第三章　胆道闭锁相关胚胎发育过程

第一节　肝脏胚胎发育过程

肝脏是人体内最大的实质器官，也是体内最大的消化腺。肝脏的功能极为复杂，它不仅参与蛋白、脂类、糖类和维生素等物质的合成、转化与分解，而且还参与激素、药物等物质的转化和解毒。除此之外，肝脏还具有分泌胆汁、吞噬、防御以及在胚胎期造血等重要功能。

一、肝脏的细胞结构

肝小叶是肝脏的基本结构单位，包括肝细胞（约占80%）、胆管上皮细胞、星形细胞、内皮细胞、Kupffer细胞、陷窝细胞及贮脂细胞。在肝小叶中央有一纵行中央静脉。肝细胞以中央静脉为中心，向四周略呈放射状排列，形成肝细胞索（板）。肝细胞索之间是肝血窦。肝血窦腔内有Kupffer细胞，具有吞噬功能。相邻两肝细胞之间有胆小管。肝内胆管、门静脉、肝动脉被称为“portal triad”，即门脉三连管结构。门静脉、肝动脉来源的血液进入窦状隙，并与具有吸收代谢产物及毒素的肝细胞基底面直接接触，最后回流至中心静脉。胆汁从邻近的肝细胞顶端表面分泌至胆小管，从肝内胆管流至肝外胆管（图3-1）。

二、肝脏胚胎发育过程

肝细胞和胆管上皮细胞在胚胎发育过程中是由内胚层分化而来，而肝脏内的间质细胞（包括星形细胞、Kuppfer细胞、内皮细胞等）由中胚层分化而来（图3-2）。

在人胚第3周开始，胚盘向腹侧卷折，形成圆柱状胚体，内胚层被卷入胚体内，形成一条头尾走向的封闭管道，称原始消化管。从头端至尾端，原始消化管依次分为3段，分别称为前肠、中肠和后肠。第4周初，前肠末端腹侧壁内胚层上皮增生，形成一囊状突起，称肝憩室。肝憩室的形成是肝脏胚胎最早的形态标志。随后肝憩室增厚，由单层立方内胚层细胞转化成多层假复层细胞即肝母细胞，后者逐渐分层、增殖，生长入周围的原始横膈形成肝芽（图3-3）。在胚胎的第8周，肝母细胞逐渐增殖、分化形成肝细胞及胆管细胞。

肝脏内胚细胞（即肝母细胞）从上皮组织分层，并侵入毗邻的横膈间质并形成肝芽。横膈间质发育为肝成纤维细胞和星形细胞。随着造血干细胞的血管化并繁殖，其成为胎儿主要的造血器官。在小鼠胚胎期E10及人胚胎第5周，伴随着肝芽形成，肝母细胞和造血母细胞共同发育。肝母细胞的增殖也受到造血细胞的影响。

肝母细胞具有双向分化潜能，位于门静脉附近的成为胆管上皮细胞，而大部分实质中的肝母细胞分化为肝细胞。门静脉周围的肝母细胞先形成单层，然后变成双层，一种立方形的胆道前体。随后在双层中出现局部扩张，被门脉间充质包绕形成肝内胆管，而剩余的双层细胞回归（图3-4）。这个包含管道生成及凋亡的过程被称为胆管板重塑。不与门静脉相接触的肝实质内的肝母细胞逐渐分化成为成熟肝细胞。功能性肝细胞的成熟以及连接肝外胆道的胆管网形成是渐进的。这一过程一直持续到出生后，以形成独特的肝脏组织结构。

三、肝脏发育过程中的信号调节

肝脏发育过程需要多种信号传导通路的调节，其主要包括：转化生长因子（TGF-β）、Wnt、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、Notch信号、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。

