第三节　乙型肝炎病毒基因分型

一、乙型肝炎病毒基因分型原因及基因型分布

自1979年克隆出第1株HBV DNA全序列后，相继有几百株HBV DNA全序列被相继克隆并收录入Genbank中，而至今尚未发现2株序列完全一样的HBV株。为了更好地研究HBV，根据HBV基因序列差异的多少，将HBV划分为不同的基因型。根据HBV全基因序列异质性≥8%的标准，目前将HBV分为A～H 8个基因型。最近有研究提出同一基因型的不同分离株由于毒力和临床表现的区别，有必要再分为基因亚型，如基因型A可分为Aa、Ae、Ac三种基因亚型，基因型B可分为Ba（a代表亚洲）、Bi（i代表日本）两种基因亚型，基因型C可分为C1～C4四种基因亚型，基因型F可分为F1、F2两种基因亚型。HBV基因型的分布具有人种和地域性的特征。A基因型主要分布在欧洲西北部和北美洲，B型和C型主要分布在亚洲东部，D型最多分布于欧洲南部和中东，E型基本分布于非洲西部，F型发现于美洲中部和南美洲，G型在法国、美国和墨西哥有零星分布，H型在美国中部有少量分布。我国以B和C两种基因型为主，也有少量的A和D基因型和B/C基因型混合感染，其中北方以C型为多，南方以B型占优势，各省之间不完全相同。近年来研究发现，HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物的表达、致病性、乙型肝炎的病程和转归及对药物的敏感性有关，HBV基因型具有非常重要的意义。

二、乙型肝炎病毒基因分型方法

（一）HBV全基因组测序分型法

1988年Okamoto等测定了从日本和印尼的3名无症状携带者的血清中克隆3株adw亚型的 HBV DNA全长序列。这3株HBV的基因组均含有3 215bp，其序列之间的差别仅为3.9%～5.6%。但这3株序列和已报道的源于美国携带者的相同亚型的2个HBV基因组差别较大，达8.3%～9.3%，已相当于adw和其他亚型的HBV基因组之间的差别。通过对18株HBV DNA序列进行比较，确定了将核苷酸序列差异≥8%为不同基因型的判断标准，将这 18 株 HBV DNA 序列分为 A（2 株 adw）、B（4 株 adw）、C（3 株 adw、4 株 adr和 1 株 ayr）、D（4株ayw）四种基因型，建立了HBV DNA基因型的分型方法。随后，一些学者相继应用该法对HBV进行基因分型。结果证实，根据HBV全基因组序列差异进行基因分型十分精确，是HBV基因分型的经典方法，也是其他基因分型方法参照的“金标准”。但测序所需的技术和实验条件高，费用大，无法在临床实验室开展。

（二）HBVS基因测序分型法

20世纪90年代初瑞典学者Norder等对HBV基因分型进行了系统的研究。他们以PCR扩增HBV S基因，并进行测序，建立了简洁的遗传树图。将S基因测序结果与全基因组测序比较，发现S基因序列的变化同全基因序列的变化一致，单用S基因分型是可靠的，从而简化HBV DNA的分型方法，并且提出了E和F两种新的基因型。1995年Ohba等也证实，基于S基因核苷酸序列遗传树基础上的HBV基因分型是合理而稳定的。我国范金水等也报道了HBV S基因（33～533位核苷酸）DNA PCR扩增产物直接测序法分析HBV基因型的结果。

虽然得到很大程度上的简化，利用S基因序列进行分型仍和HBV全基因组测序分型法一样，需要测定序列，较烦琐且费用较高，在临床实际应用上仍存在困难。

（三）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法

早在1988年Okamoto等就指出不同基因型的序列有独特的限制性酶切位点，因而有不同的酶切图谱，提出可用限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术进行基因分型。

1997年瑞典的另一研究室创立了基于扩增S基因的RFLP分析和遗传树图的分型新方法，分析了187例HBeAg阳性慢性携带者血清样本，结果与先前Norder等报道一致。1998年他们采用限制性内切酶Ava2和Dpn2消化pre-S区扩增片段的RFLP分析法，对HBV进行基因分型。该方法能够检测出所有已知的基因型A～F，可分析大量样本，适用于流行病学调查以及HBV基因型对感染病程潜在影响的研究。

泰国学者采用pre-S区PCR扩增产物RFLP技术对40名携带者、30名慢性肝炎、14名肝硬化、30名肝癌患者进行HBV基因型分析，结果表明PCR-RFLP分析法与测序法一样特异可靠，但廉价省时，对流行病学研究特别有用。

