第二章 胆道闭锁动物模型制作及相关发病机制研究
关于人类胆道闭锁（BA）病因及发病机制仍尚未完全明了，目前主要围绕遗传学、环境因素（例如病毒、毒素等）、免疫和/或炎症反应异常、胚胎学因素（胆管发育异常）、局部血流障碍等因素展开研究。其中环境因素被认为是造成人类BA发病的重要原因，而遗传学则是人类BA病因学近期研究的热点。
目前相关发病机制及病因的假说有很多，各国研究者建立的与其研究相关的动物模型也有很多种，但目前尚无一种动物模型能够真正完整模拟人类BA的病变过程或病理改变结果。目前研究较多的BA动物模型包括胆管结扎或胆管内药物注射、基因敲除或敲低、病毒感染、毒素吸收等。各种模型的制作方法与优缺点总结如下。
1974年，Benjamin Landing首次提出人类BA与其他婴儿胆汁淤积疾病是由病毒感染引起。BA所表现出的季节和地区聚集趋势强烈提示其发病可能与某种病原体的暴发性感染相关。近年来，恒河猴轮状病毒（rhesus monkeys rotavirus，RRV）和巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）成为研究的热点，较多研究者选用这两种病毒来建立动物模型。
一、轮状病毒致新生鼠BA的模型
随着大量的临床研究的深入，国内外学者对于病毒感染致病假说的认可度越来越高。近年来，RRV感染动物建立BA动物模型的方法已成为一种较为广泛应用的建模方式。
假说认为围生期病毒感染宿主引发的炎症反应可能是人类BA的病因及发病机制。RRV能够靶向攻击小鼠胆管上皮细胞，通过一系列作用机制引发组织特异性炎症性损伤，最终借助这种炎症反应导致了肝外胆管的阻塞和闭锁。
RRV感染与人类BA病因及发病机制之间很可能存在一定的关系。在Kasai术中肝脏活检发现约50%BA患儿有RRV病毒感染，提示BA的发生与病毒感染可能有关。虽然相关机制尚不明确，但医学工作者可以从预防角度来考虑通过RRV疫苗接种从而降低BA的发生。
目前应用较为广泛的轮状病毒感染的方法主要有口服法和腹腔注射法，通过口服或者腹腔注射RRV的方法，使RRV感染出生24小时内的新生小鼠，从而建立动物模型。
Petersen等人通过向出生24小时内的新生鼠腹腔注射猕猴轮状病毒已成功诱导出新生鼠发生与人类BA相似的肝内外胆管进行性损伤。笔者所在科研团队也曾利用此方法于2003年成功复制出BA新生鼠模型。该方法的优点为操作相对简便、取材方便、重复性较好。目前该模型已被广泛应用于BA病因和发病机制的研究。
腹腔注射RRV感染出生24小时的新生鼠后，取不同时期的肝脏标本进行观察，发现小鼠肝内汇管区有大量炎症细胞浸润，淤胆明显，部分肝缘组织出现点灶样或大块坏死，肝脏未见严重纤维化。胆管的病理改变为，肝外胆管连续切片见胆管狭窄和闭锁，胆管壁增厚，胆管内皮细胞不规则增生，并伴有大量炎症细胞浸润。
口服RRV法小鼠出现的病理改变与腹腔注射法相似，但口服法发病率较后者低：口服法的试验小鼠发生肝胆病变率约为42%，而注射法约为80%。RRV口服法的优点在于更加接近人类RRV感染途径，但该方法诱导新生鼠产生与人类BA相似的肝内外胆管进行性损伤病理改变的发生率较腹腔注射法低，故该法被腹腔注射法取代。
