组过程通过一套V、J和一些病例的D亚基因元素中的一个片段进行组合，产生可变区结构域。所有的V、D、J基因片段组成不同长度的编码序列，位于重组信号序列（recombination signal sequence，RSS）的一侧（V和J）或两侧（D）。RSS是特异的非常保守的序列，包含一个七聚体（CACAGTG）和一个九聚体（ACAAAAACC）序列。七聚体序列直接与编码序列连接，九聚体序列由一个非保守的12或23位残基对长度的间隔与七聚体序列分开。有效的重组仅出现于一个伴12bp-间隔的RSS和另一个伴23bp-间隔的RSS间。在V（D）J重组的第一个步骤，2个淋巴细胞特异蛋白，由RAG1和RAG2编码，共同识别和结合RSS。Rag1结合于九聚体元素和募集Rag2，稳定的Rag1、Rag2、RSS复合体的形成指导与七聚体的相互作用。这个复合体在DNA靠上部的链引入一个缺口，在七聚体的5′端，遗留一个编码侧的3′羟基和一个信号侧的5′磷酸盐。Rag蛋白将缺口变为双链断裂，形成一个共价密封的发夹样编码端和一个5′磷酸化的钝的信号端作为切割的中间代谢物。当发夹样编码端被打开，核苷酸被添加或删除，增加免疫球蛋白和TCR分子多样性。如果额外的核苷酸源自于一个非对称打开的互补的添加，一个回纹结构被插入，被称为回纹核苷酸（P核苷酸插入）。一个不常见的DNA多聚酶TdT，可不需要模板来添加高达15个核苷酸，导致一个GC丰富的N区。V（D）J重组是B和T淋巴细胞发育的一个关键步骤，其缺陷导致B和T淋巴细胞发育阻断，表现为T^-B^-NK⁺ SCID。T细胞发育完全停止在CD44^-/lowCD25⁺阶段，B细胞发育停止在pro-B细胞阶段。

Omenn综合征（OS）是SCID的特殊表现形式，RAG突变是其主要的发病原因。OS的其他致病基因还包括 Artemis、LIG4、IL2RG、IL7RA、ADA 和 RMRP，也见于不典型完全性DiGeorge综合征。患儿的外周大量T淋巴细胞是宿主来源的，共同表达活化标志如CD45RO、DR、CD25、CD95、CD30和CD7，但抵抗进一步活化，细胞死亡增加，表现为无能，产生Th2型细胞因子。TCR多样性呈限制型，Vβ14经常高频率出现。RAG突变引起的OS患儿外周B淋巴细胞完全缺乏。RAG缺陷患儿的基因型-表型分析结果提示OS与残留V（D）J重组活性相关。目前仍然不知道为什么同样的RAG突变在一个人引起经典SCID，在另一个人引起OS。修饰基因如表观遗传和医源性因素可能起作用，但确切机制需要进一步阐述。不同的克隆归巢到不同靶组织，推测OS患儿体内存在未知的抗原促进少数T细胞克隆扩张并在体内持续活化。但目前没有明确的证据提示OS中大量淋巴细胞增殖单独由感染诱发。在OS鼠模型中，微生态在维持炎症和自身免疫中起重要作用。黏膜的B细胞缺陷改变微生态组成，引起细菌经肠上皮的转运。由Th1和Th17细胞维持的对共生微生态的T细胞耐受的丢失导致肠道炎症。抗生素应用可逆转大部分异常和降低血清IgE水平。

RAG-肉芽肿（granuloma，G）/自身免疫（autoimmunity，AI）表型的存在提示免疫失调节，可能的机制包括T细胞耐受缺陷，如胸腺结构的不正常、皮髓质分界消失、自身免疫调节子（autoimmunue regulator，AIRE）和AIRE依赖的组织限制性抗原（tissue-restricted antigen，TRA）表达缺失见于RAG缺陷所致的SCID、OS和联合免疫缺陷病（combined immunodeficiency，CID-G/AI）患儿。FOXP3⁺Treg细胞产生降低见于减效RAG突变患儿和鼠。Treg细胞抑制活性受损和表型不正常。不变自然杀伤T细胞（Invariant natural killer T cell，iNKT）细胞缺陷。自身反应性T细胞（和B细胞）稳态增殖。B细胞耐受缺陷证据包括减效RAG突变患儿广泛的自身抗体存在，RAG突变鼠模型自身抗体分泌细胞的增殖提示在这种情况下B细胞耐受也被破坏。OS患儿骨髓B细胞受体编辑降低促进自身抗体产生。通过影响结合到不同RSS的DNA片段质量，RAG突变也影响在免疫前谱系形成中抗体编码元素的选择，伴V区基因富集，与自身免疫相关，如IGHV_4-34。外周B细胞耐受不正常也见于RAG缺陷患儿。RAG缺陷患儿和鼠血清B细胞活化因子（BAFF）明显升高，反映B淋巴细胞减少和炎症。升高的BAFF可挽救自身反应性B细胞的存活。通过体内感染鼠巨细胞病毒，除了T细胞和B细胞，Rag^-/-鼠的NK细胞具有更成熟表型和细胞毒活性增加，但不能增殖，持续作为长期记忆NK细胞的能力下降，修复DNA双链断裂（double-strand breakage，DSB）能力下降。

【分子特征】

RAG1和RAG2处于11p¹³上同样的染色体座位区域，相隔8kb，以尾对尾的方式相邻，编码区域的内含子缺乏提示转座因素。核心区域是指体外重组外源质粒物质和体内DNA切割的最小的区域。非核心的Rag部分在反应的很多方面产生重要作用，包括RSS识别/切割、末端处理连接和蛋白更新调节。除了启动子区域，2个调节区域被认为增强子或座位控制区域（locus control region，LCR）的一部分位于Rag2的两侧。抗沉默因素，对抗位于RAG1和RAG2基因间的沉默子。E3连接酶活性归于Rag1的非核心区。磷酸化位点位于Rag2的C端。