我国朱冰等采用HBV S基因2对引物和BamHⅠ、HpaⅡ、XhoⅠ和EcoRⅠ4种内切酶进行PCR-RFLP分析，建立HBV基因分型方法。

新近日本学者采用分子进化方法（molecular evolutionary method）对68株HBV全基因组序列和106株HBV S基因序列进行了分析，建立了简单的HBV基因分型方法。以S基因序列进行基因分型的结果与全基因组序列的遗传分析结果一致。对S基因序列进行校准后，以5种限制性内切酶HphⅠ、NciⅠ、AlwⅠ、EarⅠ和NlaⅣ消化和鉴定基因型特异性区域。用该法对源于不同国家的23个HBV分离株的S基因的PCR产物的鉴定结果，证实了这一RFLP基因分型法的正确性。只有基因型B缺少EarⅠ酶切位点，基因型C缺少AlwⅠ酶切位点。只有基因型E有NciⅠ酶切位点，基因型F有HphⅠ酶切位点。基因型A仅有NlaⅣ单个酶切位点，而基因型D被NlaⅣ酶解成265bp和186bp。

经过不断改进，HBV PCR-RFLP基因分析法技术简便、费用不高，精确度高，适用于具备分子生物学基本工作条件的临床实验室。

（四）酶联免疫吸附试验基因分型法

新近日本学者建立了酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）基因分型法。他们以针对HBsAg共同决定簇的抗体包被，捕获血清中的HBsAg。通过针对pre-S2区产物基因型特异性表位的酶标单克隆抗体进行基因分型。用该法对68份含有不同基因型的HBsAg的血清标本的分析结果，与S基因测序分型法完全一致。在含有HBsAg的514份日本人血清中，507份可被ELISA分型，可分型率为98.6%。其基因型分布为A型4.7%、B型38.1%、C型54.9%、D型0.4%、F型0.6%，无E型。来自巴西、中国、印度、印尼、肯尼亚、朝鲜、尼泊尔、巴布亚新几内亚、菲律宾和泰国的446份含有HBsAg的血清中有425份可被分型，分型率为95.3%，其中A型25.6%、B型24.2%、C型33.9%、D型11.7%，无E和F型。未能分型的血清，有些是不同基因型混合感染，有些是含有基因点突变而导致缺乏基因型特异性表位所致。ELISA基因分型法技术简便，适用于实验条件一般的实验室以及大量标本的检测。其缺点是无法对血清HBsAg阴性的HBV感染进行基因分型，以及有少数HBsAg无法分型。由于目前还没有其他实验室的应用报道，因此还有待于更大规模的进一步验证以及试剂的商品化。

三、乙型肝炎病毒基因分型的意义

HBV基因分型对研究HBV的起源和进化、流行病学、发病机制、诊断，以及疗效及预后判断等方面均有重要意义。

（一）探讨HBV的起源与进化

HBV是嗜肝DNA病毒科中的正嗜肝DNA病毒属的成员之一。已在许多种类的动物，包括土拨鼠、地松鼠和灵长类动物，发现该病毒。因此，嗜肝DNA病毒肯定经历了非常长的进化史，其组成成员可能比目前所认识的还要多。黑猩猩也可能有自己的嗜肝DNA病毒，即使是与HBV非常接近。日本学者新近对很可能是在非洲野外生活时感染的3只黑猩猩的HBV样序列进行了分析。其中2只黑猩猩（Ch256和Ch258）拥有的病毒基因组长度为3 182bp，在pre-S1区有33bp的缺失，无法归入人类HBV的A～F 6个基因型中的任何一型，但与先前报道的源于伦敦动物园黑猩猩的病毒分离株极为相似。Ch256和Ch258分离株序列在遗传树图上与至今所报道的长臂猿、猩猩（orangutans）和大猩猩的HBV样序列不同，因此代表黑猩猩自身的HBV，称为ChHBV。第3只黑猩猩的病毒（Ch195）基因组长度为3 212bp，属于HBV E基因型。由于大多数HBV-E存在于非洲人，Ch195可能来自于非洲人传染源。然而也可能是相反的情形，即在很久以前HBV-E就在非洲从黑猩猩传给人类。哺乳类嗜肝DNA病毒核心蛋白富含精氨酸的C末端高度保守。该区的分析结果表明，HBV-E/F和非人灵长类动物嗜肝DNA病毒的亲缘关系，比HBV-A/B/C/D与土拨鼠和地松鼠嗜肝DNA病毒的亲缘关系更为接近，支持HBV起源于非人灵长类动物的假说。