然而大量研究发现RRV感染法所诱导的BA动物模型难以诱导出类似于人类BA严重肝纤维化、肝硬化等病理改变，并且部分BA小鼠有自愈倾向，目前为止，小鼠的死因不明，可能与病毒血症有关。
RRV诱导的动物模型病理改变类似人类BA的病变。然而所有BA患者肝脏活检尚未检测出某种特定的病毒感染，许多假说尚未证实，还需要进行进一步研究。
二、巨细胞病毒注射法
巨细胞病毒（CMV）可以感染胆管上皮细胞，并通过一系列炎症反应引起损伤，出现类似人类BA的肝脏病理改变。其优点为建立模型取材较为容易，操作较为简便。
Wen等人建立不同剂量CMV模型感染新生小鼠，将不同剂量的CMV通过腹腔注射法注射到出生24小时内的新生鼠体内，取不同时期的肝脏标本进行观察。
低剂量CMV注射后，小鼠肝脏内有广泛炎症反应，可见炎症细胞浸润，肝内胆管感染和损伤，但肝细胞和血管未出现损伤；高剂量CMV注射后，小鼠肝脏出现炎症细胞浸润和肝细胞脂肪变性，胆管上皮细胞受损，胆管腔内上皮增生，管腔变窄，出现胆汁淤积等病理改变，但是小鼠的胆管腔未出现完全闭锁。虽可见肝纤维化改变，但是肝脏未进展为肝硬化，不能诱导出类似人类BA的肝硬化改变。
有研究表明，使用CMV感染新生鼠，结果发现感染小鼠生长缓慢，肝胆系统有明显的急性与慢性炎症改变，表现为肝细胞变性坏死，并可见包涵体形成，在急性期有中性粒细胞浸润，在慢性期有淋巴细胞浸润，肝外胆管狭窄，但未见肝外胆管闭锁。这说明CMV可对鼠肝胆系统产生损伤，但这种损伤的原因不明，通过对不同感染时段鼠肝胆系统与细胞凋亡有关基因（FasL、bcl-2及bax）的表达进行研究，得出CMV感染可引起肝细胞凋亡相关基因表达异常可能是CMV致小鼠肝胆系统产生损伤的机制。
另有Fischler等人研究表明BA患儿母亲血液CMV抗体阳性率较对照组明显偏高，同时有约50%BA患儿肝组织CMV的DNA检测呈阳性，提示围生期CMV感染可能引起BA。
CMV感染法动物模型虽可以诱导出类似人类BA的肝脏及胆管病理改变，但肝脏病理改变不能进展为肝硬化，胆管病理改变，腔内上皮增生，管腔内径变窄，但并未出现完全闭锁。
目前许多关于CMV感染致BA的假说尚未证实，CMV感染与人类BA发病可能具有一定的相关性，但临床研究中，BA患者肝脏活检尚未检测出某种特定的病毒感染。因此CMV感染法建立BA动物模型研究尚有较多不足。
三、大鼠结扎胆总管法
大鼠胆管结扎是最传统的胆管阻塞模型。其优点为操作方法简便，取材方便。不同于利用病毒感染以及化学药物法间接引起肝脏及胆管病变，该方法直接结扎胆总管，引起胆道的阻塞。
建立模型方法为，通过手术结扎大鼠胆总管的方式，从解剖上模拟BA胆道阻塞。
此BA模型大鼠可出现胆汁淤积和胆管增生等病理改变。但结扎的胆总管易再通，小叶间胆管和胆道系统很快从阻塞性胆汁淤积中恢复过来而不引起进展性肝纤维化，并且继发于胆道梗阻的肝纤维化、肝硬化具有年龄相关性。结扎哺乳期大鼠胆总管模型可引起近端胆总管狭窄扩张，并很快死亡，死亡时大鼠肝脏无明显肝硬化和门脉高压等表现，故结扎哺乳期大鼠胆总管难以诱导出肝纤维化模型。结扎成年大鼠胆总管模型可在术后5~7天发生严重炎症反应，并在数周内进展为肝纤维化，胆管出现炎症纤维化表现，但通常不会发展为肝硬化。