Rag1的N端（1-383）是保守的。N端也包括一个二聚体结构域，由一个C₂H₂锌指（C₂H₂ zinc finger，ZFA）和一个C₃HC₄锌结合模体所定义。N端也包括一个核定位信号，通过与温度敏感RNA多聚酶1突变抑制子（suppressors of a temprature-sensitive RNA polymerase 1 mutation，srp1）、rag 队列 1（rag cohort 1，rch1）和一个九聚体结合结构域相互作用促进Rag1转运。Rag1的催化核心（387-1011）：一个九聚体结合结构域（nonamer-binding domain，NBD，394-460）；二聚体化和 DNA结合结构域（dimerization and DNA-binding domain，DDBD，461-517）；pre-RNase H（PreR，518-590）；催化 RNase H（catalytic RNase H，RNH，591-721）；锌结合结构域（722-965），包含2个不同的区域伴经典的丝氨酸和组氨酸锌结合残基（ZnC2，ZnH2）；羧基端结构域（carboxy-terminal domain，CTD；966-1008）。在 Rag1 的核心区域，一个DDE基序（天冬氨酸600和708，谷氨酸962）是一个活性位置，重组特征类似于细菌的转座酶和反转录病毒的整合酶，在此协同一个或多个二价阳离子。二价阳离子活化一个水分子参与水解的DNA缺口反应或活化发夹形成中转酯化反应中的3′羟基。Rag1活性核心也参与Rag2的相互作用。

大部分与OS相关的人类RAG1基因错义突变位于核心结构域，3个突变位于N-TR。Rag1的GGRPR模体的396位氨基酸的不同替代突变见于几例OS患儿。一小部分与CID-G/AI相关的错义突变，主要位于DDBD、PreR、CTD结构域，尽管这些突变可保留一些重组活性，但影响V（D）J重组过程的质量。Rag1的NBD错义突变损害RSS识别和切割。D600、D708、E962突变取消体内重组，阻断切割，但允许RSS结合。p.R561H突变降低Rag1/Rag2相互作用。催化结构域的突变（p.E722K，p.K830X，p.L885R，p.Y912C，p.R975Q）不能产生DNA缺口。

Rag2结构为一个6-叶片β-螺旋桨分子，由527位氨基酸组成，一个核心结构域（1-383），一个非核心区域（384-527），后者包含一个植物同源结构域（plant homeodomain，PHD；414-487）。尽管Rag2不参与RSS九聚体的结合，通过与DNA编码序列侧面相互作用，稳定Rag复合体与九聚体元素的结合。位于C端PHD突变可不同的影响Rag2功能。Rag2第二个β链的疏水和富甘氨酸区域对Rag1-Rag2相互作用、RSS识别和DNA切割至关重要。可变的环区突变对Rag1-Rag2相互作用或介导重组的能力无影响或作用甚微。核心的组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成染色质的重要单元核小体。Rag2的C端在V（D）J重组中作为染色质和重组酶的直接桥梁。

有报道T细胞不同第二位点突变的存在（体细胞逆转嵌合），恢复RAG1阅读框，导致错义突变，位于Rag2相互作用结构域。甚至RAG1基因多个体细胞第二位点突变导致OS被报道。

【临床表现】

RAG突变占所有SCID和SCID相关情况的19%，是不典型SCID和Omenn综合征的主要原因。经典SCID患儿起病年龄通常在生后数周，机会性感染主要累及肺和肠道，真菌（卡氏肺孢菌、白色念珠菌、曲霉菌）、病毒（巨细胞病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒）和细菌（卡介苗、铜绿假单胞菌）为主。由于患儿T细胞无能，有时由于母体T细胞输入或输注未辐照的血制品表现为GVHD。活疫苗接种也引发疾病，如卡介苗播散感染导致危及生命。OS患儿特征为SCID症状伴红皮病，嗜酸性粒细胞增多，肝脾肿大，淋巴结肿大和血清IgE升高。在一个家族内，患儿可表现不同的T^-B^-NK⁺SCID或OS，提示基因外因素或其他不可知的因素在决定临床表现和结局中起重要作用。除了T^-B^-NK⁺SCID和OS，RAG突变相关的其他表型还包括轻的（leaky）或不典型的（atypical）SCID；SCID伴γδT细胞扩张；迟发的 CID-G/AI；特发的CD4⁺T淋巴细胞减少；常见变异型免疫缺陷病；选择性IgA缺乏；特异抗体缺陷；高IgM综合征；无菌的慢性多灶骨髓炎等。残留V（D）J重组活性患儿易出现各种自身免疫特征，包括血细胞减少、白癜风、牛皮癣、重症肌无力及吉兰-巴雷综合征。

【实验室检查】

RAG突变所致T^-B^-NK⁺SCID患儿外周血T和B淋巴细胞完全缺乏。RAG突变引起的OS患儿外周血B淋巴细胞完全缺乏。OS患儿外周血T淋巴细胞HLA-DR⁺CD45RO⁺，提示活化和记忆表型共存，对进一步活化抵抗，TCR谱呈寡克隆性限制。

经典SCID患儿脾的T细胞依赖区淋巴细胞耗竭，淋巴组织如淋巴结、扁桃体、腺体和集合淋巴小结（Peyer’s patches）缺乏或发育不良。OS患儿淋巴组织内存在大量活化记忆的T淋巴细胞增殖。

构建能在人类细胞自主复制的含有染色体外V（D）J重组基质的质粒，与RAG1、RAG2共同转染人类细胞，检测体内Rag重组活性。或以流式为基础的基于绿色荧光蛋白表达的分析来评估Rag重组活性。用野生型或突变的人类RAG1重建Rag1^-/-鼠的pro-B细胞，通过细胞内绿色荧光蛋白的表达来评估Rag重组Ighc的能力。DSB修复机制在Rag缺陷患儿不受影响。

【鉴别诊断】

Artemis缺陷：是引起T^-B^-NK⁺SCID的常见原因，患儿皮肤成纤维细胞（或骨髓细胞）对引起DNA双链断裂的基因毒性试剂敏感性增强（离子辐射或博来霉素）。Artemis缺陷患儿经预处理HSCT后较Rag缺陷患儿更易于出现严重的长期毒性（生长迟缓、内分泌缺陷、肾小管和牙齿异常）。大部分突变位于N端的1/2，位于metallo-β-lactamase/β-CASP区域，代表完全失功能位点。几例减效的Artemis突变见于OS或B细胞淋巴瘤患儿。

