第五节　卵母细胞成熟与调控

哺乳动物的卵母细胞成熟包括核成熟和细胞质成熟，核成熟的标志是生发泡破裂（germinal vesicle break down，GVBD）、同源染色体分离、第一极体排出到卵周间隙。细胞质成熟是指卵细胞质发生的一系列变化，包括蛋白质合成、细胞器重排、微丝微管合成等，细胞质成熟对卵母细胞的受精和早期胚胎发育至关重要。体内成熟的卵母细胞核与质成熟大多是同步的，而体外成熟卵母细胞的最大缺陷是细胞质成熟落后于核成熟。细胞质不成熟会导致卵母细胞受精，胚胎发育及产生健康婴儿的能力下降，具体的分子机制和生理生化过程知之甚少。

相关研究提示：卵母细胞成熟的调控不是一个单纯的级链式作用，而是一个非常复杂的多因子调节过程。既往的研究关注的主要是下丘脑-垂体-卵巢轴对卵母细胞的内分泌调节，最近的研究发现卵巢内部的旁分泌（paracrine）和细胞间通讯调节（cell to cell communication）对于卵母细胞的成熟有非常重要的作用。

一、卵母细胞核成熟

从始基卵泡形成时，卵母细胞的细胞核就停滞在减数第一次分裂的双线期，直至发育到成熟前才恢复，但从始基卵泡激活启动发育开始，卵母细胞本身的生长就一直在进行着，体积不断增大，胞内物质不断积累，为最终的成熟做准备。研究发现，当优势卵泡发育到大的有腔卵泡，并且其中的卵母细胞体积达到成熟时的80%时，才具有获得减数分裂的能力。在成熟前，卵母细胞合成大量减数分裂有关的分子，并长期以无活性的形式存在。

（一）核成熟的过程

卵母细胞核的成熟在形态学上主要表现为GVBD和第一极体的排出。发育早期，停留在双线期的卵母细胞中就已经形成了生殖泡，其以体积大和缺乏异染色质为特征。随着卵母细胞的发育，生殖泡的直径逐渐增大，其中的核仁大而明显。在LH峰之前先到来的FSH峰会促使生殖泡中的染色质开始在核仁周围凝集，并靠近核膜。核膜呈波浪形，表面有许多核孔，用以细胞核与细胞质之间物质和信息的交流。卵母细胞发育过程中核膜上的褶皱逐渐增多。随着LH峰的到来，核仁消失，核膜解体并融入内质网系统，生殖泡在细胞骨架系统的牵引下向卵母细胞皮质区迁移。在染色质凝集完成20~24小时之后，GVBD发生，形成二价染色体，减数第一次分裂（MⅠ）恢复并从前中期开始。需要强调的是，GVBD的发生虽然依赖于卵母细胞的生长发育，但发生GVBD的卵母细胞并不一定都可以完成减数分裂而成熟。故GVBD只是标志着卵母细胞具有成熟的能力以及减数分裂的开始。

卵母细胞中没有中心粒，在GVBD发生后，凝集的染色体上的着丝粒与微管蛋白相连，后者牵引染色体排列在赤道板上，并共同形成纺锤体（spindle）。随后，纺锤体在肌动蛋白、微丝的共同作用下，迁移至卵母细胞表面动物极质膜下，此阶段为MⅠ的中期，可维持数小时。之后同源染色体分离，分别进入两部分细胞质，在LH峰或外源性补充HCG后约36小时，排出第一极体并形成次级卵母细胞。次级卵母细胞不经过DNA复制，直接进入减数第二次分裂（MⅡ），最终停滞在MⅡ中期等待受精。至此，卵母细胞核已经成熟，第一极体的排出为核成熟的标志。这个过程中，卵母细胞的细胞质分裂极不均等，使次级卵母细胞与第一极体在体积上有显著差别，但两者带有等量的染色体。此外，第一极体还含有较多的细胞器，包括线粒体、核糖体等。

（二）核成熟的调节

卵母细胞的成熟过程涉及包括促性腺激素在内的多种因子的调控。当增长到一定程度时，可在LH或HCG的刺激下启动成熟。前已述及，卵母细胞核成熟的重要事件为减数分裂的恢复，因而对减数分裂停滞与恢复的调控成为核成熟的关键。