该动物模型虽较好地模拟了BA患者的胆道阻塞，且胆管出现了炎症纤维化改变，肝脏进展为肝纤维化，但此动物模型不能进展为肝硬化，最重要的是，此BA动物模型的病因与发病机制与临床BA不符，不能应用于人类BA的病因研究中。
四、化学药物法：大鼠口服、胆囊注射、腹腔注射四氯化碳法
四氯化碳（CCl4）对肝脏的具有毒性作用，它是一种选择性肝脏毒性物质，进入大鼠体内能够引起肝细胞损伤和肝脏纤维化。在肝纤维化模型成功后，停止用CCl4诱导，大鼠肝纤维化也有类似的逆转恢复期，其逆转恢复的机制尚不清楚。
本模型的建立方法简便，取材容易，能够通过口服、胆囊注射、腹腔注射等方法将CCl4注入大鼠体内。
注入CCl4大鼠肝脏出现肝纤维化和肝硬化，该模型病理改变与人类BA的肝纤维化和肝硬化等病理改变十分相似。
此方法虽然操作简便，材料易得，能诱导出肝纤维化和肝硬化模型，但未出现BA，且此类化学药物中毒在人类中极其罕见，与人类BA病因及发病机制关系不大，无法提供人类BA的发病机制研究依据。
五、化学药物灌注法：大鼠无水乙醇消化道灌注法
肝脏是乙醇代谢的主要场所，乙醇进入机体后，产生中间代谢产物乙醛，能够与蛋白质结合为复合物，不仅能损伤肝细胞，且能成为抗原诱导机体发生免疫反应。乙醇在体内代谢过程能够引起肝脏小叶中央区域缺氧，从而损伤肝细胞，能够引起一系列炎症反应。
该模型建立方法为，通过胃管持续向大鼠灌注无水乙醇。此方法优点为操作较为简便，取材容易，模型稳定，可以控制大鼠乙醇摄入量。
消化道灌注无水乙醇后的大鼠肝脏细胞出现坏死，肝脏中可见炎症细胞浸润，肝脏组织胶原蛋白合成增多，中央静脉、肝窦周围可见胶原纤维大量沉积。后可进展为肝纤维化表现。
但这一模型形成肝脏纤维化所需时间较长，并且不能进展为肝硬化。对于新生儿来说接触该化学药物机会不大，该模型与研究人类BA发病机制和疾病易感性等关系不大。
六、化学药物注射法：大鼠福尔马林注射法
有文献报道福尔马林可以严重损伤肝内外胆管上皮细胞，引发一系列炎症反应，引起成纤维细胞增生。建立模型方法，向大鼠胆道中逆行注射福尔马林溶液。
但动物实验表明虽可见增生胆管，但门管区周围肝脏细胞形态正常，肝细胞间紧密连接正常。该模型未能引起肝脏细胞的损伤，与人类BA病理改变表现不符。在动物体内实验中未见其与人类BA易感性和类似病理改变。
该模型可能用于研究福尔马林对胆管上皮细胞作用机制。但与人类BA病因及发病机制的研究关系不大。
七、天然动物模型：七鳃鳗动物模型
这是一个基于七鳃鳗特殊的发育过程，而获得的一种自发性的动物模型。七鳃鳗从幼年到成熟阶段经历变态发育的过程中，原始肝内外胆管消失，胆囊消失。
在蜕变起始阶段，天狼星红胶原染色可观察到肝内大量淋巴细胞浸润，胆管细胞增殖和基底膜增厚；在其发展过程中，肝细胞之间的小胆管扩张并出现类似胆汁淤积的特征，胆管周围可见纤维化，激活的巨噬细胞吞噬纤维和坏死细胞碎片，继续发展可见巨噬细胞减少和纤维化程度降低，但仍有大量淋巴细胞浸润；蜕变后期，整个胆道系统消失。
在七鳃鳗胆道消失过程中，肝脏门管区周围淋巴细胞浸润和进行性的肝脏桥接纤维化、胆汁淤积等表现符合人类BA的病理改变，但七鳃鳗能够在胆道系统退化后通过特有的适应和代偿机制来应对胆汁淤积，使之并不会进展为肝硬化。
