第三节　丙型肝炎病毒变异与准种

一、变异

（一）变异率

HCV RNA的突变率是原核和真核DNA复制突变率的10⁶倍，达10^-3～10^-4nt/（碱基位点·a），因此很难见到序列完全相同的2个无关的HCV分离株。HCV在黑猩猩中的变异率为（0.9～1.92）×10^-3nt/（碱基位点·a）。HCV感染黑猩猩8.2年后，HCV 的核苷酸变异率为1.18%。对美国1例慢性丙型肝炎患者的一个4923nt HCV片段进行序列分析，发现经过13年之后，核苷酸及氨基酸的突变率分别为2.5%及2.6%，突变率为1.92×10^-3nt/（碱基位点·a），E2区的基因变异最高，达4.6%，其中一个39nt片段有11nt突变，9aa编码发生改变。5'-NCR及C基因变异率只有0.7%～1.4%。对HCV-H株感染的慢性丙型肝炎患者及HC-J4株感染的黑猩猩分别进行为期13年及8年的动态追踪，发现HCV各基因都出现不同程度的变异，且HCV在人与黑猩猩中的变异率有所不同。HCV基因的变异并非随机，E基因变异最大，而5'-NCR最小。

（二）变异形式

HCV变异以点突变为主，多为转换，少数颠换。不同HCV分离株的转换和颠换率有所差异，如HCV-JT株与HCV-J株间碱基转换率高达83.7%；而HCV-JT株与HCV-1株转换与颠换率大致相同。病毒突变可分为同义突变和非同义突变。所谓同义突变，即碱基突变并不改变所编码的氨基酸，对表型无影响。非同义突变指改变其编码的氨基酸，并导致表型的改变，从而影响病毒的毒力及其对抗病毒药物的抵抗力等。HCV E1和E2区点突变所引起的氨基酸突变率最高，但NS2区突变常不引起氨基酸的改变。

HCV偶可出现插入突变及缺失突变，如HCV-J株和HCV-BK株分别在NS5区有3nt缺失，HC-J6 株 E2 区有 3 处分别插入 3nt、3nt、6nt，NS5 区有 2 处分别插入 12nt、60nt，同时有2处12nt、3nt的缺失。如果HCV基因组中出现插入或缺失，特别是非3倍数的插入或缺失，可引起移码突变，影响多肽的氨基酸序列，甚至影响HCV的转录与翻译。

（三）变异的产生机制

1.RNA依赖的RNA聚合酶的作用

RNA依赖的RNA聚合酶无校正功能，HCV基因组是直接在RNA依赖的RNA聚合酶指导下进行复制的，而RNA依赖的RNA聚合酶缺乏5'→3'校正功能，病毒复制可发生随机突变，复制中的错误掺入无法校正，最终导致HCV的高度变异。

2.易误性RNA依赖的RNA聚合酶的存在

在HCV复制过程中存在易误性RNA依赖的 RNA 聚合酶（error-prone RNA dependent RNA polymerase，EPRDRP），也是导致高度变异的重要原因。

3.宿主免疫力的正选择作用

由于宿主免疫选择压力的作用，使能有效激活宿主免疫应答的HCV基因的变异高于其他基因。与抗-HCV抗体结合的HCV分离株同体内游离的HCV准种株间的HVR不同，推测抗-HCV抗体一方面具有阻止HCV与肝细胞的黏附作用，另一方面又使体内产生不同的准种株以逃逸机体的免疫应答，使本来处于劣势的或不能诱导机体产生特异性抗体的HCV准种株被正选择成优势种群。在无γ球蛋白血症的丙型肝炎患者中从未发现HVR的变异，也支持正选择作用。

4.负选择作用

HCV基因组中各种基因的结构及功能不同，有些区域高度保守，如5'-NCR，否则就会产生缺陷型病毒，影响病毒的复制及活性。

二、丙型肝炎病毒准种

（一）准种的概念

1971年Eigen等首先提出RNA分子的复制机制，进而引出了准种的概念。所谓准种（quasispecies），是指物种基因组的核酸序列在统计学上高度一致，但个体之间又存在差异的一组群体。与基因型或亚型不同，准种的同源性高于前两者。基因型是病毒在长期与生存环境的相互作用过程中突变不断累积，以至于造成核酸序列的显著差别；准种是对于感染单一病原体的具体患者，在相对较短的时间内，突变造成体内同时存有基因序列微小差别的种群，这种差别程度一般不超过核苷酸总长度的2%～5%。

