第五章 胆道闭锁发病的遗传学特点
胆道闭锁（biliary atresia，BA）是小儿胆汁淤积最常见的原因。全世界范围内新生儿发病率约为1/8 000~15 000，但各地区差异很大，亚洲人群高发，明显高于欧美地区报道的发病率。目前已报道的发病率最高的是波利尼西亚人，高达33.5/100 000活婴。这些研究表明胆道闭锁存在明显的种族差异，其发生与遗传背景相关。
一、胆道闭锁与遗传
胆道闭锁是小儿外科比较常见的胆道梗阻性疾病，其病因和发病机制尚不明确。胆道闭锁病例多为散发，虽有在同一家庭发生的报道，包括一例母亲胆道闭锁遗传给孩子的报道，但较少发生家族聚集现象，这与胆道闭锁双胎研究（特别是同卵双胞胎）的结果一致，揭示胆道闭锁并不符合严格的孟德尔遗传定律。然而，各地区之间的稳定发病率及种族差异，又提示该病存在一个明显的遗传倾向，且已有研究证实偏侧性缺陷和胆道闭锁动物模型与基因异常相关。
胆道闭锁临床上可分为两大类型：胚胎型（先天因素）和围生期型（获得因素）。只有约20%患儿出生时即有肝胆系统形态学异常，他们往往在出生前就可以检测到胆道系统的异常变化，如Hinds等对194例BA患儿产前超声的研究发现其中9例曾诊断为胆道囊性畸形（4.6%）。这些出生时即有肝胆系统形态学异常患儿又常伴有多脾或无脾、心血管缺损、内脏转位、肠旋转不良、门静脉和肝动脉先天异常等多发畸形。现认为这些先天异常是胚胎期形成的，因此认为此类胎儿型胆道闭锁可能与染色体异常、胆管发育调控基因和或决定内脏位置的基因突变有关。
约80%的胆道闭锁患儿为围生期型，出生时胆道系统未见形态学异常，而于生后在某些特定环境因素的刺激下肝内外胆管发生进行性炎性病变和纤维化，尽管可以通过肝肠吻合术重建胆汁排泄途径，但肝内胆管炎症及纤维化仍在进展，大部分患儿最终导致胆汁淤积性肝硬化，50%以上的胆道闭锁患儿最终需要肝移植。现认为这类围生期的胆道闭锁可能与某些炎症、免疫等调控基因的异常表达有关，这类患儿可能存在某些遗传易感因素。
二、胆道闭锁的细胞遗传学
Leyva-Vega等通过对35例胆道闭锁患者55万个基因组DNA缺失或重复的SNP位点拷贝数变异（genomic copy number variation，CNV）的研究发现2个无关男性患者的2号染色体长臂3区7带3亚带（2q37.3）有一个1.76Mb杂合缺失，而在2 026个对照者中未见。推测这些患者共有的1.76-Mb缺失（含包括AGXT在内的30个基因）可能存在着一个发育成胆道闭锁的易感因子。
英国Allotey等报道5例有明显先天性胆管异常（4例胆道闭锁）婴儿伴有22号染色体不同形式的异常，2例有典型的猫眼综合征（cat-eye syndrome），2例有22号染色体部分重复，1例是22-三体的嵌合体。故认为可能有潜在的遗传因素对BA发病有影响。
机体内含有少量其他个体来源的细胞或DNA成分称为微嵌合体（Microchimerism），胎源性细胞或DNA成分在母体妊娠过后仍长期存在于母体血循环中，呈现微嵌合体现象。目前认为这些微嵌合体可能导致某些疾病的发生。有学者在BA中检测到母体微嵌合状态（Maternal Microchimerism）的存在，提示由此导致的免疫反应可能参与BA的发生。另外的一项研究则发现在BA的肝细胞中，存在着大量的母体嵌合的CD8+T淋巴细胞，进一步提示母体的免疫损伤可能在BA的发病中起重要作用。最近的一项研究表明，尽管在BA患儿的外周血中发现了母源性细胞，但在淋巴结中未发现微嵌合体的存在，该结果对这一假说提出了挑战。
三、胆道闭锁的遗传易感基因
尽管胆道闭锁不属于孟德尔遗传病，但通常认为胆道闭锁患儿可能存在某些易感基因，现将近年研究较多的与胚胎结构发育相关的易感基因和与感染免疫相关的易感基因介绍如下。