该模型的优点为，属于自发性动物模型，研究者无需向动物体内注射化学品或者病毒等手段就可以获得BA动物模型。缺点是，七鳃鳗的发育时间较长（幼年经3~4年发育完全），这样不便于繁殖和观察七鳃鳗整个生长发育过程，且七鳃鳗资源相对小鼠等动物较为稀缺，生活习性特殊，养殖有难度。该动物模型的研究具有一定的限制性。
该动物模型虽有一定的限制性，但仍具有可研究性。研究发现七鳃鳗的胆道系统退化之后，肝脏出现纤维化病变却并未进展为肝硬化，反而通过其特有的代偿机制适应了胆道退化。因此研究者希望通过建立七鳃鳗动物模型来对七鳃鳗的胆道系统消失，发生类似人类BA的变态发育过程中，可能存在的与人类BA病因及发病机制相关的炎症反应的信号因子等进行探究。希望能够找到相对应的信号通路来解释其胆道系统退化之后的机体适应过程，甚至有望将其应用到人类BA疾病的靶向治疗等方面。
八、gpc1基因敲低斑马鱼模型
斑马鱼幼年胆管系统发育过程及功能与哺乳类动物有很多相似之处。该模型的优点为，能够大量繁殖，且生长周期较短，在受精后第5天起即可开始观察其胆管系统发育情况，这一特点大大缩短了研究周期，幼年斑马鱼通体透明，在镜下易观察胆管发育情况，不同于小鼠等动物模型需要杀死动物来获取病理标本，该模型能够通过免疫染色等方式来动态观察斑马鱼胆管发育过程。
研究者可以通过使之接触化学毒素或者行斑马鱼基因敲除等处理方式，观察该因素对斑马鱼胆管系统发育的造成的影响，从而进一步研究其与人类BA病因及发病机制的关系。
Cui等人对北美30例BA患儿的全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）研究显示确认了gpc1基因可能为BA发病的风险基因。斑马鱼和人类体内分别有6个相同的主要针对顶端表面上皮细胞的gpcs基因。
gpc1基因与BA发病易感性相关。该模型的建立有利于研究敲除该基因的斑马鱼胆管系统及胆囊发育过程。
研究者采用吗啡啉修饰的反义寡聚核苷酸（morpholino antisense oligonucleotide-mediated，MO）技术，对幼年斑马鱼进行gpc1基因敲除，获得斑马鱼的基因敲除模型，进行繁殖后，获得幼虫，在其发育过程中通过免疫染色观察其胆道发育情况。
在gpc1-MO的斑马鱼模型中对细胞角蛋白18（CK18）行免疫染色后观察到，该动物模型胆管细胞数量明显减少，与此同时，检测到胆囊内胆汁分泌量也减少。CK18是一种主要存在于肝脏前体细胞及祖细胞的蛋白质，监测其数量的多少能够客观反映出肝脏系统的发育情况。从Cui的研究结果可以看出，在对gpc1基因进行人为敲除后，观察受精后第5天的斑马鱼，发现其胆管及胆囊发育开始出现异常，但未出现BA，因此可以推断gpc1基因对BA的病因可能具有一定的关联性。
虽然gpc1基因对BA的病因可能具有一定的关联性，但是该模型仅仅构建出了斑马鱼胆管及胆囊发育异常模型，该模型并未出现BA的病理改变。由于BA的病因和发病机制较为复杂，该模型单从易感性基因的角度来研究有关BA的病因和发病机制，可能无法很好地阐明其中的关系。
有关于gpc1基因可能为人类BA发病的风险基因的学说尚不够完善，相关机制研究尚不清楚。该动物模型还不能很好地满足研究者对于BA的病因和发病机制的研究。
九、add3基因敲低斑马鱼模型
add3基因编码的蛋白质位于肝内外胆管中，在人类BA的肝脏中发现add3基因表达较正常肝脏的表达明显增加，推测其原因，可能是BA患者的胆管在肝脏中存在一定的增生。
