一、表面化学梯度的制备方法

（一）基于单分子层组装的梯度制备方法

表面单分子层自组装（self-assembly monolayer，SAM）根据基底大致分为两类：一种是玻璃基底或硅基底表面的修饰，另一种是金基底或银基底表面硫醇的修饰。

最经典的表面硅烷梯度的构建方法是1992年Whitesides提出的。将癸基三氯硅烷溶解在液体石蜡中，靠近硅片表面并使其挥发，硅烷沿着表面扩散，并部分吸附，从而形成梯度。Chaudhury等利用这种方法构建了其他表面上的硅烷梯度，并通过调控表面亲疏水性使液滴在表面运动。Genzer利用硅烷扩散形成梯度的原理，制备了表面引发剂的梯度，进而成功得到了聚合物分子刷的梯度。该修饰方法在其他基底例如聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）和多孔二氧化硅表面同样适用。溶剂扩散的方法也能够制备表面梯度。将硅烷[Cl₂（CH₃）₂Si]溶解在三氯乙烯中，表面覆盖二甲苯，当两种溶剂互相渗透，在浸入的硅片表面或玻璃片表面形成梯度。由化学组分梯度得到表面亲疏水性梯度的制备方法有很多，例如硅片表面微接触印刷、紫外辐照使硅片表面氧化（梯度滤光片或梯度的辐照时间）等。

在表面预先吸附一层SAM，对其梯度处理也能构建梯度。例如，移除一部分SAM，再回填其他分子（图4-4A）；或将末端分子通过处理，将一部分端基转化为其他分子。例如将金片表面接枝的4-硝基联苯通过电子束处理，将末端选择性还原成氨基，进一步固定其他高分子链，形成链密度的梯度（图4-4B）。

硫醇梯度的制备方法是由Liedberg在1995年提出的，通过两种功能硫醇在金片表面扩散，形成连续梯度。Terrill基于电化学沉积提出了另一种通过电势窗口烷硫醇的梯度制备方法。电势窗口宽度和电极间距的改变可以调节梯度的宽度和斜率。这种方法制备的烷硫醇梯度在其他方面有很多应用，例如质谱、纳米粒子黏附等。

光催化氧化、低能电子和X线可以降解烷硫醇的单分子组装层，进而获得烷硫醇梯度。改变在X线下的曝光时间能够得到单一组分的梯度。Blondiaux等制备了两组分的烷硫醇梯度，构建一个完整的烷硫醇梯度；通过氧自由基梯度氧化，随后用饱和的另一组分取代，能够形成两组分的互补梯度。Ballav用一系列不同剂量的低能电子修饰单分子层，其与第二组分的交换过程速率取决于浸润过程中的辐照剂量。

基于印刷的方法也可以制备表面梯度。利用PDMS印章将饱和的波浪形烷硫醇转移至表面，制备得到不同外形的梯度。Geissler利用接触印刷在纳米尺度上得到了径向渐变的梯度。调控PDMS的厚度能够在密度最高的区域得到紧密结合的单分子层。喷墨打印的方法大大扩展了硫醇梯度的可控范围，从微纳米级增加到了厘米级别，在一种梯度形成的同时，可以回填另一种硫醇，得到互补梯度。

（二）自上而下（Top down）技术

自上而下技术主要用于在惰性表面引入活性位点，以便进一步功能化。对于没有活性基团的惰性表面，如聚乙烯（polyethylene，PE）、聚丙烯（polypropylene，PP）、聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）、聚酯（polyester）等，可使用高能量的等离子体、高能电子束、紫外线等对表面进行修饰（图4-5）。通过逐步改变曝光时间或发射源的能量值可以制备得到连续变化的梯度表面。这种方法中，化学成分的变化通常伴随着轻微的物理粗糙度的增加。