胚胎的原始器官（胚基）在迁移、变形及合并等形成正常内脏器官的发育过程中如有任何一个步骤被干扰，胎儿的内脏器官则会出现不同程度和不同表现的异常。大约10%的BA患儿伴发其他先天畸形，多属于左-右轴（left-right axis）畸形。动物模型已经显示左-右轴的畸形会影响胆道的发育。研究发现编码CRYPTIC蛋白的CFC1基因在建立左-右轴方面起着重要作用，因此与一些内脏异位有关。Bamford等通过研究内脏异位患者CFC1基因，发现CFCl基因的功能性突变与人类左右偏离缺陷有关。Davit-Spraul等也从10例胆道闭锁伴脾畸形患者中发现5例CFC1基因第5外显子Ala145Thr（c.433G>A）杂合错义突变，其发生频率是对照组的两倍。胆道闭锁脾畸形综合征（Biliary atresia splenic malformation syndrom，BASM）的患者出现一些类似于纤毛疾病的表型，纤毛疾病是一组由编码纤毛蛋白的基因异常导致的遗传异质性疾病。纤毛蛋白有助于脊椎动物左-右轴的建立，并在多种细胞中表达，包括在胆管细胞表面，纤毛有助于胆汁的流动及胆管的形成。此外，有研究通过恒河猴轮状病毒诱导小鼠胆道闭锁模型，发现肝外胆管细胞中的初级纤毛大量丢失，证实了BA患儿肝外胆管的病理表现。胆管细胞纤毛功能或发育异常是否是胆道闭锁的基础仍然需要进一步的遗传学及免疫学分析。
近年来发现了一些与传统遗传方式不同的疾病，如Bardet-Biedl综合征，一种存在临床异质性的纤毛疾病，以寡基因方式遗传，突变存在多个基因上并相互作用而产生临床表型。胆道闭锁的多种表型可能和基因与基因的相互作用或异位显性相关。非孟德尔遗传同样可见于Alagille综合征，由JAG1或其受体基因NOTCH2单倍体不足造成。
有研究表明后天发病的胆道闭锁患儿可能存在某种遗传缺陷，导致机体对未知病原体的易感性增强，外来物质诱导刺激免疫细胞而激活先天性免疫系统，该系统与获得性免疫系统共同作用导致胆道闭锁的发生和进展。
HLA分子是免疫系统的重要组成部分，有人认为它也是参与胆道闭锁免疫反应的重要成分。但Donaldson等研究101例胆道闭锁患儿和134例健康对照的HLA A、HLA B、DRB1、DQA1、DQB1、DPB1和白细胞介素-1基因家族、白细胞介素10基因启动子序列、肿瘤坏死因子α启动子等基因多态性，结果显示两组间各基因型的比较没有任何统计学差异，他们认为胆道闭锁与HLA不相关，白细胞介素-1、白细胞介素10基因、肿瘤坏死因子等炎性因子基因多态性不是该病的危险因素。Lee等经检测53例患胆道闭锁的中国台湾儿童和904例健康对照白介素4基因（interleukin 4，IL-4）的-590 C/T、-33 C/T、和8375 A/G多态性位点，比较IL-4基因变异体的基因型、等位基因、携带者和单倍体频率，其结果显示IL-4基因多态性与胆道闭锁无关。Lee等还曾对50例中国台湾地区BA患儿和1 117例健康个体的白介素-18基因（interleukin-18，IL-18）的-1297 T/C，-607 C/A，-137 G/C和+105 A/C多态性位点进行研究，结果显示二组间的IL-18基因型、等位基因频率、携带者和单倍体频率等均无统计学显著差异。数据提示IL-18不是中国台湾地区BA儿童的主要遗传因素。另外，Lee等还研究50例胆道闭锁患儿和788健康个体的γ干扰素（interferon gamma，IFN-γ）IFNG基因-1615 C/T，-183 G/T，+874 A/T和+2197 A/G多态性位点，结果显示两组这些位点的不同基因型和等位基因频率无显著差异。
Shih等为了观察内毒素受体基因CD14和肿瘤坏死因子基因TNF-alpha启动子区单核苷酸多态性与胆道闭锁、自发性新生儿期胆汁淤积的相关性，研究了90例胆道闭锁和28例自发性新生儿期胆汁淤积患者，以及42例成人乙型病毒肝炎相关肝硬化和143例健康儿童作为对照。结果发现胆道闭锁患者组和自发性新生儿期胆汁淤积患者组CD14-159启动子多态性位点T等位基因频率（61.7%，67.9%）和T/T基因型频率（42.2%，53.6）明显增高，而TNF-alpha-308启动子多态性与BA患者无关。提示CD14-159单核苷酸多态性可能是胆道闭锁和自发性新生儿期胆汁淤积的易感因素。Chou等研究显示早期胆道闭锁患者肝脏CD14 mRNA的表达和血浆可溶性CD14浓度显著高于晚期胆道闭锁患者，然而血浆内毒素水平无论在早期胆道闭锁还是晚期胆道闭锁患者都显著高于正常对照组。提示可能在胆道闭锁形成早期内毒素刺激肝细胞生成CD14以便清除内毒素，然而在胆道闭锁晚期内毒素信号可能诱导肝损伤破坏可溶性CD14的合成。