【治疗及预后】

T^-B^-NK⁺SCID患儿根治方法为干细胞移植。Rag缺陷SCID患儿非清髓单倍型HSCT后更易于排斥移植物。临床表型谱变异大会影响Rag疾病的及时识别，可能延迟治疗。早期RAG1基因治疗鼠恢复免疫功能需要辐照和淋巴细胞内高拷贝数的载体。RAG1基因治疗鼠B淋巴细胞低于正常水平。上述数据均提示RAG1基因校正的淋巴前体细胞在Rag^-/-鼠的胸腺和骨髓内仅具有小的选择优势。RAG2缺陷基因治疗的临床前结果较乐观。由于减效RAG2突变内源的非校正淋巴前体细胞的竞争，基因治疗是否有效有待观察。

七、放射敏感-重症联合免疫缺陷病

【概述】

DNA双链断裂（DSB）是DNA损伤的致命形式，可导致基因组物质的丢失或重排，导致细胞死亡或肿瘤事件发生。DSB可被电离辐射诱导或出现于细胞内的正常DNA复制、减数分裂和V（D）J重组过程中。DSB的诱导产生一系列级联事件包括断裂感知、信号转导和效应功能。参与的细胞机制包括DNA修复、细胞周期检查点停滞和凋亡，这些机制共同来限制DNA突变的产生和损伤细胞的增殖。

非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）是哺乳动物DNA双链断裂的主要修复机制。共5种蛋白发挥作用，其中2个Ku亚单位（DNA-dependent protein kinase DNA-binding subunit，Ku70/80）和DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）组成 DNA-蛋白激酶（DNA-PK）复合体，另外 2个成分是X射线修复交叉-互补蛋白4（the X-ray repair cross-complementing protein 4，Xrcc4）和DNA连接酶4（DNA ligase IV，LIG4）。由于射线明显诱导DSB，NHEJ蛋白缺陷使细胞系和动物模型具有明显放射敏感性。在免疫反应发生中，V（D）J重组过程包括出现程序性DSB和重新连接以产生多样的T、B细胞谱系，NHEJ重新连接这些程序性DSB。NHEJ缺陷由于不能有效产生V（D）J重组，导致（重症）联合免疫缺陷发生，这一亚类被称为放射敏感-（重症）联合免疫缺陷病［RS-（S）CID］，目前发现的致病基因包括连接酶4（LIG4）、非同源末端连接 1（NHEJ1）/XRCC4 样因子（XLF）/Cernunnos、Artemis（命名自辅助生育的希腊狩猎神）/DCLRE1C、DNA-PKcs。患儿经常具有其他特征，包括小头、面部异常、生长迟缓等。

【发病机制】

NHEJ起始于Ku异源二聚体与双链DNA断裂的结合，募集DNA-PK催化亚单位（DNA-PKcs）产生DNA-PK复合体。DNA-PK促进断端处理过程，包括删除形成和单链DNA区域的填入。连接需要产生于多核苷酸激酶/磷酸酶过程（polynucleotide kinase/phosphatase，PNKP）的3′OH和5′P末端。DNA-PK通过磷酸化促进PNKP过程。末端处理可能也需要核酸酶活性。DNA-PK与结构特异的核酸酶Artemis相互作用。至少在V（D）J重组中，DNA-PK通过重塑DNA末端促进Artemis活性。DNA-PK募集NHEJ连接复合体，包括XRCC4、LIG4、XLF。LIG4的N端有一保守的连接酶区，又被分为DNA结合结构域和腺苷化结构域。一个串联的BRCA1C-端（BRCT）结构域位于LIG4的C端。XRCC4是同源二聚体，与单链DNA上的LIG4分子结合。LIG4与XRCC4紧密相互作用，调节相互的稳定性。相反，XLF是连接复合体的弱结合成分。在胚系细胞，每一V、D或J片段有一编码区和一侧的重组信号序列。VDJ重组起始于RAG1/RAG2重组酶删除2个重组信号序列，形成突触复合体，包括2个发夹末端和2个黏性末端的DSB。黏性末端形成于重组信号序列，通过核心NHEJ蛋白重连接形成环或倒置结构。编码序列起始于发夹结构，需Artemis剪接发夹结构，随之通过TdT和polμ或λ聚合酶的过程，核苷酸添加、填入或删除出现。这些末端修饰进一步增加免疫球蛋白和T细胞受体基因的多样性。

DSB的存在也启动一个信号反应，其引起DSB邻近的染色质广泛改变和活化的细胞周期检查点停滞等过程。共济失调-毛细血管扩张症突变基因（ataxia-telangiectasia，mutated，ATM）激酶是DSB信号反应中心。此外，减数分裂重组11同源1（meiotic recombination 11 homolog 1，MRE11）、结合 ATP 的盒子（ABC）-ATP 酶［ATP-binding cassette（ABC）-ATPase，RAD50］、Nijmegen 断裂综合征蛋白 1（Nijmegen breakage syndrome protein 1，NBS1）形成复合体（MRN）被ATM信号反应所需要，至少参与活化和募集ATM。ATM、MRE11、RAD50、NSB1缺陷患儿具有放射敏感和不同程度免疫缺陷。针对DSB信号反应对DSB整体修复仅有中度影响，ATM和MRN（MRE11/RAD50/NBS1）组成蛋白对NHEJ的15%起作用，也是通过慢动力学修复。