Miao XP等人通过GWAS研究发现add3可能为BA的易感基因。Tang等人采用MO技术，对斑马鱼进行add3基因敲低，获得的斑马鱼模型，称为sa819。将该模型进行繁殖后，获得幼年斑马鱼，在其受精后第5天开始通过免疫染色观察其胆道系统发育情况。
通过免疫染色观察到，受精后5天的斑马鱼开始出现胆管功能减退和胆管发育异常，肝内胆管稀少、短小，但并未出现BA的病理改变。
add3基因敲低斑马鱼模型虽然成功构建出了斑马鱼胆管发育异常模型，但该模型并未出现BA。有关于add3基因为BA发病的风险基因的学说尚不够完善，相关机制的研究尚不清楚，该动物模型还不能很好地满足研究者对于人类BA的病因和发病机制的研究。
由于BA的病因和发病机制较为复杂，该模型单从易感性基因的角度来研究有关BA的病因和发病机制，可能无法很好地阐明其中的关系。
十、inv基因敲除小鼠模型
研究表明inv基因能够调控肝胆系统发育。Otto和Low等人通过研究发现inv基因于胚胎发育早期在肝脏、肾脏和胰腺中可表达一种串联锚蛋白，对上皮组织发育构型起调控作用，在肝脏中异常表达能够影响原始胆管板重建，造成胆管板畸形，最终引起肝内胆管发育异常。
通过碱基插入突变方法获得inv小鼠模型，能够造成突变小鼠内脏全反位畸形，同时合并胰腺囊肿或肾脏囊性变，小鼠的胆总管或肝管闭锁。
虽然inv基因敲除小鼠模型能够诱导出小鼠胆总管或肝管闭锁，与BA病理改变相似，然而人类的inv基因突变结果仅出现内脏转位等，而不会发展为BA，并且研究者在BA的脾脏畸形综合征的新生儿中也没有发现存在inv基因突变。
有关于inv基因为BA发病的风险基因的学说尚不够完善，相关机制的研究尚不清楚，该动物模型还不能很好地满足研究者对于人类BA的病因和发病机制的研究。
十一、Biliatresone模型
Zhao X等人从某个澳大利亚牧场的草中提取出了一种与BA相关的毒素，将其命名为“biliatresone”，这种毒素对于肝外胆管具有选择性毒性。
获得该毒素后，研究者建立了一种模型，在受精后5天的斑马鱼喂养液中加入该毒素，同时观察斑马鱼的胆道发育情况。
通过观察发现，低剂量的biliatresone仅引起幼年斑马鱼胆囊发育出现轻微的缺陷；高剂量可引起肝外胆管和胆囊的形态缺陷。而肝内胆管几乎不受影响。说明了该毒素对肝外胆管的特异性。
Biliatresone能够引起动物发生类似于人类BA的病理改变，摄入该毒素的动物出现肝外胆道损伤，十分类似于BA的病理改变，研究提示，食物以及环境中某些因素可能与人BA的易感性有关。关于这种毒素与BA的发病机制之间还需要进一步研究。但目前该毒素不易获得，不能广泛应用，现有关于它的研究十分有限，广泛对其开展研究尚存在难度。
BA动物模型一直是近年来研究BA的热点和难点，胆管结扎或胆管内药物注射与人类BA的发病原因不符，而基因敲除鼠所得到的模型其肝脏病理改变又与人类BA不完全一致，毒素吸收仅限于特定地区动物发病，而病毒感染又难以获得肝纤维化结果。目前的BA模型虽可部分模拟人类BA的病理变化，但对BA的病因和发病机制的研究却极其有限。
（冯杰雄 杨继鑫）
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