细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）对各种炎性反应进程都十分重要，它损伤炎症应答。人类ICAM基因是位于19号染色体上的单拷贝基因，含有两个多态性位点，即位于第4外显子的G241R和位于第6外显子的K469E。Vejchapipat等研究发现ICAM-1基因型K469E及其等位基因在83例胆道闭锁患儿组和115例正常对照组人群没有明显的差异。Arikan等对19例平均年龄1岁的BA患者、38例慢性肝病（chronic liver disease，CLD）和123例健康对照的ICAM基因型研究发现，BA患者组ICAM基因G242R的A等位基因频率明显高于CLD组和健康对照组。单变量分析显示ICAM基因G241R多态性位点与BA显著相关，提示ICAM-1的241R多态性位点与胆道闭锁有明显的相关性。
巨噬细胞游走抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）是多效淋巴细胞和巨噬细胞的细胞因子，MIF在一些炎性疾病中表达增强，可能在先天免疫中起重要作用。Arikan等研究18例平均年龄1岁诊断为BA的患者、36例慢性肝病患者和103例健康对照的MIF基因173G/C多态性对BA易感性的作用，结果发现BA患者组MIF-173C等位基因频率显著高于其他二组。单变量分析显示MIF-173G/C基因型与BA显著相关（GC genotype，OR=6，95%CI 2.8~11.5，P=0.000），提示MIF基因的-173C等位基因可能与BA的易感性有关。
随着基因芯片技术及生物信息学的发展为研究分子与分子间复杂的相互作用提供了新手段。赵瑞等利用约含48 000个人类基因的表达谱芯片对9例胆道闭锁和2例3个月内发病的胆总管囊肿患儿的肝活检标本进行基因表达谱的研究，经显著性基因表达趋势及信号通路分析显示在胆道闭锁的发病过程中大量促炎症的细胞因子表达，涉及的显著性通路主要为细胞凋亡调控、细胞基质代谢以及细胞黏附、花生四烯酸类物质的合成。推测持续的炎症反应导致肝脏淤胆、损伤以及细胞基质的重建，最终引起肝脏硬化。同时发现胆道闭锁中肿瘤亮氨酸拉链下调基因（leucine zipper down-regulated in cancer，LDOC1）的表达较胆总管囊肿明显增高（P=0.021），提示LDOC1基因在胆道闭锁形成过程中可能起关键调控作用。LDOC1基因位于Xq27，含一个类亮氨酸拉链的基序和一个富含脯氨酸区，被认为是一个肿瘤抑制基因，其编码的蛋白在正常组织及肿瘤细胞系都广泛表达，与早期细胞凋亡有关。推测LDOCI基因可能通过核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-kappa B）信号通路参与调节转录子的应答，以调控胆道上皮的凋亡和损伤。
胆道闭锁是以肝内/肝外胆管进行性炎症和纤维性梗阻为特征，从而导致胆汁淤积以及进行性肝纤维化和肝硬化，不明原因的胆汁性肝硬化也是导致新生儿胆管切开术和儿童肝移植最常见的原因。Huang等通过研究胆道闭锁患者肝组织样本DLK基因（Delta-like homologue），发现DLK1基因在胆道闭锁的早期表达增强，而在疾病的后期表达减低。DLK1蛋白主要分布在活化的肝星状细胞中，而肝星状细胞是参与肝纤维化的重要细胞。推测DLK1蛋白可能会促进肝星状细胞转化为成肌纤维细胞，引起肝纤维化。
香港大学Garcia-Barcelo等为200个中国胆道闭锁患者和481个种族配对对照个体，用全基因组关联分析的方法（genome-wide association study，GWAS）在近50万个单核苷酸多态性（SNP）中查找胆道闭锁易感基因。结果发现有10个SNP位点与胆道闭锁相关。然后针对这10个位点基因型，以另124例胆道闭锁患者和90例正常对照为验证对象进行分析，发现其中最高度相关的是位于10q24.2上的一个与炎性介质代谢有关的可溶性X-脯氨酰氨肽酶P1基因[X-prolyl aminopeptidase（aminopeptidase P）1，XPNPEP1]下游和内收蛋白3基因（adducin 3，ADD3）间的SNP rs17095355位点。该位点为C/T转换，产生2个或断裂为3个转录因子结合位点（transcription factor binding site，TFBS），T为与胆道闭锁关联的等位基因。