二、包载生长因子的水凝胶在各类疾病的研究与应用

（一）创伤、烧伤

整个创面愈合过程主要由生长因子调控，而在创面愈合过程中，外源性补充某些生长因子或通过外源性生长因子刺激内源性生长因子活性，可达到促进创面修复的作用。例如一些慢性难愈合创面之所以经久不愈，其主要原因是创面缺乏炎症反应，缺乏内源性生长因子的释放与生长刺激作用，同时组织修复细胞（上皮细胞、成纤维细胞）又处于一种休眠状态，当外源性应用血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等，可直接作用于组织修复细胞，启动修复过程。

EGF是目前临床上大量使用的促进伤口愈合、减轻瘢痕的基因工程药物，其含量增多有利于创面的牢固愈合，同时外用EGF对健康受试者或烧伤患者均具有较好的耐受性和安全性。Choi等制备具有黏合性和热响应性包裹重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）的水凝胶，水凝胶释放负载rhEGF的速率依赖于水凝胶的降解速率。将水凝胶用于动物的背部伤口并照射光，通过在伤口部位局部增加rhEGF的浓度以维持角质形成细胞的分化能力，从而促进创面愈合。Lao等开发了一种新的rhEGF水凝胶，在体外发现从水凝胶基质释放的rhEGF能保持其刺激BALB/c 3T3细胞系增殖的生物活性。糖尿病动物模型实验发现rhEGF水凝胶能明显缩小创面面积，与水凝胶基质相比，含rhEGF的水凝胶对于创面EGF受体表达有诱导的作用。体外释放和糖尿病动物模型实验发现，水凝胶作为一种对EGF的局部应用释放系统，具有长效和持续释放生物活性rhEGF的优点，并具有促进糖尿病创伤愈合的治疗潜力。

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）具有促进成纤维细胞增殖、刺激血管新生、参与神经再生、增加局部脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）合成等作用。其中，酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对组织的修复作用有一定差别。Ishihara等将bFGF包载于光交联壳聚糖水凝胶，实验发现bFGF在水凝胶中的活性长时间稳定（超过14天）。将合成水凝胶应用于愈合受损的糖尿病（db/db）老鼠中，发现具有生物活性的bFGF分子从水凝胶中的受控释放，诱导血管生成，促进创面愈合。Wu等开发了一种热敏感性肝素-泊洛沙姆（heparin-poloxamer，HP）水凝胶，用于加载和递送不同的生长因子（aFGF和bFGF），用于体内的伤口愈合。通过广泛的体内测试（包括伤口闭合率、肉芽形成、再上皮化、细胞增殖、胶原蛋白和血管生成表达），系统地评估比较了所得到的基于不同生长因子和是否含有HP凝胶材料对伤口愈合效率的影响，发现基于aFGF和bFGF的HP水凝胶拥有优越的愈合活性以改善伤口闭合，而基于aFGF的HP水凝胶敷料比基于bFGF的水凝胶敷料具有更高的愈合功效，这表明不同的FGF结构特性会导致其在HP凝胶中不同的结合和释放方式，从而影响伤口愈合效率。

VEGF通过与血管内皮细胞表面特异性受体结合发挥生物学效应，能够促进内皮细胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性。Yamaguchi等由低分子量肝素修饰的星形聚乙烯醇聚合物（PEG-LMWH）和二聚体重组人血管内皮细胞生长因子（rh-VEGF）制备了rhVEGF水凝胶，这种新型材料除具有常见水凝胶敷料的一般性质外，其特点还在于将rhVEGF二聚体作为水凝胶网络的交联点。存在于细胞膜的rhVEGF受体可以有选择地破坏水凝胶敷料中的交联点，使rhVEGF随着凝胶体系被破坏而逐渐得到释放。此研究结果证明生长因子与相应结合体联合作用可达缓释蛋白的目的，并为制备新型生长因子可控释放敷料提供了新思路。

（二）脊髓损伤

脊髓损伤（SCI）是一种骨科常见病症，是一种破坏性的疾病，可导致感觉和自主神经功能的突然丧失。目前的治疗包括减压手术、损伤稳定、继发性并发症的预防和康复。然而，神经系统的恢复是有限的，而各种生长因子在脊髓损伤中的应用潜力正日益突出。