准种的演变是从一个原始的特定病毒序列开始的，该病毒的每一轮复制均导致变异株的出现。因此，在任何时点，某病毒群（viral population）总是由常见的代表性序列即主序列（master sequence）和同一组不同的但又密切相关的序列（变异株）所组成。所有这些相关的序列（变异株），不管其所占比例如何，均被认为是一群复制体（replicon），表现为动态的基因相互作用（dynamic genetic interaction）。当环境发生改变时，在原病毒群中已存在的各种变异株，以及在复制过程中新生代的变异株中，将被选择出最适应于新环境的变异株。之后，被选择出的变异株又面临新环境的变化。为了其子代能继续复制，将再次被选择出适应新环境的变异株。如此周而复始，不断形成新的病毒群，即准种。

（二）准种的特性

1.主序列（master sequence）

指初次感染时的病毒主要序列。

2.共有序列（consensus sequence）

指与主序列不同但又密切相关的序列。综合基因组每一个位点上最常见的核苷构成的序列，由PCR产物的直接测序或至少3个克隆的序列分析获得。

3.准种的复杂性（complexity of quasispecies）

包括不同变异株的百分比（即各变异株的频率）和变异株的多态性（polymorphism）或变异株谱（mutant spectrum）。前者是指各变异株在该病毒群中所占比例；后者表示多态性位点数，即变异位点数除以片段长度乘以所分析的克隆数。

准种的复杂性对区别两个准种群的特点具有重要意义，特别是当两个准种群的优势序列相同时尤为重要。准种的复杂性与准种存在的时间、初次感染时的病毒群数量、所分析的基因区突变率及不同变异株的复制率有关。准种的复杂性低提示该病毒群系近期感染。如在初次感染或再次感染时病毒群数量很大（如输血或持续应用血制品），则准种的复杂性高；如患者只感染一个或少数几个复制病毒，则准种的复杂性低。病毒各基因区的突变率高或变异株的复制率高，则准种的复杂性也高。

4.突变率（rate of mutation）

指基因组复制时发生变异的频率，它取决于基因复制的保真度、参与病毒复制的酶及环境条件（如细胞质的核苷酸浓度以及存在致突变因子等）。RNA病毒的平均突变率为10^-3～10^-5/每个基因组/每一复制循环。由于RNA病毒的复制率高，因此只需若干个复制循环即可形成由多种变异株组成的准种群。

由于HCV缺乏合适的细胞培养系统，因此难以确定每一个复制循环的突变率。但是，通过对HCV感染者的随访研究，可了解HCV的平均突变率。例如：通过比较8～13年间从人和黑猩猩分离的HCV优势序列，估计HCV基因组的平均突变率为（1.44～1.92）×10^-3/（碱基位点·a）。此突变率与引起持续性感染的其他病毒相似。

上述突变率是通过对间隔多年后所获得的HCV克隆核苷酸全序列计算出来的。但是，在基因组内各区域的突变率是不同的。如果是比较于短期内获得的克隆序列，而且是某一特定的基因区，则其突变率可能不同。这在HCV E2区的HVR1尤为明显，因该区突变率最高。此外，E1、E2和NS2区的突变率也较高，较C区和NS3区高5倍。

（三）准种的分析方法

最早分析准种的方法是用RNA指纹图法（RNA finger-printing），但是，由于HCV RNA在血清中的浓度很低，因此，不能直接用RNA“指纹图法”检测，需用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增后才能分析。