1.MⅠ停滞

生理现象表明，发育到一定程度的卵母细胞最终是在LH或HCG的刺激下启动成熟，恢复减数分裂。而实验发现，当卵母细胞脱离卵泡环境之后，没有LH的刺激也可以自发恢复减数分裂。但在体外培养整个卵泡或者利用卵泡液培养裸卵，卵母细胞的减数分裂不能自发恢复，另外，体外环境下共培养裸卵和颗粒细胞也不能自发成熟。这些研究表明，卵母细胞本身具有自发成熟的能力，而卵泡中的体细胞可通过与卵母细胞的相互作用或向卵泡液中分泌某些物质而抑制其减数分裂的恢复。目前认为相关的抑制因子包括卵母细胞成熟抑制因子（oocyte maturation inhibitor，OMI）、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、次黄嘌呤，以及其他可以提高卵母细胞中cAMP的物质。

2.cAMP

目前研究较清楚的是cAMP，实验发现，向培养液中加入cAMP类似物、cAMP激活剂、磷酸二酯酶抑制剂等增强cAMP含量或效应的物质，均可阻止体外培养的裸卵的减数分裂的恢复。卵母细胞中的cAMP一部分由卵泡中体细胞产生通过缝隙连接运输到卵母细胞中，此外，颗粒细胞的代谢产物可以影响卵母细胞自身合成cAMP。有研究认为，cAMP对卵母细胞的成熟具有抑制和促进的双重作用，即cAMP的持续升高及维持在高浓度可以抑制减数分裂的恢复，促使细胞停滞在MⅠ期，而cAMP短暂升高可促进其减数分裂的开始，然而后一种说法并没有得到更多的实验证实。卵母细胞中，高浓度的cAMP主要是通过抑制卵母细胞中的成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）的活性来阻止减数分裂的恢复。MPF已被证明是由细胞周期依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）和周期蛋白B（cyclin B，CYB）组成的蛋白复合物，其中CDK1为催化亚基，CYB为调节亚基。在LH峰之前，卵母细胞内高浓度的cAMP可以激活磷酸激酶A（PKA）信号通路，后者可以间接使CDK1上的第14位苏氨酸（Thr14）及第15位酪氨酸（Tyr15）残基磷酸化而导致MPF失活。除了维持减数分裂停滞之外，也有文献报道，在成熟之前，卵母细胞中适量的cAMP可以调节卵母细胞中成熟相关蛋白的转录，以及防止染色质过快过度地凝集。

cAMP的含量主要由腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）及磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）调控，AC以ATP为底物催化生成cAMP，而PDE则可将其降解。研究认为成熟前卵母细胞中高浓度cAMP的维持主要是通过卵母细胞与周围卵丘细胞等的相互作用，从而改变AC和PDE的活性而实现的。卵母细胞表面存在3型或12型G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPR），可以接受来自颗粒细胞的信息，激活下游的Gs蛋白（激活型G蛋白），后者活化细胞中AC生成大量cAMP，这是卵母细胞中高浓度cAMP的主要来源。而卵丘细胞中的AC也可以在FSH的作用下活化，生成cAMP，后者也可通过细胞间的缝隙连接被转运至卵母细胞中，称为卵母细胞cAMP的另一个来源。细胞内的磷酸二酯酶（PDE）是一种可由cGMP抑制的cAMP水解酶。PDE有多种亚型，研究证明PDE3A是卵母细胞中所特有的，其在促性腺激素诱导的减数分裂恢复过程中有重要作用，卵泡体细胞中含有PDE4，被认为是促性腺激素刺激后反馈调节cAMP水平的分子，FSH和LH均可以诱导卵丘细胞中PDE4的mRNA的表达，提高其含量。在LH峰到来之前，卵丘细胞中的cGMP通过缝隙连接被转运至卵母细胞，可抑制PDE3A的活性，帮助维持成熟前细胞内的高浓度cAMP环境。此外，近年的研究还发现利钠肽（natriuretic peptides）具有促使卵母细胞停滞在MⅠ阶段的作用。利钠肽家族主要有三种形式，分别是心钠肽、脑钠肽及C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）。卵泡中的颗粒细胞可以分泌CNP，并且卵丘细胞表面表达2型利钠肽受体 （natriuretic peptides receptor 2，NPR2）。动物实验表明CNP与其受体结合后，激活其所偶联的鸟苷酸环化酶，可以增加卵丘细胞内cGMP的含量，研究者认为这是卵泡中cGMP的主要来源，后者通过缝隙连接进入卵母细胞，抑制PDE活性，维持cAMP的高水平，最终抑制卵母细胞减数分裂的恢复。值得一提的是，CNP的合成也受到多种因子的调控。实验发现，颗粒细胞合成CNP的一个必要条件是细胞内环境中一定要有雌二醇的存在，否则不能合成。而FSH可以影响颗粒细胞产生雌激素，因此可以间接增强CNP的生成，且这个过程还受GDF-9及BMP-15的协同促进作用。