2006年，Jain A的团队研究出一种原位成胶的琼脂糖水凝胶支架并将其作为脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的释放载体，用于成年大鼠的脊髓损伤模型。这种热可逆支架能够支持体内的三维神经轴突延伸，是药物运载的有效载体，用于持续地局部递送营养因子。研究表明，BDNF促进轴突生长入支架，对在支架与宿主脊髓交界处的阳性神经元和轴突、阳性星形胶质细胞和正硫酸软骨素蛋白多糖的定量分析表明，BDNF进一步降低琼脂糖凝胶在体内引起的最小炎症反应。这些热可逆支架具有很大的潜力，可以作为细胞生长的三维支架，并在损伤部位提供神经营养因子和潜在的抗瘢痕剂，促进脊髓损伤后的再生。

可降解水凝胶是运送生长因子促进疾病组织或受损组织再生的有效工具。神经营养因子的传递在中枢神经系统的组织修复中有很大的潜力，特别是对脊髓损伤的治疗。在2006年Burdick JA团队的这项工作中，通过光引发聚合合成的基于聚乙二醇（PEG）水凝胶来研究神经营养因子（neurotrophins）的传递。通过改变网络交联密度来控制神经营养因子的释放，从而影响神经营养因子的扩散和从几星期到几个月的总释放时间。其中一种神经营养因子——睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）的释放及活性，是通过细胞增殖实验和检测从视网膜外植体长出的神经突来评估的。相比无睫状神经营养因子的对照组，从可降解水凝胶中释放的CNTF能显著刺激更多的神经突生长。

星形胶质细胞在脊髓损伤中起双重作用，既可作为轴突生长的抑制屏障，又可作为营养支持。因此，将这些细胞移到缺损中，而不是使之在外围形成瘢痕，可以促进病变的轴突再生，需要使用生物材料支架促进星形胶质细胞的迁移。Macaya等在2013年研究了京尼平共价交联的可注射的以胶原为基质的水凝胶，将成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）以自由形式包载入内或封装在脂类微管（lipid microtubules，LMTS）中再进行包载。FGF-2显著增加了星形胶质细胞的数量和它们在凝胶的迁移距离，并导致它们以一种连锁模式迁出水凝胶。相对于非交联水凝胶的对照组，京尼平交联的胶原水凝胶降低星形胶质细胞浸润的数量；然而，封装在LMTS中的FGF-2恢复了胶质细胞的渗透水平，使之接近非交联的水凝胶。总体来说，包载了FGF-2-LMTS的可注射的胶原交联水凝胶是一种很有前景的材料，通过将星形胶质细胞吸引到移植物中为脊髓损伤的治疗提供新的思路。

科研团队对开发临床治疗药物持续低水平释放的新方法非常感兴趣。MAX8是基于肽的β发夹的水凝胶，具有独特的剪切稀释性，去除剪切力后能够立即修复，使MAX8成为在局部损伤部位注射给药的一个很好的载体。2015年，Lindsey的团队研究利用MAX8水凝胶作为神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和 BDNF 输送系统，这两种神经营养生长因子目前都被应用于脊髓损伤的实验性治疗。实验发现，MAX8水凝胶包载NGF和BDNF后并没有影响凝胶的形成或修复，剪切稀化并没有导致生长因子立即释放。实验证明这种水凝胶为生长因子提供了保护性的环境，使它们至少28天内并未发生体外降解。NGF和BDNF的缓释能够引发PC12神经细胞发生神经突样的扩展，这可能是通过NGF/BDNF信号通路导致的。更重要的是，通过调节MAX8水凝胶浓度，可以调整生长因子的释放曲线。可能是由于应用剪切力维持了在结构域内对生长因子的有效捕获，水凝胶的初始剪切稀释（如注射时）不会导致封装在其内的生长因子过早释放。在此研究中，MAX8水凝胶表现出优异的允许更大剂量荷载和持续治疗性生长因子释放以及潜在的减轻副作用和改善现有疗法的能力。