【分子特征】

LIG4综合征是第一个遗传确认的RS-CID异常。小鼠LIG4破坏导致胎内致死性伴广泛神经元凋亡，因此，患儿所有突变都是减效突变。突变分布于整个基因。经常位于腺苷化结构域，结构分析预测影响腺苷酸复合体形成。用cDNA互补放射敏感表型，或鉴定与LIG4/XRCC4相互作用蛋白，导致XLF的发现（也被称为Cernunnos，或NHEJ1）。尽管很难证实患儿XLF突变使功能丧失，一些突变确实导致蛋白截断。目前的证据提示XLF缺失可明显影响NHEJ，但对NHEJ不是至关重要。Artemis缺陷是RS-SCID的最常见原因。在V（D）J重组过程中，Artemis在打开发夹中间物中起重要作用，但不具有其他重要发育作用，基因敲除小鼠可以存活。在NHEJ中，Artemis的作用与其他核心NHEJ成分明显不同，Artemis可重连接15%放射诱导的DSB。一大部分患儿具有Artemis基因组缺失，导致Artemis的cDNA起始转录点的缺失和蛋白表达缺失。减效突变可导致不典型（leaky）表型，其重要性逐渐获得认识。DNA-PKcs缺陷的小鼠出现SCID表型，而无其他异常，与无效Artemis突变小鼠近似。DNA-PKcs突变不影响DNA-PK激酶活性，而影响Artemis功能。

【临床表现】

尽管RS-SCID代表极端表型，可见到放射敏感伴不同免疫缺陷，从Omenn综合征（OS）到联合免疫缺陷（CID）或全血细胞减少或进展性免疫缺陷。

第1例LIG4突变患儿无明显表型如免疫缺陷，但14岁时出现急性淋巴细胞白血病。对头部放射治疗过度反应并死于放射损伤。后续诊断的患儿均具有明显免疫缺陷，大部分患儿因残留T、B细胞表现为CID。一些患儿具有SCID表型，1例患儿表现为Omenn综合征。另外，小头、生长迟缓和异常面容常见。小头出生后即出现，但呈非进展性。一些散发的发育异常见于骨异常患儿。淋巴肿瘤见于一小部分患儿（图2-1-3），主要见于伴有轻度免疫缺陷患儿。尽管小头严重度与免疫缺陷严重度相关，1例有SCID表型患儿无小头或生长迟缓，提示这些表型可以是分离的。

小头和生长迟缓是所有XLF（Cernunnos/NHEJ1）缺陷患儿的一个特征。XLF缺陷患儿临床类似于较严重LIG4综合征患儿。

无效Artemis突变患儿具有SCID表型，T、B细胞缺如，需要骨髓移植。小头、生长迟缓或异常面容不见于无效Artemis突变患儿。减效Artemis突变患儿经常表现进展性免疫缺陷病。1例表现Omenn综合征。EBV相关的淋巴瘤经常见于减效Artemis突变患儿。

2009年DNA-PKcs缺陷患儿被报道，临床表现同无效Artemis突变患儿，即SCID不伴其他发育异常。另1例DNA-PKcs缺陷患儿具有明显神经元表型，如明显小头和发育迟缓，神经元退行性变呈生后进展性。

【实验室检查】

1.减少或缺失的T、B细胞是NHEJ缺陷患儿的常见表型。胸腺新进输出功能明显降低（原始CD4，TREC）、淋巴增殖功能缺陷或明显降低、母体嵌合的存在有助于诊断不典型患儿。基因测序分析可明确诊断。

2.详细的放射敏感分析可协助区分基因型。

（1）所有LIG4综合征患儿皮肤成纤维细胞显示放射敏感和DSB修复能力降低。由于突变是减效的，残留的DSB以慢动力学方式出现重连接，通常暴露后24～72小时所有DSB都重连接。而LIG 4综合征细胞具有正常放射诱导细胞周期检查点反应。V（D）J重组表型显示重连接频率稍增加伴信号连接不准确性升高。

（2）XLF缺陷患儿皮肤成纤维细胞放射敏感水平和损伤的DSB修复程度和LIG4综合征患儿近似。

（3）将无效Artemis突变患儿的细胞暴露于X或γ射线导致一部分DSB长时间不修复（长至21天），与LIG4综合征和XLF缺陷患儿细胞明显不同。放射（3Gy）后1～7天，LIG4综合征和XLF缺陷患儿细胞的所有DSB均被重连接。

（4）具有SCID表型不伴发育特征患儿的DNA-PKcs突变不影响DNA-PK激酶活性，而影响Artemis功能。具有明显神经元特征患的DNA-PKcs突变对蛋白水平和活性有明显影响。

【鉴别诊断】

1.共济失调毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT）及AT样异常（AT like disorder, ATLD）

患儿表现为进展性共济失调和神经退行性变，但无出生时小头。但最近1例MRE11缺陷患儿具有小头而非进展性共济失调。AT由ATM突变引起，ATLD由Mre11突变引起。ATM是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，对DSB诱导的信号转导过程至关重要。电离辐射暴露后ATM被活化，然后磷酸化参与细胞周期检查点控制和DNA修复的蛋白。ATLD家系具有Mre11突变，患儿表现为轻症AT临床特征。ATM和Mre11突变患儿细胞系具有放射敏感，但能正常修复。AT和ATLD细胞显示电离辐射暴露后检查点停滞缺陷。

2.Nijmegen断裂综合征（Nijmegen breakage syndrome, NBS）

患儿具有小头、生长迟缓、轻到中度智力低下和异常面容。NBS细胞系不能产生nibrin蛋白，其与其他2个蛋白形成复合体（hMre11和hRad50），参与核转运。这些复合体聚集于DSB附近的核位置。患儿细胞具有放射敏感，但MRN（Mre11/Rad50/Nbs1）不是NHEJ的核心组成，大部分放射诱导的断裂可被正常修复。NBS细胞显示电离辐射暴露后检查点停滞缺陷。

3.ATR-Seckel综合征

患儿表现为严重胎儿生长受限、明显等比例身材矮小、明显小头、智力低下和特征面容。共济失调毛细管扩张症和Rad3相关蛋白3（ataxia telangiectasia and Rad3-related protein，ATR）是与ATM相关的针对DNA损伤的信号反应的重要参与者。但与ATM不同，针对停止的复制叉和大量损伤中产生的单链DNA区域反应，不但对发育而且对体细胞生长至关重要。不具有放射敏感特征，无免疫缺陷，无肿瘤倾向。电离辐射的ATM依赖的反应正常，但紫外线暴露后ATR依赖的介质（H2AX、p53、Nbs1和Rad17）磷酸化受损。