（一）内胚层的发育

内胚层特化阶段主要的信号传导通路是Nodal信号通路，其为胚胎形成的重要调节因子。Nodal信号是TGF-β家族的成员，其通过Type1、Type激活素配体和共同受体促进中内胚层的形成，继而中内胚层分离形成中胚层和内胚层。在所有的脊椎动物中，Nodal信号对于形成内胚层是必需的。Nodal信号的高表达能够促进内胚层发育，Nodal信号的低表达则促进中胚层发育。中内胚层的分离受中胚层与内胚层基因表达相互拮抗作用的调节。中胚层表达的FGF和BMP信号能够拮抗Nodal信号。BMP与Nodal之间的相互拮抗也调控前肠内胚层的形成。

在原肠形成过程中，Wnt、FGF及BMP信号可抑制前肠的发育，相反能够促进后肠的发育。中胚层表达的Wnt信号（包括Wnt5a/5b/8/11）能够增强核内β-catenin的活性，促进内胚层后部基因表达，并抑制内胚层前部的基因表达。相反，Wnt的拮抗剂分泌性卷曲相关蛋白（SFKP1、SFKP2、SFKP3、SFKP5）能够降低β-catenin的活性来维持前肠的发育。

Wnt和FGF信号都需要BMP来激活后肠部位基因的表达，而且在前肠区域BMP的表达必须被阻断。和Wnt一样，BMP必须在适当的水平才能促进前肠发育，并非是不表达。FGF信号则维持细胞对Wnt、BMP信号的反应能力。

（二）肝脏的特化

伴随着前肠内胚层的形成，肝脏的起源需要其邻近中胚层表达FGF、Wnt和BMP信号来诱导肝脏特化。对斑马鱼的研究发现，FGF信号对肝脏特化非常重要。通过Fgfr1显性抑制形式的过度表达来阻断FGF信号，将导致肝母细胞标志物Hhex（造血表达同源异形盒）和Prox1的表达大幅下调或缺失。通过对小鼠整个胚胎的培养发现，FGF信号减低会损害肝脏前部基因的表达和形态发生过程，但对肝脏后芽发育影响较小，这表明肝脏发育在前-后轴向上对FGF信号的需求是有区别的。小鼠组织培养表明前肠内胚层形成肝母细胞和肺祖细胞需要不同的FGF阈值。低浓度的FGF2能够诱导Alb（白蛋白）表达，而高浓度则诱导肺祖细胞标志物NKX2.1的表达。

横膈间质和中胚层侧部表达的BMP信号同样具有肝脏诱导能力。对斑马鱼的谱系追踪可以发现肝-胰祖细胞BMP2能够下调Pdx1（pancreatic and homeoboxl，编码胰腺发育的转录因子）的表达。BMP2b信号抑制Pdx1表达，能够促进Pdx1阴性的内胚层细胞转化成肝母细胞。BMP信号与Wnt、FGF信号之间的相互作用尚不清楚。

Wnt/β-catenin信号对肝脏特化具有正性调节作用。在斑马鱼的研究中发现，中胚层前侧部表达的Wnt2bb是肝母细胞基因表达的必要信号。Wnt2bb及Wnt2信号的缺失会导致肝脏发育不全或缺失。持续活化的β-catenin信号可将胰腺祖细胞转化为肝母细胞，最终形成异位肝脏。研究发现，Wnt/β-catenin还可将小肠祖细胞转变成肝母细胞；但在小鼠研究中并未得到明确的作用，故Wnt信号对肝脏发育的影响仍有待进一步研究。

（三）肝母细胞的扩增和分化

肝母细胞的增殖受到邻近原始横膈中内皮细胞及间质细胞的调节，Wnt属于重要的正性调节信号。在小鼠E15，持续活化的β-catenin促进肝脏扩大，如果β-catenin受到抑制则会降低肝母细胞增殖，增加其凋亡，最终形成小肝脏。Wnt信号协同HGF（hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子）和FGF信号通路促进肝母细胞增殖。β-catenin磷酸化、HGF受体MET及FGF介导的核转位都可以激活Wnt信号通路。