1.等离子体处理

等离子由高能量的粒子，包括电子、原子、离子、中性分子和自由基组成。通过这些粒子轰击基材时，会对其表面产生刻蚀。使用氮气、氨气、氧气、二氧化硫等气体可以在表面引入各种官能团，如氨基、羧基、羟基、磺酸基等基团。这些活性基团可以用来固定生物活性大分子或者进行表面的自由基聚合，制备复杂的梯度表面。Spijker等将样品置于等离子体处理装置中，在上方固定铝质掩膜来屏蔽等离子体，越靠近样品中心区域，等离子体越容易被遮挡，于是由内至外改性程度增加进而产生梯度。通过改变掩膜和样品之间的距离，可以方便地调节所产生的梯度斜率。Mangindaan等通过在样品上方2mm处固定掩膜制备得到了亲水性梯度变化的聚丙烯薄膜。相反地，使用含氟气体的等离子体处理则会使材料变得疏水。这个方法的优点是，它可以适用于任何聚合物材料，同时还可以通过选用不同的气体得到不同的基团。但是，电晕处理得到的表面通常比较粗糙且化学组分不规则。另外，活化的表面不稳定，长时间放置会失效。

2.电晕处理法

相较于等离子体技术，电晕处理是一种相对简单和廉价的技术，因为它不需要在真空中进行。Lee和他的同事是利用这一技术创建梯度表面的先驱者。他们将电极连接到一个无线电频率发生器上，然后将聚合物薄膜放置在电极下端。电晕处理后，聚合物表面产生碳自由基和过氧化物，并可进一步分解成极性的官能团，如羟基、醚、酮、醛、羧酸、羧酸酯等。逐渐增加电晕强度，同时通过电驱动器控制样品台的移动，活性基团密度会随着位置的改变而梯度变化。电晕处理还可以得到表面的亲水性也呈现梯度变化的材料。另外材料表面产生的自由基基团也可以用于引发表面接枝聚合。

3.紫外线辐照法

这种方法与电晕处理法类似，是将聚合物表面用紫外线照射，可通过光氧化反应机制在表面产生过氧基团。移动光掩膜可控制照射时间，也可直接用灰度梯度光掩膜得到过氧基团密度梯度变化的聚合物膜（图4-5）。这种方法反应步骤简单（仅需一步反应），而且反应条件较为温和。除此之外，也可以利用紫外光刻技术制备梯度材料。此技术的优点是通过使用不同的光掩膜，可以方便地调控梯度的形状。

4.化学刻蚀技术

这种方法通常用于降解聚酯等聚合物的主链和侧链。竺亚斌等建立了聚合物表面氨解技术，用于在聚酯材料上引入氨基基团。类似的还有碱解技术，即利用碱液改性聚酯材料，引入羧基基团。通过将聚合物膜逐渐抽离或浸入反应液，均可制备得到连续的梯度表面。谈华平等将聚（L-乳酸，PLLA）膜竖直固定于容器中，通过微量注射泵连续注入己二胺溶液，制备得到表面具有氨基梯度的PLLA膜，氨基密度从上到下连续增大。此外，这种技术也可应用于改变聚电解质多层膜的组成和结构，用来构建物理梯度。

（三）自下而上（Bottom up）技术

然而，自上而下技术通常只能应用于制备聚合物表面梯度，并且只能制备简单的梯度图案，不适于直接固定生物大分子（如ECM蛋白和生长因子等），因此无法满足调控细胞响应的复杂要求。而自下而上技术能更广泛地应用于表面改性和产生复杂而精细的梯度图案。通过调节引入的单元分子的接枝密度，链的长度和链柔性，可以使表面逐渐从亲水变为疏水，从柔软变为刚性，从阻抗细胞黏附变为促进细胞黏附。具体的方法见图4-6。

1.注射法

注射法通过逐步提高或者降低反应溶液的高度，使表面修饰上有机单层渐变图案。该方法简单方便，条件温和不需要特殊仪器。它可以制备各种毫米和厘米级的化学功能梯度。通过预设注射速度，梯度的位置直接对应反应时间。而且通过改变反应液的注射速度，可以调整梯度的斜率。接枝分子的密度由上至下线性增加，其底端由于反应时间最长，接枝密度最大。Yu等将正十二烷基硫醇[HS（CH₂）₁₁CH₃]缓慢加入容器中与竖直放置的金片反应，然后再与巯基十二醇[HS（CH₂）₁₀CH₂OH]反应，得到从超疏水渐变到超亲水的梯度表面。利用这种方法，梯度的斜率很容易调整，较高的注射速度可以制备更加陡峭的梯度。此外，还可以通过改变溶液的浓度和反应时间来调整梯度的斜率。进一步将制备得到的梯度均匀浸入另一种反应液，或者再次用注射法在相同的方向或相反的方向产生梯度，可以得到更加复杂的梯度图案。