【治疗及预后】

SCID可通过骨髓移植治愈。但RS-SCID患儿，尤其是LIG4综合征患儿对防止移植物抗宿主病的预处理方案过度反应。避免应用诱导DSB药物的替代方案是必要的。Artemis缺陷患儿移植后远期预后不乐观。尽管骨髓移植可治愈RS-SCID的免疫缺陷，但非免疫的体细胞仍保留DSB修复缺陷，因此需严密监测此类患儿以期早期发现可能的恶性肿瘤。尽管目前无证据显示此类患儿对常规X射线和CT的低剂量辐射反应异常，但仍存在恶性诱变的高度可能性。细胞放射敏感不伴有缺陷的DSB修复或伴有细胞周期特异的DSB修复缺陷已有报道，增强目前实验分析的有效性会协助诊断，如γH2AX foci计数方法等。

八、网状发育不全

【概述】

De Vaal于1959年描述新生男性双胎，患儿具有正常红细胞和血小板但无白细胞，分别于5天和8天死于败血症。尸检提示骨髓缺乏粒系成分，胸腺和脾缺乏淋巴细胞。骨髓和淋巴组织中网状细胞丰富，因此该病的发病机制被认为是这些网状细胞不能发育为粒细胞的母细胞。网状发育不全（reticular dysgenesis，RD）是最少见和最严重的联合免疫缺陷病，特征为先天性无白细胞，淋巴细胞减少，淋巴组织发育不良和胸腺不生成，临床表现严重进展的新生儿期感染。2009年两个独立的科研小组证实网状发育不全由常染色体隐性腺苷酸激酶2（adenylate kinase 2，AK2）基因突变所致。

【发病机制】

核苷单磷酸激酶，包括腺苷酸激酶（AK），在核苷三磷酸和单磷酸间催化可逆的磷酸化。AK2是一种线粒体酶，主要分布于线粒体膜间的空间，作为线粒体氧化磷酸化产生的高能磷酸组转运网络的一部分，催化ATP+AMP=2ADP反应。这些ADP可被腺苷酸核苷转位酶（adenine nucleotide translocator，ANT）转运到线粒体基质。在基质，ADP沿着线粒体内膜通过氧化磷酸化建立起来的质子泵梯度被ATP合成酶磷酸化为ATP。ATP被ANT转运出基质，作为细胞能量消耗过程的中心能量来源。尽管在细胞培养和动物模型中已阐明一些重要的特征，但AK2在器官（骨髓和内耳）和血细胞系（粒细胞系和淋巴细胞系）中特异性仍知之甚少。Pannicke等于2009年在斑马鱼中敲低AK2导致不正常白细胞发育，证实AK2在进化上的功能保守性，为白细胞分化的AK2选择性提供在体证据。Lagresle-Peyrou等于2009年用表达野生型（A+B）的慢病毒（Lentiviral）载体转染RD患儿来源的CD34⁺细胞，结果提示AK2的补充可纠正缺陷的粒细胞生成。用Lentivirus介导的短发卡RNA转染干扰患儿CD34⁺细胞AK2表达，AK2表达下调使粒细胞和粒细胞前体细胞下降，与中性粒细胞分化阻断有关。Burkart等用干扰RNA转染脂肪细胞（3T3-L1）和B细胞白血病1（B cell leukemia，BCL1）细胞来耗竭AK2，导致前者adipectin分泌和后者IgM产生受损，在两者的分化过程中诱导非折叠蛋白反应。在HL-60细胞中敲低AK2可特异性抑制中性粒细胞分化。在斑马鱼中AK2缺陷影响造血干细胞和前体细胞发生伴氧化应激和凋亡增加。RD患儿成纤维细胞来源的诱导的多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）具有特征性的位于原幼粒细胞阶段的粒细胞系发育停滞，AMP/ADP比例增加，提示能量耗竭的腺嘌呤核苷谱。通过Lentivirus介导的短发卡RNA基因转移至RD患儿造血前体细胞或HL-60细胞系敲低AK2，导致前体细胞增殖和存活能力降低，分化阻断于淋巴样和粒细胞分化阶段。AK2缺陷损伤全面的线粒体功能尤其氧化磷酸化。RD-iPSC来源的血管生成干细胞的核内ATP分布降低，转录谱有明显变化，结果提示在血细胞分化过程中AK2维持细胞核的ATP供应具有阶段特异的作用，此过程可影响控制多能前体细胞命运的转录谱。

【分子特征】

人类AK2的cDNA具有2个转录本，一个为AK2A，239位氨基酸的蛋白，分子量26.5kD；一个为AK2B，232位氨基酸的蛋白，分子量为25.6kD。AK2A具有6个外显子，AK2B具有7个外显子，区别在于羧基端区域。AK2的氨基端和羧基端，分别包括核苷和底物结合结构域，结合Fas相关的死亡结构域（Fas-associated death domain，FADD）的羧基端死亡结构域。蛋白主要表达于肝脏、心脏和肾，肺低表达，脑和骨骼肌无表达。三个结构域对酶活性是重要的：22～30位氨基酸组成磷酸结合环（phosphate-binding loop，P-Loop），45～74位氨基酸组成NMP结合结构域（NMP binding domain），141～178位氨基酸组成ATP结合结构域（ATP binding domain，LID）。

AK2位于1p^35.1，占据25 687bp基因组，分为7个外显子。截至目前，38例患儿20余种突变被报道，包括错义、无义，剪接区突变和大的、小的缺失突变，累及7个外显子。几乎所有突变均导致AK2蛋白表达缺失。Ala182Asp突变患儿表现为轻的联合免疫缺陷，具有正常数量的中性粒细胞和淋巴细胞。