卵泡液的其他抑制成分：体外实验发现，卵母细胞培养液中加入50%的卵泡液，可在大约48小时后阻断25%的卵母细胞核成熟，但阻断的时间不超过30分钟。说明卵泡液中具有抑制细胞核成熟的物质，但其作用有限，不如cAMP那么强。研究认为，卵泡液中的抑制物包括次黄嘌呤和多种类固醇等，主要来源于颗粒细胞。次黄嘌呤可以抑制PDE的活性而间接提高cAMP的水平；类固醇中的雌二醇和睾酮均可对减数分裂起到抑制作用，黄体酮可能有促进作用。

MⅠ恢复：卵母细胞中高水平的cAMP在细胞核维持减数分裂停滞的过程中具有重要作用，cAMP可以通过PKA实现对MPF的磷酸化而导致后者的失活。而随着LH或HCG峰的到来，一方面，卵母细胞中的cAMP在促性腺激素作用下水平下降，解除了对MPF的抑制作用，触发MⅠ的恢复；另一方面，在LH的影响下卵母细胞中钙离子浓度快速升高，也可以激活减数分裂的重新启动。

成熟促进因子（MPF）：MPF是由催化亚基——细胞周期依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）和调节亚基——周期蛋白B（cyclin B，CYB）组成的蛋白复合物，其作用底物为核纤层蛋白与DNA组蛋白H1。CDK1也称细胞周期依赖蛋白激酶2（cell division cycle 2，cdc2），具有激酶活性，当其第161位苏氨酸（Thr161）被磷酸化时MPF被激活，可与细胞骨架相互作用，通过磷酸化微管蛋白来调控纺锤体的活动。动物实验发现，在卵母细胞成熟之前，高水平的cAMP使cdc2上第14位苏氨酸（Thr14）及第15位酪氨酸（Tyr15）残基磷酸化而导致MPF失活，称为MPF前体（pre-MPF）。LH峰到来以后，cAMP水平降低，并且此时pre-MPF数目也已积累到一定的阈值，可在促性腺激素的协同作用下激活卵母细胞中的一种双特异性磷酸酶cdc25，后者使cdc2亚基上Thr14及Tyr15发生去磷酸化，pre-MPF被转化为有生物活性的MPF。MPF的含量在GVBD前达到峰值，通过对微管蛋白的磷酸化作用，促使GVBD发生，卵母细胞迅速由双线期转化为分裂中期Ⅰ，减数分裂恢复。随着第一极体的排出，MPF被大量水解达到低谷，直至减数第二次分裂的恢复，再重新积累到高峰。

促性腺激素对核成熟的调控：在哺乳动物中，卵母细胞MⅠ的恢复是在促性腺激素（包括内源性的FSH、LH及外源性的HCG）的作用下启动的。在排卵前，循环中的FSH及LH在排卵前有一个峰值，5小时左右之后该峰值出现在卵泡中，并且FSH略早于LH峰值，认为FSH峰可能对卵母细胞成熟前生殖泡中染色质的凝集具有促进作用，为成熟做准备。然而FSH受体表达在卵泡颗粒细胞表面，LH受体主要表达在大的窦卵泡的壁颗粒细胞上，卵丘细胞没有，并且这两种受体均未在卵母细胞上被检测到。这种现象表明，促性腺激素并不直接作用卵母细胞本身，而是通过与卵泡中的体细胞相互作用，后者通过旁分泌或缝隙连接而实现对卵母细胞成熟过程的调控。