目前分析HCV准种的方法有以下几种：

1.RT-PCR产物克隆序列测定法（sequence of cloned RT-PCR products）

将 HCV RNA RT-PCR产物克隆至大肠埃希菌，然后从10～20个独立克隆（每个克隆代表一个病毒基因组）分离DNA，并测定其序列。

2.单链构象多态性分析法（single-strand conformation polymorphism，SSCP）

应用非对称PCR获得单股DNA，然后分析单股DNA在非变性凝胶中的电泳速度。在特定条件下，DNA片段的电泳速度由其结构所决定。病毒基因组的每一个变异均导致结构的改变。因此，在电泳时，各变异株的电泳方式不同。SSCP法是目前最常用的方法，但它只能分析较少数量和较短片段的变异而不适用于分析基因群和较长片段的变异。

3.温度梯度凝胶电泳法（temperature-gradient gel electrophoresis，TCGE）

HCV RNA经RT-PCR扩增后，获得DNA链，其间形成杂交子（hybrids），此种杂交子也称异种复制子（heteroduplexes），它是由一个野毒株序列和一个或两变异株序列所组成，这些杂交子含有错配子（位于DNA链的错配位点）。由于错配导致杂交子的稳定性下降，因此，在温度梯度凝胶电泳时，杂交子在特定的位点融化。不同变异株在RT-PCR过程中形成不同的杂交子，而不同杂交子的稳定性各不相同，从而导致各变异株不同的电泳特点。

4.异源双链泳动分析法

异源双链泳动分析法（heteroduplex mobility analysis，HMA/heteroduplex gel shift analysis，GSA），亦称异源双链示踪检测法（heteroduplex tracking assay，HTA）。此法早期主要用于艾滋病病毒异质性研究，主要原理是基于DNA分子的变性和复性过程。在DNA经过变性后复性时，如反应系统中存在两种或两种以上具有一定同源性的核酸分子链，不同来源的两链同源区可配对形成双链，此即异源双链；异源双链内出于存在碱基错配或不配区域，分子构象发生改变。不同于同源双链，通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），同源性越高，泳动就越快。反之则慢。

5.限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析法

HCV在某一个相同的区段由于个别碱基的变异导致了某些酶切位点的改变，PCR产物经多种不同限制性内切酶酶切和电泳后，即可得到特异性的酶切图谱。此法对于限制性酶切点发生突变的检测十分有效，但对某些靶序列并不适合。

在丙型肝炎患者的每毫升血清中，存在成千上万个不同序列的HCV变异株，现有的准种分析方法只能提供较为常见的变异株分布资料，但不能提供少见准种的资料。因此，准种分析方法尚需进一步提高。

（四）准种的生物学影响及临床意义

在HCV感染过程中，由于病毒高突变率使其进化很快，在短时间内即可改变病毒群的表型。而且感染时间长、血清HCV RNA水平高的慢性丙型肝炎患者准种数量较多，认为HCV感染的慢性化过程实际是HCV准种产生速度大于宿主免疫清除能力的过程，随着感染时间及病程的延长，HCV准种数量不断增加。其生物学影响包括：可形成众多代次的各种变异株，如逃避免疫应答的变异株、逃避疫苗的变异株、耐抗病毒治疗的变异株，细胞嗜性的改变，以及毒力和宿主范围的变化等。对抗病毒药物的耐药的出现仅需要特定蛋白的一个或数个氨基酸的改变。有些耐药病毒株在抗病毒治疗前即以少量群体存在，因此在治疗期间可迅速得以选择成为优势病毒群。

1.准种与持续性感染

HCV不整合于宿主的基因组，但常引起持续性感染。HCV持续性感染并不局限于HLA-DR单型患者，提示存在其他的致病机制。关于HCV持续性感染的致病机制目前有如下几种解释：

（1）使HCV致细胞病变的能力下降：

①HCV在复制过程中不断产生有缺陷的变异株，这些有缺陷的变异株在细胞内复制可影响野毒株的复制，因此，总的病毒产量减少，从而降低了病毒的致细胞病变能力，有利于病毒的持续感染；②产生致细胞病变力低的变异株；③产生复制率低的突变株；④细胞与病毒共同进化（cell and virus co-evolution）使肝细胞产生对HCV致细胞病变的耐受力，从而导致HCV的持续性感染。