该研究显示胆道闭锁的发生可能受包括XPNPEP1和ADD3基因在内的129kb区域内DNA变异的影响，而与之最相关的SNP rs17095355就坐落在该基因间区域。XPNPEP1遗传缺陷可能会导致胆道闭锁炎症反应控制的失调。内收蛋白3在肝细胞内和胆管上皮细胞内表达，与组装细胞-细胞之间血影蛋白-肌动蛋白-膜蛋白的网络结构有关。有缺陷的ADD3可能会导致肌动蛋白和肌球蛋白过度沉积，促进胆管纤维化。对一汉族人群BA患儿的深度测序研究发现5个SNP位点与胆道闭锁相关，其基因型与ADD3蛋白表达量下降有关。一个在高加索人群中的GWAS研究表明，在ADD3的第一内含子区域存在SNP位点与胆道闭锁相关，尽管其基因型与ADD3蛋白表达无关。
在一个独立的BA队列研究中，通过DNA拷贝数全基因组关联分析发现了另一个潜在胆道闭锁易感区域，位于染色体2q37.3。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1）是该区域的唯一基因。尽管之前没有GPC1与肝发育或功能相关的报道，但磷脂酰肌醇家族成员参与了肝细胞和胆管细胞的多种信号及发育通路。作者在BA患者的胆管细胞中检测到GPC1表达变异，同时通过斑马鱼模型证实基因敲除GPC1可导致胆管异常。
个体的遗传差异可以极大地影响疾病的严重程度，尽管胆道闭锁存在表型基因异质性，到目前为止尚未发现能够预测HPE术后转归的基因。一些研究者认为与胆道功能相关的基因如A1AT、JAG1及CFTR可能与基因修饰相关。
在过去的10~15年里，已经积累了大量的证据，表明肝脏有很强的处理胆汁负荷的能力，从细胞膜到细胞质通过改变核转录来处理胆汁，特别是通过核受体家族成员，如胆汁酸受体基因。然而这一能力在胆汁淤积性肝脏疾病的患者身上如胆道闭锁，显得不足，提示可能存在补偿机制失常，与非生理性压力有关。
四、胆道闭锁相关基因的DNA甲基化问题
DNA甲基化是DNA最常见化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传的现象。目前认为其可能参与调控多种生物学过程，包括基因转录、X染色体的活化、基因印记和染色体的修饰。DNA甲基化改变可由药物、毒素和遗传缺陷诱导。Matthews等的实验研究证明由遗传或药物抑制斑马鱼幼虫DNA甲基化可造成其肝内胆汁输送障碍和γ干扰素-应答基因（IFNγ-responsive genes）活化，使之形成胆道闭锁（BA）特性。糖皮质激素治疗可使由DNA甲基化抑制产生的胆汁缺乏（biliary defects）现象逆转。与其他婴儿期胆汁淤积疾病比较BA患者胆管细胞DNA甲基化明显减少，故提出BA可能的新机制，提示DNA甲基化的抑制、IFN-γ信号通路的激活及BA之间可能存在一定的因果联系。同时发现，在人类BA患者的肝组织中DNA甲基化水平较正常肝组织低，进一步支持DNA低甲基化可能与BA发病有关。董瑞等研究发现BA患儿CD+T细胞的淋巴细胞功能相关抗原基因（lymphocyte function-associated antigen 1，ITGAL）启动子区存在高甲基化状态，并对mRNA表达产生影响。提出CD+T细胞ITGAL基因启动子区的高甲基化可能是宿主对病毒易感性增加的主要因素。最近，Zenobia C. Cofer应用甲基化微阵列芯片的方法发现了一些新的基因的甲基化改变与BA相关，如ARHGEF10、ADAP1、RAP1GAP、ZEB2、PRICKLE4和PDGFA等。其中甲基化变化最大的区域靠近PDGFA基因，编码血小板衍化生长因子（PDGF）。PDGF在肌成纤维细胞活化和纤维生成过程中起重要作用，PDGFA基因甲基化的减少可能通过多种机制导致BA的发生。
综上所述，胆道闭锁发病机制至今未明。肝胆管先天发育异常患儿多与细胞遗传学有关，后天发病的患儿可能自身存在某些遗传易感基因，在胆道系统发育的关键时期遭遇外来因素打击（病毒、毒素等环境因素）时，机体免疫系统被异常激活，免疫功能的失调促进疾病进行性恶化。总之，胆道闭锁可能是遗传与环境因素相互作用的结果，患者免疫遗传易感性可能是进行性炎症和硬化过程的关键。
（舒剑波）
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