尽管FSH与LH在卵母细胞成熟中有着不同的作用，且相较之下LH更为关键，但两者相互协同，是减数分裂恢复的最重要的启动因素。充分发育的卵泡中FSH峰的出现先于LH峰，可以通过间接作用促进GV内染色质的凝集，以及向核膜方向的聚集，并且FSH可以直接作用于壁颗粒细胞和卵丘细胞表面的受体，提高卵泡颗粒细胞中第二信使cAMP的水平，后者可以激活细胞内PKA及PKC，PKA可以继续向下激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），使卵丘细胞包裹卵母细胞（cumulus-enclosed oocyte，CEO）恢复减数分裂。FSH诱发的减数分裂恢复会导致卵丘-卵母细胞复合物（cumulus-oocyte complex，COC）中卵丘细胞分泌透明质酸而发生卵丘细胞的扩展，并减少卵母细胞与卵丘细胞之间的缝隙连接，从而阻止抑制减数分裂的物质（如cGMP）向卵母细胞中的运输，这对于减数分裂的顺利进行与排卵的发生具有重要意义。FSH所诱导激活的PKC下游通路还存在争议，但实验表明其对卵母细胞的核成熟具有促进作用，利用PKC的激活剂PMA可以在体外缺乏促激素的情况下诱导减数分裂的恢复，而多种PKA的抑制剂却可以阻断卵丘细胞中FSH对MAPK的作用。另有研究认为可以协同PKA促进表皮生长因子类物质的合成。

LH峰被认为是体内卵母细胞核成熟最关键的使动因素，可以通过多种途径降低卵母细胞中cAMP的水平，增强MPF的活性而重启减数分裂。CNP可由卵泡壁颗粒细胞合成，作用于卵丘细胞上的受体NPR2从而促进卵丘细胞内cGMP的合成，后者可以抑制PDE3A的生物活性而导致卵母细胞中cAMP的积累。当LH作用于壁颗粒细胞表面的受体时，另一方面也可抑制CNP蛋白的转录，导致NPR2下游的靶蛋白——鸟苷酸环化酶活性受抑制，cGMP水平下降，解除了其对PDE3A的抑制，后者水解cAMP，进一步可触发减数分裂的恢复。卵泡中细胞之间的缝隙连接作为物质及信息传递通道，在卵泡发育以及维持MⅠ停滞状态中起着十分重要的作用，可以将包括cGMP在内的多种物质传送进卵母细胞。在GVBD发生前，LH可以通过激活MAPK依赖性信号通路使细胞表面连接蛋白Cx-43上过个位点磷酸化而失活，减少体细胞对卵母细胞减数分裂的抑制作用，降低卵母细胞中的cGMP含量，促进MⅠ的恢复，以及核的成熟。

实验发现，在LH峰之后与GVBD之前，卵泡壁颗粒细胞中的cAMP含量会出现一个一过性的增多，随后在GVBD前后又迅速下降。研究认为，LH峰作用于颗粒细胞表面的LH受体，后者为G蛋白偶联受体，受LH激活，可增加下游第二信使cAMP的水平，造成其含量大幅增高，可以达到原先的80~200倍。而关于这部分急剧增多的cAMP是否会被传送入卵母细胞，还存在争议。体外实验中，成熟前卵泡体细胞中cAMP含量的快速增加有助于COC中卵母细胞与卵丘细胞的分离，在卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）过程中有促进作用，认为在体内cAMP的这种变化有助于排卵的发生。

LH峰引起的卵泡内生长因子的合成及其在核成熟和细胞质成熟中的作用：哺乳动物的卵母细胞本身不表达LH受体，对直接的LH和HCG的刺激也不敏感。长期以来，一直有推测是卵泡中的一些体细胞，如颗粒细胞、卵泡膜细胞等受LH刺激后分泌某些生长因子，以旁分泌形式作用于卵丘/卵母细胞，促进了卵母细胞的核成熟和细胞质成熟（图2-2）。近年来，一系列动物研究结果支持这一推测，在LH作用下，卵泡中的几种体细胞可以合成多种生长因子，包括表皮生长因子、胰岛素样生长因子、内皮素-1、胶质细胞来源神经营养因子及脑源性神经营养因子等，这些生长因子可以通过旁分泌作用，间接促进GVBD的发生和/或第一极体的释放以及细胞质成熟。我们的研究发现一些生长因子，如内皮素-1、胶质细胞来源神经营养因子能以旁分泌形式对人卵母细胞的核成熟和细胞质成熟起调节作用。临床研究也证实，在培养液中添加表皮生长因子、胶质细胞来源神经营养因子及脑源性神经营养因子能促进人卵母细胞的成熟，为以后改进体外成熟培养液，更有效地进行人卵母细胞体外成熟培养打下了基础。