【临床表现】

1/3患儿是早产儿，2/3是小于胎龄儿。93%患儿1个月内起病，74%生后一周内起病。59%患儿出现细菌性败血症，是最常见的感染并发症，17%出现脐炎，其他诊断时的表现有腹泻、慢性乳突炎、肠梗阻、轻度呼吸窘迫、腹胀、间质肺炎、体重降低或不增、上呼吸道感染、腹水、肝脾肿大、胆汁淤积性肝病、贫血、血小板减少所致的出血点。败血症病原包括：白色念珠菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，无乳链球菌、草绿色链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌。侵袭性念珠菌病和先天性巨细胞病毒为非细菌病原，可引起严重和致命的感染。机会性感染如肺孢子虫病，获得性巨细胞病毒或呼吸道反复病毒感染在RD患儿中未见报道。1/2具有其他血液异常如贫血和血小板减少。57%具有母体T淋巴细胞，31%具有皮疹。可见Omenn综合征报道。有2例患儿表现为轻的联合免疫缺陷病，中性粒细胞和淋巴细胞正常。几乎所有患儿均具有感觉神经性耳聋。有骨骼异常的报道。

【实验室检查】

无白细胞及中性粒细胞，淋巴细胞明显减少。8% NK细胞数目正常，16% B细胞数目正常。尽管一些患儿可见一些T、B或NK细胞，但这些细胞无功能。骨髓涂片35%发育不良，19%过度增殖，85%示粒细胞分化停滞于原幼粒细胞阶段。35%可见异常形态的淋巴生成，在一些病例与恶性病不好区分。

胸腺非常小，组织检查示小叶数量减少，被相对厚的结缔组织分隔，组成小叶的细胞几乎均为网状细胞，皮髓质分界不清，淋巴细胞尽管在髓质区呈小灶样存在，数量明显降低。类似于初始的胸腺小体的小的嗜酸性的团块存在。尽管窦状隙结构可识别，淋巴结非常小，几乎缺乏淋巴细胞，淋巴滤泡不可见，少量组织细胞存在于窦道。脾大小正常，缺乏淋巴组织，存在少量髓外造血（由于巨核细胞存在），动脉周围的袖套不存在，间质结缔组织少许增多，吞噬细胞辅衬一些窦道。

【鉴别诊断】

1.伴粒细胞减少的其他SCID

通常2月龄前不出现严重感染，机会性感染如肺孢子虫病导致的呼吸衰竭或巨细胞病毒系统性感染常见，而在RD患儿中未见报道。RD患儿由于无白细胞，起病更早，表现严重的侵袭性细菌感染。RD患儿由于需要粒系重建，对预处理的要求更高。而SCID患儿的T细胞植入较容易。

2.新生儿先天性粒细胞减少

如Swachman-Diamond、Kostmann综合征等。前者属于骨髓发育不良的致病原因之一，通常伴有骨骼异常，胰腺外分泌功能不全。后者为严重先天性中性粒细胞缺乏的致病原因之一，淋巴系统不受累及。

3.伴有粒细胞减少的原发性免疫缺陷病

如布鲁顿无丙种球蛋白血症［又称X连锁无丙种球蛋白血症（X-linked agammaglobulinemia，XLA）］、X连锁高IgM综合征（X-linked hyper IgM syndrome，XHIGM）等。由于母体来源的免疫球蛋白保护作用，细菌性感染通常起病晚。XLA患儿具有低的或无丙种球蛋白，外周血B细胞缺如。XHIGM患儿IgG、IgA、IgE明显降低，IgM正常或升高，肺孢子虫病高发。

【治疗及预后】

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）不能增加外周血中性粒细胞数量。有2例患儿G-CSF延长刺激导致骨髓发育不良综合征。RD的持续治愈除了需要淋巴系重建，也需要粒系重建。在植入前无患儿感染病毒。HSCT后由于粒系植入失败6个月后死亡者均具有持续或反复无粒细胞。不给予预处理，HSCT不能克服无粒细胞。预处理方案需包括清髓的药物和T细胞剔除来达到稳定的淋巴粒系前体植入。成功骨髓移植后生长和发育不受影响。

九、ADA缺陷

【概述】

腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）是嘌呤补救通路的酶，分别催化腺苷（adenosine，Ado）和脱氧腺苷（deoxyadenosine，dAdo）脱氨为肌酐及脱氧肌酐。ADA遗传缺陷可导致常染色体隐性不同严重程度的免疫缺陷异常。临床表型包括经典的新生儿起病的快速进展的致命的SCID；延迟发病者病情进展比较缓慢；晚期发病者在青春期或成人期发病；部分型ADA缺陷者无明显免疫缺陷。ADA缺陷是系统性代谢疾病，还导致神经发育、肝脏、骨和骨髓缺陷，也包括中性粒细胞和巨噬细胞失功能。

【发病机制】

红细胞内的ADA是可溶性的单聚体，与骨髓、胸腺细胞、活化的T细胞和几个组织的上皮细胞相关的ADA也以外酶的形式存在，与细胞膜糖蛋白CD26/二肽基肽酶Ⅳ结合形成 > 200kDa的复合体。CD26作用为胸腺细胞增殖和T细胞受体介导活化的膜共刺激子。ADA作为外肽酶，参与调节一些细胞因子和荷尔蒙的活性。

Ado和dAdo的脱氨作用出现于细胞内正常的嘌呤代谢过程中。腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）通常在大部分组织被AMP脱氨酶脱氨，一小部分被ADA通路降解。dAMP，不像AMP，不是AMP脱氨酶的底物，必须降解为dAdo，dAdo是ADA的底物。在纯合ADA缺陷患儿，dAdo被Ado激酶或dAdo激酶再转化为dATP，在细胞更新中很少积聚。

Ado和dAdo是ADA缺陷发病机制的主要参与者。Ado和dAdo大量产生于胸腺、骨髓和淋巴结内凋亡细胞，在ADA缺陷背景下被异常代谢，产生不同的生化活性。ADA缺陷揭示dAdo和来源于非生理补救的过多dATP的病理作用，如抑制DNA合成和转甲基，触发淋巴细胞凋亡。dATP促进细胞色素C从线粒体中释放，与凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor1，Apaf-1）相互作用形成凋亡复合体始动凋亡的执行相。ADA缺陷鼠的淋巴组织生化研究和用ADA抑制剂脱氧考福霉素（deoxycoformycin，dCF）处理淋巴细胞白血病患儿的淋巴母细胞研究提示dAdo和dATP可引起淋巴细胞耗竭。对dAdo的研究兴趣源自于ADA-SCID患儿红细胞内dATP大量升高和尿中dAdo升高。红细胞dATP水平与ADA基因型和免疫缺陷严重度相关。因此，dAdo-相关的机制被一些学者认为是淋巴细胞减少的原发因素。由于dAdo竞争抑制，红细胞S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，AdoHcy）水解酶活性降低。AdoHcy积聚对转甲基化反应的抑制可导致免疫缺陷和肝损伤。