2.微接触印刷技术

微接触印刷技术（microcontact printing，CP）是 Whitesides和他的同事们开发的一项技术，已被广泛用于建立多功能性和高精准性的纳米图案。最近，在原有的基础上发展了一系列的技术，如贴花转移印刻（decal transfer microlithography，DTM）、纳米转移印刻（nanotransfer printing，nTP）和金属转移印刻（metal transfer printing，MTP）等。Jeon等发现转移到基底上的十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS）的表面覆盖率随印章与基底接触时间的延长而增加。将半球形的硅橡胶（PDMS）的球面接触基底，并且在上方逐步施加压力使其变形，于是球面与基底的接触面积逐渐增加，从中心到边缘区域，接触时间缩短，转移到基底的硅烷形成密度连续变化的梯度。OTS密度梯度的长度由硅橡胶的曲率和半径决定。Kraus等结合扩散法和微接触印刷法制备化学梯度。溶液分子由于重力作用通过楔形块状的硅橡胶垂直扩散到底部，由于印章厚度的不均匀性导致沉积到表面的分子密度梯度变化。虽然微接触印刷技术可以制备复杂的梯度图案，但是它只限于二维平面。

3.微流体印刻技术

微流体印刻技术（microfluidic lithography，μFL）提供了一种简单通用的方法来制备生长因子、ECM蛋白、酶、药物等生物活性分子的梯度。此外，通过设计微流道系统可以改变梯度的斜率和形状（线性/非线性）。Gunawan等将层粘连蛋白和胶原蛋白溶液分别注射到两个注射入口中。当两种溶液通过复杂的微流道时它们不断混合和分离。在两端的流道中，由于原始的溶液没有经过混合，所包含的层粘连蛋白或胶原蛋白的浓度最高。最后，当溶液汇聚到出口处流出，形成两种蛋白的浓度梯度。微流体系统也可用于生成物理梯度。例如，通入氢氟酸溶液并最终汇聚到硅片基底上，刻蚀硅片表面，可制备粗糙度渐变的梯度。利用微流道系统制备单官能团单体和双官能团单体的方向浓度梯度，经过紫外线辐照后聚合，便可建立表面模量梯度。这种技术只限于制备二维的梯度，但它具有很多优点，如设备体积小、需要的溶液量少和能耗低等。而且由于它温和的条件和复杂精确的流道设计，特别适合创建多种生物分子组合的梯度表面。

4.电化学方法

电化学方法包括两个方面。一是利用等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）原理使带电分子在电场作用下形成浓度梯度，然后转移到所需的基底上。在电场中，电解质分子在溶液中沿着电场迁移。例如，带正电荷的聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）在靠近阴极的区域积累，并形成一个浓度梯度。将PDMS印章浸入梯度溶液中浸泡，取出后将梯度图案转移到基底膜上便可获得PLL的梯度。这种方法可以应用于聚电解质，包括蛋白质、多肽和多糖。通过调整电场强度和溶液pH可以改变分子的电荷性质，从而调整梯度的斜率。实验过程中浸泡印章这一步必须非常小心，避免扰动溶液中的浓度梯度。二是基于巯基的氧化还原反应发展的一项技术。通过施加外部电场，正、负两个电极间电化学电势能逐渐变化，利用硫醇在金表面特有的还原解附/氧化吸附反应，可以在空间上控制表面的硫醇浓度，即负极硫醇得到电子还原而发生解吸附，从而浓度降低，而往正极方向逐渐增加，形成梯度。同样，这种方法也可以简单地通过调整电压值来调控梯度的斜度和尺寸。