Kit Ligand：KitL在哺乳动物卵泡内主要由颗粒细胞分泌，可与卵母细胞表面的c-kit受体结合，影响卵母细胞的生长和发育。近年小鼠实验还发现，在LH/HCG的作用下，排卵前卵泡中以及HCG注射后4小时的小窦卵泡中KitL的表达量显著上升。向小鼠卵丘-卵母细胞复合体中加入KitL发现，KitL会通过剂量依赖性的模式，上调卵泡中cyclin B1的水平来促进卵母细胞核的成熟，加速第一极体排出。近几年还发现哺乳动物卵泡中C型钠尿肽的水平，降低后者促进cGMP生成的过程，促使减数分裂的恢复。

表皮生长因子类：早期体外实验就已证实，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）在有次黄嘌呤存在的抑制环境下也可以促使减数分裂的恢复。近年来还发现在人体和动物体内，成熟前的卵泡中存在EGF样多肽（EGF-like peptides，EGF-p），可以在LH峰及cAMP的刺激下促进减数分裂的恢复以及排卵的发生，主要包括双调蛋白（amphiregulin，AREG）、外调蛋白（epiregulin，EREG）及BTC（β-cellulin）。研究证实，这三类表皮生长因子样生长因子（EGF-like growth factors）均可与位于颗粒细胞、卵丘细胞表面的表皮生长因子受体（EGF receptor，EGFR）结合，通过不同的机制诱导卵母细胞中减数分裂的恢复，促进卵母细胞的核成熟。如在小鼠卵泡中，AREG和EREG可以抑制颗粒细胞及卵丘细胞中C型钠尿肽mRNA的表达，从而抑制C型钠尿肽诱导生成cGMP的作用，促进减数分裂的恢复。另有研究发现，EGF样生长因子可以上调包括Has2、Ptx3、Ptgs2在内的多种可促进卵丘细胞外基质合成的蛋白的mRNA的表达，从而促进卵丘的扩展，加速核成熟，为排卵做准备。近年来还发现，内皮素-1（endothelin-1，ET-1）作为EGF样生长因子家族的一员，可在LH/HCG的刺激下，由成熟前卵泡的颗粒细胞合成，并且ET-1可与卵丘细胞表面的受体（ETRA和ETRB）结合，下调卵丘细胞与卵母细胞之间的连接蛋白Cx-26等途径来促进卵母细胞的核成熟。

胰岛素样生长因子：胰岛素样生长因子3（insulin-like 3，INSL-3）最早被发现在雄性动物睾丸Leydig细胞中，在生精过程中具有重要意义。随后，研究人员又在卵巢的膜细胞和黄体中检测到了INSL-3的表达，且INSL-3基因敲除鼠表现为不孕。体内和体外实验均证实，卵泡膜细胞可以在LH峰或HCG的作用下合成INSL-3，后者与位于卵母细胞表面的抑制性G蛋白偶联受体LGR8结合，抑制G蛋白下游通路的激活，减少卵母细胞中cAMP的生成，解除cAMP对减数分裂的抑制作用，促进卵母细胞核成熟。

神经营养因子类：研究已经证实，多种神经营养因子，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）、神经营养素3（NT-3）等，不仅可在神经系统中起作用，还可以在哺乳动物卵巢中发挥功效，如促进卵母细胞的生长、发育、成熟，以及成熟后的早期胚胎发育的一系列准备活动等。目前研究较为清楚的是BDNF、GDNF。较早研究发现，在LH或HCG的作用下，鼠卵泡中颗粒细胞与卵丘细胞中BDNF的表达量显著上升，后者与位于卵母细胞表面的TrkB受体结合，与卵母细胞直接相互作用，促进第一极体的释放，并可以加速细胞质的成熟，为受精与早期胚胎发育做准备；类似的GDNF也在LH或HCG的刺激下表达上升，与卵母细胞上的受体（GFRA1、RET蛋白）结合，上调卵母细胞中CYB蛋白，促进第一极体释放。最新研究还发现GDNF可以下调卵泡中小RNA（如miR-145-5p），进一步强化卵丘细胞的作用，促进卵母细胞核成熟等。