双向潜能的肝母细胞在门静脉间质可分化形成肝细胞和胆管细胞，这一过程受到TGF-β、Notch、Wnt、BMP和FGF的调节。TGF-β2和TGF-β3的表达在门静脉周围形成TGF-β活性梯度，其在门静脉周围间质活性最高，能够促进肝母细胞向胆管细胞分化。Notch信号可促进肝母细胞向胆管细胞分化。编码Notch配体的Notch2或JAG1基因发生突变，可引起胆管细胞缺乏，导致Alagille综合征发生。

Wnt能够促进胆管细胞分化、增殖和成活。在小鼠孕中期，β-catenin的缺失可引起胆管结构缺陷，并且促进肝母细胞凋亡。非典型Wnt通路也参与胆管的发育。当Wnt/PCP（planar cell polarity，细胞极性）通路遭到破坏则损害胆管形成。此外，敲除Wnt5a可增加胆管前体细胞数量，促进胆管细胞标志物的表达。

（四）肝细胞的成熟

细胞因子抑瘤素M（oncostatin M，OSM）、HGF、Wnt和糖皮质激素相结合促进肝细胞的分化、成熟。OSM通过激活gp130受体和JAK/STAT3信号通路诱导代谢成熟，通过K-ras和E钙黏蛋白促进形态成熟。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）可拮抗OSM，抑制肝细胞的成熟，维持胎儿肝细胞的增殖能力。

四、肝脏发育过程中的基因调节

FoxA转录因子对维持肝脏胜任力（即对肝脏诱导信号的反应能力，进而能够发生肝脏特化过程）非常重要。研究发现，FoxA1、FoxA2敲除的小鼠，肝脏特化基因将无法表达。GRG3辅阻遏物能够结合FoxA转录因子从而抑制肝脏胜任力。在小鼠胚胎内胚层体内的DNA绑定研究中，发现FoxA2和Gata4-6因子与白蛋白基因增强子捆绑，以增强染色质的可及性并增强这种肝基因转录的能力或胜任力。在斑马鱼的研究中发现，尽管肝芽已经形成，GATA4、5、或6的缺失仍然会严重阻碍肝芽生长。GATA4、5、6中任何两种的缺失都将阻断肝脏发育。GATA4和GATA6参与肝母细胞的迁移以及维持肝脏转录因子的表达。它们通过结合Hhex的启动子来调控Hhex表达，进而调节肝母细胞发育。Hhex编码一个同源结构域蛋白，同时表达于肝脏细胞核胆管上皮细胞中，对肝芽的形态形成是必需的。Hhex突变的胚胎，虽然肝憩室能够形成，但细胞不能增殖和向原始横膈间质迁移。肝憩室中Hhex对于Hnf4a、Hnf6和Hnf1b的正常表达是必需的，Hhex的突变可形成发育不全的囊性肝脏。Prox1是肝母细胞表达的另一种同源框转录因子，它的缺失会阻碍肝母细胞向横膈间质的迁移以及扩增。Sox17与内胚层的特化相关。基因学研究表明Sox17的主要功能是促进Pdx1+的胆胰祖细胞向肝外胆管系统的特化。当腹侧内胚层处于肝脏特化过程中时，Sox17的表达则下调。

肝母细胞的分化受一系列的转录因子调控，其中包括FoxA2、HNF1β、HNF1a、HNF4a、HNF6及NR5A2。肝母细胞缺乏HNF4a，肝脏结构（包括内皮细胞结构）发生紊乱。在介导干细胞分化过程中，阻断HNF4a的表达则会阻断肝脏特化过程，同样也会阻断FoxA1/2、GATA4/6的表达。Hhex+肝脏祖细胞的迁移需要HHN6和Prox1，但随后的细胞分化需要不同的基因表达，比如肝细胞需要Prox1和HNF4a，胆管细胞需要HNF6、HNF1b、Sox9。肝母细胞中Prox1表达缺失导致胆管细胞的增殖代替肝细胞。HNF1b敲除则会导致胆管缺失或胆管发育不良。