最初的假说认为Ado诱导的淋巴细胞内cAMP形成是淋巴细胞减少的原因。最近研究显示Ado受体结合对T、B淋巴细胞抗原受体配置反应的下游效果可影响分化、存活或功能，如外源Ado可抑制BCR刺激的B细胞NF-κB的活化。Ado可通过阻断NF-κB的活化驱使BCR刺激的B细胞至无能反应。Ado较dAdo引起淋巴细胞凋亡效果不明显，主要作用于胸腺细胞的晚期阶段。Ado通过其受体介导的对TCR、BCR活化的影响可能导致ADA缺陷的SCID，但尚不清楚单独Ado是否影响淋巴细胞生成导致明显淋巴细胞减少。

推测结合于CD26的细胞外ADA调节细胞外Ado水平和通过Ado的G蛋白偶联的Ado受体来转导信号。Ado通过4个G蛋白偶联受体产生很多生理作用。细胞外Ado浓度可升高10～100倍，保护心血管、神经元和其他组织免于低氧或损伤。淋巴或髓系细胞Ado受体可活化和调节炎症。

【分子特征】

鼠的ADA具有一个平行的α/β结构，8个β带组成的桶环绕以8个α螺旋，活性位点包含一个重要的紧密结合的Zn²⁺离子。人类ADA与鼠ADA具有83%的同源性，可能具有相似的结构。但鼠ADA，不与鼠（或人）的CD26形成复合体。

ADA基因位于20q¹³，占据32kb的基因组，包含12个外显子，编码一个363位氨基酸组成的41kDa蛋白。遗传异质性明显，包括错义突变62%，剪接区突变18%，缺失突变13%，无义突变7%。大部分反复的错义突变源自于CpG二核苷酸的密码子序列。1/2突变出现于单个家庭。大部分是复合杂合突变。纯合突变与近亲或来源于同一地域有关。R211H、G216R各占11%和13%，L107P、R156H、A329V、955del5各占5%～7%。基于鼠的ADA结构，只有几个突变影响保守活性位点残基或与基质直接接触（E217K）或与重要的Zn离子相互作用。大部分氨基酸替代远离活性位点。

特定突变出现于表型轻的多个患儿，而不出现于SCID患儿，结合红细胞dAXP水平与临床严重度相关，提示位点的组合使ADA功能水平高于一些关键阈值，使临床表型轻。红细胞ADA酶活性在大部分患儿均可检测到，但在所有表型均明显降低，反映红细胞内ADA低表达和蛋白更新缺乏，利于不稳定突变酶的丢失。部分缺陷患儿外周血淋巴细胞或细胞系ADA酶活性位于5%～70%之间，免疫缺陷患儿ADA酶活性1%～2%。瞬时转染Cos细胞系体外ADA表达用于评价克隆突变位点的功能影响，但内源的ADA酶活性阻止低突变活性的准确定量，使这些评估不准确。

在缺失细菌ADA酶的大肠埃希菌SØ3834细胞株中表达ADA的cDNA，可检测可溶性ADA活性水平和免疫活性的ADA蛋白。免疫缺陷患儿的可溶性ADA酶活性值位于0.001%～0.6%，部分缺陷的健康人为1%～28%。根据ADA酶活性可将基因型和位点进行等级化，缺失和无义突变处于0级，代表无活性；SØ3834中ADA活性升高的氨基酸替代突变位于Ⅰ～Ⅳ级；剪接区突变单独分组。根据鼠的ADA结构，大部分Ⅰ组位点位于活性位点附近，Ⅱ组位点一般不位于此区域，Ⅲ和Ⅳ组位点主要位于外周螺旋。在一些患儿，同一残基的不同氨基酸替代可位于同一组，在其他患儿可位于不同组。所有10例0/0和0/Ⅰ组，Ⅰ/Ⅰ组中的18/20例患儿具有SCID表型，因此90% SCID患儿具有表达 < 0.05%的ADA活性的位点组合。仅有1/31 SCID患儿具有一个Ⅱ～Ⅳ组的位点。5/6Ⅱ组的位点来自迟发患儿。Ⅲ组位点与迟发、晚发和部分型缺陷有关。所有Ⅳ组位点来自部分型缺陷患儿。两个Ⅳ位点在E.coli中表达1%～1.5%野生活性，目前被定义为维持免疫功能的ADA表达的低限值，< 0.05%野生型ADA活性与SCID有关，< 0.06%～0.6%与迟发或晚发表型有关，> 1%～1.5%与至少在20岁前的有效的免疫功能有关。部分型ADA缺陷者无明显免疫缺陷，虽然红细胞ADA缺乏，但其他细胞表达5%～80% ADA活性。尚不清楚部分型ADA缺陷患儿是否进展为免疫缺陷状态。

【临床表现】

ADA缺陷程度、dATP积聚和尿dAdo分泌与疾病严重度相关。ADA缺陷具有临床和代谢异质性。通常用SCID、延迟发病、晚期（或成人）发病和部分型ADA缺陷来区分临床严重度水平。大约85%的ADA缺陷患儿表现典型SCID（图2-1-4）。大约15%的ADA缺陷患儿在婴儿后期发病，有更明显延迟的病程，但在生命的头几年最终也会死于该病（图2-1-5）。ADA-SCID占所有SCID的14%，表现为明显淋巴细胞减少和细胞、体液免疫丧失，导致婴儿期反复皮肤、呼吸道、胃肠道伴有机会性病原的感染和不生长，通常生后1岁内获得诊断。延迟发病患儿由于联合免疫缺陷表现为临床病情加重，通常1～10岁间获得诊断。晚期发病者表现明显的免疫和临床病情加重，通常10岁后发病而获得诊断。部分型缺陷患儿红细胞较ADA-SCID红细胞无更明显缺陷，但淋巴细胞及淋巴细胞系较ADA-SCID具有较高的酶活性，故不出现免疫缺陷。部分型ADA缺陷患儿淋巴细胞的ADA活性检测显示三种突变类型：一种为酸性的，低活性，热稳定的突变；一种为碱性的，某种程度略高活性的，热不稳定突变；一种为相对正常活性，热不稳定突变。通常受累的同胞表型相似，但也有不一致表型报道，与剪接区突变或体细胞嵌合有关。