钙离子的作用：多种体内外实验表明，钙离子（Ca2+）在卵细胞核的成熟中发挥着关键作用。卵母细胞内Ca2+的高频释放被认为是减数分裂启动的最早标志之一，Ca2+与钙调蛋白可以共同调节卵母细胞中PDE的活性，后者可显著降低cAMP的水平。卵泡生长过程中，卵母细胞中的Ca2+持续低频释放，直至促性腺激素诱导核成熟启动时，Ca2+的释放出现一个高峰，并且在这个阶段卵母细胞中Ca2+总量也大幅增加，因此在IVM的培养液中Ca2+是必不可少的成分。卵丘细胞中，在FSH和LH的作用下，水解磷脂酰肌醇（phosphatidylinosital biphosphate，PIP2）为二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol triphosp，IP3），其中DAG可在Ca2+参与下激活PKC，参与核成熟的调控，而IP3则可与受体结合使颗粒细胞内储存的Ca2+大量释放，通过缝隙连接进入卵母细胞，IP3本身也可穿过缝隙连接，促进卵母细胞自身钙离子向胞质内的大量释放，达到一定浓度后激活卵细胞。

醇类与甾体类物质：研究显示，卵泡中在促性腺激素作用下生成的甾醇与甾体类物质也在核成熟过程中发挥作用，主要包括减数分裂激活甾醇（meiosis activating sterol，MAS）及性腺甾体类激素。MAS是胆固醇合成过程中的中间产物，在雌性哺乳动物的卵泡液中及雄性动物的睾丸中都有发现。体外实验中，用MAS处理与卵泡环境分离的裸卵，发现其可以促使减数分裂的恢复。在体内，促性腺激素峰作用之后，卵泡液中的MAS水平上升。在FSH的作用下，卵丘细胞中PKA2-CREB信号被激活，CREB可以帮助启动细胞色素P51（CYP51）的转录，后者被证明是MAS合成的关键酶，可促进MAS的生成。此外，CYP51还可以促进甾体类激素的合成，并可能参与由EGF诱导的MAPK磷酸化过程而协同促进核的成熟。而LH在促进MAS合成的过程中是否起作用，还有待研究。除本身作用之外，MAS还可以在受精后促进第二次减数分裂的完成并有助于提高卵子的质量，也可以被代谢为孕激素发挥作用。实验发现MAS抑制剂同样可减少卵泡内孕激素的合成。已在包括人类在内的多种动物中证实，卵丘细胞在促性腺激素作用下通过多种路径合成孕激素，包括EGFR下游通路、CYP51的作用等。孕激素生成后，可与卵丘细胞中的受体结合，下调cAMP水平，以及通过减少Cx-43而关闭缝隙连接，达到诱导减数分裂恢复的目的。目前，关于雌二醇和睾酮对卵母细胞成熟的作用还存在争议，有研究认为雌二醇和睾酮抑制减数分裂恢复，也有学者认为无作用。也有研究认为雌二醇、睾酮与受体结合可以通过MAPK信号，促使幼鼠裸卵减数分裂的恢复。目前认为这些争议性结论可能是由于裸卵具有自发恢复减数分裂的能力，以及将卵母细胞从COC分离出来可能已经破坏了其甾体类激素的微环境，故雌二醇与睾酮对卵母细胞核成熟的作用还需进一步探究。

二、卵母细胞胞质与卵膜的成熟

卵母细胞从形成后不断生长发育到成熟，细胞质的成分经历了一系列复杂的变化，尤其是卵母细胞在促性腺激素作用下成熟的过程，即从GVBD到MⅡ中期，细胞质中的细胞器与其他分子的生理生化改变最为明显，这种变化就是卵母细胞质的成熟过程。总体而言，始基卵泡中卵母细胞胞质的细胞器较少，聚集在核周围。在卵母细胞被激活生长的过程中，细胞器的数量增多，并在细胞骨架的作用下向不同位置迁移，与此同时，随着卵母细胞体积的不断增大，胞质中的蛋白合成活跃，多种与卵子成熟及受精和早期胚胎发育相关的物质逐渐积累，便于卵子的成熟、受精及胚胎发育的支持。因此，卵子的成熟不仅仅是前文所述的核成熟与减数分裂的完成，胞质的成熟也具有重要意义。