（2）产生逃避宿主免疫应答的变异株：

宿主对HCV的免疫应答是主动的，可限制病毒的产生。用HCV合成肽反复刺激HCV慢性感染患者的外周血单个核细胞（PBMC），发现50%患者的PBMC对多种HCV多肽有特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。在感染的肝组织中存在介导的、能有效清除感染HCV的肝细胞所必需的组分。肝脏HCV特异性CD8⁺CTL活性阳性的患者，其ALT水平明显升高，淋巴结内CD8⁺细胞数增加，病毒滴度较低，组织学上肝炎活动度较高，提示HCV特异性CTL通过调节病毒复制，在宿主防御中起重要作用。HCV基因组的中和抗体或CTL表位突变可逃避宿主免疫应答，并导致持续感染。从一只HCV持续性感染的黑猩猩中发现，在NS3解旋酶区保守的CTL表位发生单aa突变后，即不能被野毒株的CTL所识别。研究表明，针对NS3区内的保守表位的CTL，能够选择出有利于在宿主内持续存在的变异株。在急性感染期，清除HCV患者的CTL活性明显高于后来发展成慢性感染的患者，这一表位的突变仅见于发展成慢性感染的患者。然而，细胞免疫应答可针对多个表位，因此单个表位的突变不一定意味着病毒能够成功逃避免疫系统。

此外，逃避体液免疫应答的变异株也有报道，它可能是HCV持续感染的另一个重要原因。免疫抑制的患者如肝移植第一阶段的患者、合并感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的患者、CD4数量减少的患者以及免疫球蛋白缺乏症患者，其HCV准种的复杂性低，也支持宿主免疫应答与HCV持续性感染的关系。在HCV感染者体内能够发现不被所存在的抗体所识别的病毒变异株，支持抗体介导的免疫选择。输血后丙型肝炎患者的研究表明，在发展成慢性感染的急性期，HCV HVR1准种的异质性增加，而在急性自限性感染患者，这种异质性降低。这些结果提示，在发展成慢性感染的患者，免疫系统不能完全控制感染，因为出现多重逃避突变株。

（3）病毒的适应性（viral fitness）：

病毒具有适应性，为了适应环境改变而不断变异、不断选择，产生适应新环境的变异株并继续复制，从而导致持续性感染。

每当HCV基因组突变产生时，都有可能不是中性的。当正在复制的病毒已经很好地适应环境时，新的突变有衰退的倾向，复制能力降低。当复制的病毒对环境不是很好地适应时，某些突变可能有利，导致选择出新的变异株。已经明确，低复制能力的病毒群的有利突变的概率，比更适应的病毒群高。

2.准种与肝损害

一些研究提示，HCV可能有直接致细胞病变作用：①急性和慢性丙型肝炎患者的肝组织学提示HCV有直接致肝细胞损伤作用；②用原位杂交法检测感染HCV的黑猩猩肝组织，可测到负链HCV RNA，并与血清丙氨酸转氨酶（ALT）升高相一致；③一些体外细胞系研究也证明，HCV复制可引起细胞裂解；④合并感染HIV及免疫球蛋白缺乏症患者的HCV感染较为严重；⑤HCV核心区和包膜区准种群的异源性与肝组织学严重程度有关；⑥HCV准种的异源性与ALT水平高低有关。但是，也不能排除宿主免疫应答在肝损伤及控制病毒复制中的作用。

同一患者处于不同的感染状态时，体内的准种株数量也有差异，并随病情的加重而增多，如肝癌＞肝硬化＞慢性丙型肝炎。随着病程的延续，体内先前存在的某些准种株逐渐消失，而出现一些新的优势准种株。分析肝癌细胞及其癌周细胞HVR的变异情况，发现两者序列差异很大，说明在这两种组织中存在不同的准种株，而不同准种株对肝细胞的亲和力及致癌作用也有所差异。

3.准种与对干扰素治疗的应答

Okada等首先报道HCV HVR1区的变异程度与对干扰素的应答有关。之后，一些研究证实，准种的复杂性与对干扰素的应答有关，含HCV准种复杂性高的患者常对干扰素治疗应答差或无应答。Poliak等认为，对干扰素治疗有无应答取决于变异株间的差异程度，而不是变异株的数量。但另一些学者报道，对干扰素有应答和无应答的两组患者，在治疗前其准种的复杂性并无差异。