肋软骨杯口样、肩胛骨下角呈直角及马刺样和轻度骨盆发育不良见于1/2 ADA-SCID患儿。常见转氨酶轻到中度升高。可见不同的神经异常（运动异常、眼球震颤、感音性耳聋）。

【实验室检查】

实验室异常包括淋巴细胞减少。血清各种免疫球蛋白降低，特异抗体缺乏，对丝裂原、回忆抗原和同种异体细胞的体外淋巴细胞增殖反应缺失。X射线或核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）示无胸腺。目前基于TREC分析的新生儿筛查会漏掉非经典ADA缺陷。有患儿仅表现为κ链删除重组删除环（K-deleting recombination excision circle，KREC）降低而非TREC降低。

ADA缺陷的诊断基于红细胞ADA酶活性 ≤ 2%。几乎所有的免疫缺陷患儿的错义突变导致不稳定蛋白，在患儿细胞或细胞系或将克隆的突变cDNA表达于大肠埃希菌，免疫检测的ADA活性降低或缺陷。杂合子ADA活性功能检测困难，因为很多绝对的杂合子的ADA活性处于正常参考值的低限。

ADA缺陷患儿在血浆和红细胞聚集底物Ado，在尿中分泌中度升高的Ado和明显升高的dAdo。除此之外，dATP是dAdo的代谢产物，在红细胞和淋巴细胞中明显升高。ADA缺陷诊断的生化基础主要基于红细胞内dATP浓度。红细胞dATP、dAXP水平的代谢表型与临床严重度相关。红细胞内明显升高的dAXP是ADA-SCID的特征。血浆和尿里痕量的dAdo是严重受累婴儿特征。红细胞dATP（dAXP）在SCID升高300～1 500倍，延迟发病/晚期发病者升高30～300倍，部分缺陷升高0～30倍。大约5%的正常活性可维持正常免疫功能。用质谱的方法提示新生儿期已经存在dAdo和Ado的升高。质谱的方法也可以筛查出部分型ADA缺陷患儿，该类患儿不出现免疫缺陷症状，也不需要治疗。

除了明显升高的dATP（和总dAXP），由于dAdo对AdoHcy水解酶（AdoHcyase）的灭活，ADA缺陷患儿AdoHcyase活性<正常对照的5%。

【鉴别诊断】

1.PNP缺陷

嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）是嘌呤补救途径的酶，可逆地将肌酐和尿苷转变为次黄嘌呤和鸟嘌呤。PNP缺陷是少见的常染色体隐性的联合免疫缺陷。患儿具有明显的T细胞缺陷伴可变的B细胞功能。临床表现为反复细菌、真菌、病毒感染，不生长，各种神经系统异常，肿瘤和自身免疫疾病。临床表现多开始于1岁内，但也可于婴儿期后起病。诊断经常基于淋巴细胞减少伴低尿酸和红细胞PNP酶活性降低。预后不良。干细胞移植是根治方法。

2.其他基因缺陷所致的SCID

非系统性代谢性疾病，无ADA酶的缺陷，无需输辐照的红细胞，不需要PEG-ADA酶替代治疗。干细胞移植是根治方法。

【治疗及预后】

各种抗细菌、真菌、病毒药物治疗现症感染。预防卡氏肺孢菌感染。丙种球蛋白替代治疗。其他治疗原则同SCID治疗。

可用正常冷冻辐照的红细胞多次部分输血交换，可明显降低代谢物浓度，但代谢物浓度不会完全达到正常，免疫功能有改善。经此治疗一些患儿可以存活至3岁，但没有1例输红细胞的患儿免疫功能恢复正常。输红细胞6周后，尽管红细胞的Ado和dAdo仍高，但血浆内dAdo已经检测不到。

每周1～2次肌内注射聚乙二醇修饰的牛腺苷脱氨酶（polyethylene glycol-modified bovine adenosine deaminase，PEG-ADA），PEG-ADA不进入细胞，在血浆内清除循环的Ado和dAdo。每周15～60U/kg可使血浆总ADA活性大于输红细胞的2～10倍以上。在6～8周内可使红细胞内dATP和AdoHcyase水平恢复至正常。免疫功能恢复时间及程度可变。约3～4个月后针对丝裂原的淋巴增殖反应升高，胸腺影出现。有些患儿B细胞先于T细胞出现，在恢复的早期可引起免疫失调节。酶替代治疗较骨髓移植易于出现正常的特异抗体反应。特异体液免疫功能恢复的一个特征是在大部分经PEG-ADA治疗的患儿中抗ADA的IgG抗体出现，持续时间可长于一年，不引起副作用，但可增加PEG-ADA的清除。可每周2次PEG-ADA治疗，或短期应用高剂量的丙种球蛋白或激素。

PEG-ADA治疗可恢复保护性免疫功能，但不是正常的免疫功能。大部分长期酶替代治疗的患儿仍具有T淋巴细胞减少，丝裂原刺激的增殖反应波动于正常对照的30%～90%。约1/5的患儿尤其早发的SCID患儿，甚至在维持高循环ADA水平下，T细胞计数和体外功能仅轻度改善。在预处理前，PEG-ADA需停用数周至3个月。在酶替代治疗时评估血浆ADA酶活性很重要。免疫恢复紧跟代谢异常的纠正，维持剂量达到如下目的：血浆ADA 活性位于 4 200～9 700nmol/（s·L）；红细胞 dATP 降至 ≤ 5～15μmol/L 或 < 1% 总红细胞（ATP+dATP）。

干细胞移植是ADA-SCID的根治方法。基因治疗已成功应用于ADA-SCID的治疗。