1.线粒体（mitochondria）

线粒体是细胞中最重要的细胞器之一，由双层线粒体膜、嵴、基质组成，通过氧化磷酸化的作用为细胞中的多种代谢活动提供能量。卵母细胞成熟、受精嵴早期胚胎发育过程中均需要大量的能量，因此线粒体的作用至关重要，其分布和代谢活性也是细胞质成熟和减数分裂恢复的重要特征。在卵子的早期发育过程中，线粒体的形态、数目与代谢活性经历一系列的变化，以适应卵子多种代谢活动的能量需求。早期卵泡中卵母细胞的线粒体主要沿核周分布，形态呈圆形，内无嵴或很少。次级卵泡之后，线粒体数目大幅增长并逐渐向皮质区移动，为卵母细胞的成熟做准备。许多研究证实，在卵母细胞成熟过程中（这里主要指GVBD到MⅡ中期），线粒体发生了多种改变，包括线粒体数目及DNA（mtDNA）的含量变化、在皮质区分布的改变、膜电位与氧化磷酸化的改变等。

成熟前，卵母细胞体积最大的时候，线粒体的数目也达到顶峰，而在成熟过程中，研究者认为线粒体的数目下降大约2/3，但数量上的改变并不能十分确切地反映线粒体功能的变化，因为此阶段的线粒体之间存在大量的融合与裂变，形成大小不一的团状线粒体组织。值得一提的是，从始基卵泡起，线粒体中的mtDNA就开始大量的复制，其拷贝数可由最初的数千增长到数十万，以抵消线粒体在卵子成熟时融合与裂解所造成的数量上的损失，达到一定的平衡。并且有学者认为，mtDNA的数量最终需要达到一定的阈值，才能保证后续的成熟、受精、早期胚胎发育的顺利进行。此外，从GVBD到MⅡ中期，线粒体在微管的作用下，在卵母细胞皮质区域迁移与聚集，这也是胞质成熟的特征之一。小鼠实验发现，在GVBD之前，线粒体在皮质区分散排列。随着GVBD的发生，超过40%的线粒体在即将形成的MⅠ纺锤体的附近聚集，并与周围大量的内质网相邻，在纺锤体的形成与染色体分离，第一极体的排出过程中提供能量。而到了MⅡ中期停滞时，纺锤体附近则不再有大量的线粒体，取而代之的是该区域大量的致密颗粒，直至MⅡ恢复时线粒体才在纺锤体周围重新聚集。鉴于线粒体的这种聚集现象是在微管蛋白的牵引下完成的，因此也受到微管蛋白调控因子的调节，如动力蛋白抑制剂可以阻断此过程的发生。卵泡成熟过程中，卵母细胞中的线粒体产生ATP的能力也会随着其内外膜电位差的改变而受到调控，以适应卵子不同区域的代谢需求。尽管在所有线粒体在形态与微观结构上十分相似，但内外膜电位差的大小直接决定着线粒体进行氧化磷酸化的能力强弱，即产生ATP的能力。现已证明这种电位差的上调在卵子耗能高的区域和时段最为聚集，如在MⅠ纺锤体的附近以及随后受精过程中卵子皮质区域等，并且发现电位差的上调可以被由放射冠细胞所产生的NO分子所抑制。卵母细胞成熟过程中，胞质内有三次ATP合成高峰，分别是GVBD发生时、纺锤体向皮质迁移时，以及第一极体释放时。与之相对应，GVBD时核周出现线粒体的聚集与膜电位的上调，纺锤体迁移时这种现象出现在纺锤体附近，第一极体释放时出现在卵子边缘并处于纺锤体的中间。

2.内质网（endoplasmic reticulum，ER）

ER是蛋白质合成的主要场所，发育早期的卵母细胞中就有大量的ER存在，并且以含有核糖体的粗面内质网（rough ER，RER）为主。随着卵母细胞的生长，ER的含量不断增多，到卵母细胞达到最大体积时，RER最为发达，随后开始减少，到卵母细胞成熟时RER消失，滑面内质网（smooth ER，SER）增多。SER是细胞内的钙离子库，核成熟以及受精过程中所需的钙离子主要从SER中释放。此过程是通过IP3与ER表面的受体结合而介导完成的。在成熟过程中的卵母细胞中，ER逐渐向卵母细胞皮质，由GVBD之前不规则的囊泡逐渐转化为直径1~2μm的团簇状囊泡，在卵母细胞皮质的纺锤体附近排列。在小鼠以及包括人类在内的哺乳动物中都已证明，从GV到MⅡ中期，SER的数目翻倍且对IP3的敏感性提高，聚集位点及功能与线粒体紧密相连，均在纺锤体附近，协助纺锤体向卵母细胞一极迁移，与线粒体协同作用而推进MⅠ的进行。