（二）了解HBV感染的分布特征

HBV基因型的分布在不同地区和人群有所不同，A型主要分布在北欧和非洲，B型和C型主要分布在东亚，D型主要分布在中东、北非和南欧，E型主要分布在非洲，F型主要分布在南非。

泰国学者对40名携带者、30名慢性肝炎、14名肝硬化、30名肝癌患者进行HBV基因型分析结果表明，C型为优势基因型，占68.6%，其中C1亚型占12.7%、C7占45.7%、C8占10.2%。B1占29.7%。

我国长春、大同、杭州、深圳、青岛、西安、昆明和拉萨8个城市43株HBsAg阳性和52株HBsAg阴性血清的基因型分析表明，虽然各城市间两类乙型肝炎的基因型存在一定差异，但总体上看，两类乙型肝炎的HBV主要型别构成基本一致，均以C型为主，分别为62.8%和61.5%；其次为D型，分别为14%和26.9%；B型分别为20.9%和9.6%；A型各1株。

广州、重庆、北京、沈阳四个城市的慢性无症状携带者及慢性乙型肝炎、肝硬化患者的HBV基因型以C型和B型为主。其中广州：B型32.8%、C型42.7%、BC混合型23.0%、其他1.6%；重庆：B型35.0%、C型40.0%、BC混合型25.0%；北京：B型25.0%、C型50.0%、BC混合型25.0%；沈阳：B型11.1%、C型88.9%。

法国和美国慢性HBV感染患者121份血清的分析揭示，基因型A为优势型别，占54%；基因型B、C、D、E、F分别各占3%、12%、19%、1%和0。另外有13株（占11%）不属于目前已知的A～F基因型中的任何一型，其基因组长度为3 248bp，称其为基因型G。通过推算HBsAg序列，推测该新发现的G基因型毒株属于血清型adw2。

（三）探讨HBV的传播途径及变异

王珊珊等以4名HBsAg、HBeAg均阳性的女性携带者及其子宫内感染HBV的4例胎儿为对象，研究母儿间病毒的基因分型与S区变异株。以双脱氧链末端终止法检测母儿所携HBV S区451～660位核苷酸序列。母儿HBV S区同源性为98%～100%，检出530、546、581位点变异致使126位、131位、143位氨基酸替代。2对母儿均为B型。在另外2对母儿，母亲为B型，胎儿为AB混合型。结果提示母儿间HBV基因型别基本一致，但HBV宫内传播可能发生S基因变异。

（四）HBV基因型与疾病类型关系的研究

HBV感染后的临床表现多种多样，非常复杂。如成人感染HBV后可产生不同疾病谱，从隐性感染、急性肝炎到慢性肝炎甚至异常严重的急性重型肝炎；即使接受同一HBV污染的受血者不一定产生同一类型的肝炎；干扰素（interferon，IFN）可用于慢性HBV感染的治疗，对很多患者有效，然而有些患者对IFN无反应。因此人们推测，除了机体的免疫应答存在个体差异以外，不同基因型的HBV可能具有不同毒力。目前已有一些关于HBV基因型与疾病类型关系的研究报道，也得出了一些初步结果。然而HBV基因型与肝病严重性和临床结局的关系的确定，尚有待于进一步的大规模追踪研究。

朱冰等发现广州地区肝硬化患者以C和B混合型为主，占50.0%，提示HBV DNA毒株的混合感染，有可能加重肝组织的损伤。

我国台湾地区学者对100名无症状携带者和170名经组织学证实的慢性肝炎和肝癌患者进行了HBV基因型分析，除了E型外，其他基因型均存在，B和C型为优势基因型。与无症状携带者比较，C型最常见于肝硬化及50岁以上的肝癌患者；B型更常见于50岁以下，特别是35岁的肝癌患者，其中大多数没有肝硬化。提示HBV C基因型与更为严重的肝病有关，B基因型则与台湾地区年轻人肝癌有关。

Lindh等研究了东亚43名HBV慢性携带者的病毒载量和肝损害与基因型和C启动子突变的相关性，发现基因型C携带者的肝脏炎症比基因型B更为严重，提示不同基因型之间可能存在致病性方面的差异。

综上所述，HBV基因分型方法学上已有比较重大的突破，建立了比较快速、简便的方法，如PCR-RFLP分析法，特别是ELISA基因分型法，如果试剂能商品化，并得到更多实验室的进一步验证，今后将能够在临床实验室大力推广应用。HBV基因分型方法为乙型肝炎的临床和分子流行病学研究提供了强有力的工具，十分有助于揭开HBV感染的临床表现及对治疗的反应复杂性的奥秘。