3.高尔基复合体（Golgi apparatus，GA）

GA是细胞中蛋白质合成后修饰与转运的重要场所。在卵泡生长过程中，颗粒细胞里的GA在S期可聚集于中心体附近与其协同作用完成颗粒细胞的增殖。初级卵母细胞中，GA分布于细胞核的周围，随后逐渐迁移至皮质区数量增加。以前有观点认为，到了卵母细胞成熟时，GA会消失。近年有研究认为，在GVBD之前，GA呈微小的囊泡状（mini-Golgis）分散于胞质中，并且此状态会一直持续到MⅡ期，而并非完全消失。在小鼠与牛中发现，相比卵母细胞皮质区，小的GA囊泡似乎更多地聚集在胞质的内部，其活动受到微管蛋白与细胞质动力蛋白的调控。动物实验中，利用药物抑制ER向GA的质膜流动，会抑制甚至逆转卵母细胞的成熟，推测GA的活动可主动参与并调控成熟的过程。近期在小鼠成熟的卵母细胞中发现一种存在于顺面GA囊泡中的蛋白——GM130，可参与调控ER到GA的膜流、糖基化及维持GA的稳定性。GVBD之后，带有GM130蛋白的GA小囊泡会聚集在卵母细胞的中央，GM130蛋白可以募集微管成核因子（microtubule nucleating factor），在纺锤体形成的过程中发挥协同作用，最终参与细胞极化以及分裂的过程，随后在MⅡ停滞期GA分散，直到MⅡ再次启动才重新聚集在纺锤体的附近。据此，至少可以认为在小鼠中，一部分GA小囊泡可以通过其内所包含的GM130分子参与微管成核与纺锤体形成而促进减数分裂的进行。需要注意的是，小鼠卵母细胞中GA的这一作用需要多个微管形成中心 （multiple microtubule organizing center，MTOC）参与完成，但在包括人在内的其他多种生物的卵母细胞中不存在这一结构。因此，对于GA在哺乳动物卵子成熟中的作用与机制还有待探究。

4.皮质颗粒（cortical granules）

皮质颗粒是一种位于卵母细胞皮质下方的独立的膜细胞器，为卵母细胞中所特有。其内含有蛋白酶、过氧化物酶等多种水解类物质，主要作用是调控透明带反应以保证单精子受精及早期胚胎发育。从卵泡的早期发育，皮质颗粒就开始形成，并聚集在细胞核附近，关于其来源，有研究认为与卵母细胞中高尔基复合体的活性调节有关。不同动物中皮质颗粒生成的时间不同，如啮齿类动物的初级卵泡中就有皮质颗粒，而猴子、人类等灵长类动物到次级卵泡才生成。卵母细胞成熟时数量最多，是其成熟的标志之一，此时的皮质颗粒成单层分布于卵膜下方，精卵融合后，皮质颗粒在内源性钙离子的作用下向外继续迁移并与卵膜融合，将其内物质释放入卵周隙以完成透明带反应。

5.卵母细胞核质成熟的协调

卵母细胞的成熟主要包括细胞核与细胞质的成熟，最先开始的是减数分裂的恢复，随后才逐渐获得受精与发育的潜能，因此在核与质的成熟上有明显的不同步性。只有当细胞核与细胞质都完全成熟后，卵母细胞才可以完成受精与早期胚胎发育的过程。并且，核的成熟调控着胞质的活动，胞质的成熟保证减数分裂的准备与恢复的顺利进行，两者相互促进相互影响。在卵母细胞体外成熟的过程中，胞质的不完全成熟往往是导致受精率下降的主要原因。如实验发现，从小的窦卵泡中可以提取出即将核成熟的卵母细胞，在体外培养下可顺利发育至MⅡ中期，并可以完成受精。但再受精后却很难继续发育，提示胞质与胞核成熟协调的重要性。但目前对于胞质与胞核成熟的确切时间还存在争议，多数人认为胞质较胞核的成熟稍晚一些。