神经生长因子（NGF）在脊髓损伤治疗中具有良好的应用前景，但其物理化学稳定性较差，通过血脊髓屏障的能力较差。2016年温州医科大学药学院的赵应征团队开展了新型肝素-泊洛沙姆（HP）温敏水凝胶的构建，提高神经生长因子在脊髓损伤再生中的效果。基于NGF的HP水凝胶具有良好的形态和稳定的NGF体外生物活性。基于NGF的HP水凝胶联合治疗显著增强NGF的细胞摄取效率，无明显细胞毒性。在基于NGF的HP水凝胶组观察到它能显著改善脊髓损伤大鼠的神经功能和组织形态，对极端粉碎性大鼠脊髓损伤模型的神经胶质瘢痕的形成有明显的抑制作用。基于NGF的HP的保护作用是抑制慢性内质网应激诱导的细胞凋亡。在脊髓损伤大鼠实验中，HP水凝胶与原位注射技术在实验组中表现出较好的神经保护作用。这种新的组合技术将为脊髓损伤再生提供有效的策略。

将接种了细胞的藻酸盐水凝胶移植到脊髓损伤部位，可提供轴突桥，并物理性地引导再生轴突以直线方式生长。然而，没有额外的生长刺激，桥接轴突不能延伸到远端的宿主脊髓。2017年Liu及其团队研究了一个联合方法，在大鼠脊髓颈椎（C₅）半横断损伤支持下行轴突再生。脊髓横断后，将接种了施万细胞（Schwaan cell，SC）的海藻酸钠水凝胶植入病变部位，并从大鼠尾静脉注射能够表达脑源性神经生长因子（BDNF）的5型腺相关病毒（adeno-associated virus 5，AAV5）。 此外，还研究了尾侧脊髓实质内注射施万细胞是否能进一步增强轴突的再生，使之重新进入宿主脊髓。数据表明，含血清素的下行轴突在生物素葡聚糖胺（biotin dextran amine，BDA）的追踪下，延伸到了整个支架。当尾部BDNF表达激活时，再生轴突的数量显著增加，短暂的BDNF递送在基因表达关闭后能够维持轴突生长。下行轴突限于尾部支架和宿主的交界处，BDNF甚至连续表达长达8周。只有通过尾静脉注射施万细胞，才有可能通过支架和宿主的交界处促进轴突再生，使轴突成功地进入尾侧脊髓。

（三）脑损伤

在脑损伤中，能够在中枢神经系统（CNS）中提供持续、定点分子传递的生物材料载体具有治疗和应用研究的潜力。2012年，Song B等提出用一种双嵌段共聚水凝胶（DCH）作为蛋白质效应分子的持续局部释放库。研究中测试了两种DCH，先前的研究显示，K（180）L（20）和 E（180）L（20）自组装成具有生物相容性、生物可降解性的释放库，在小鼠前脑注射后能维持4～8周。为了评价体内的生物活性蛋白传递，测量了小鼠前脑胆碱能神经元的大小，因为其能够对NGF表现出细胞肥大的反应。在体内试验中，对水凝胶的储存模量进行了调整，使其低于中枢神经系统组织的储存模量。与在缓冲液中注入的NGF相比，溶解在K（180）L（20）或 E（180）L（20）中的 NGF能显著延长 NGF的生物活性，维持至少4周的局部前脑胆碱能神经元肥大，并诱导离注射部位更远距离（最多5mm）的神经元肥大。这些结果表明，在中枢神经系统内注入这种水凝胶药物可以在血-脑屏障内持续提供生物活性蛋白生长因子。

向脑组织输送药物是具有挑战性的，因为全身给药需要采用高剂量以实现血-脑屏障的扩散，并且易导致全身毒性。通过侧脑室注射一个微泵/导管系统可完成局部递送，但会导致脑组织损伤，容易出现感染。另一种局部递送方法——EPI皮质传递，直接释放生物分子到大脑而引起组织的破坏程度最小。Wang Y的研究团队在2012年用透明质酸/甲基纤维素 （hyaluronan/methyl cellulose，HAMC）水凝胶EPI皮质传递，实现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的局部释放，诱导室管膜下区（subventricular zone，SVZ）的内源性神经干细胞和祖细胞，促进小鼠脑卒中损伤后修复。研究发现，通过侧脑室注射EPO能促进神经形成，因此EPO能够成为测试这种新的EPI皮质传递策略的一个理想生物分子。他们研究了在脑卒中损伤神经修复中HAMC水凝胶的宿主组织免疫反应和EPO的药物释放，发现HAMC水凝胶释放的EPO在卒中后4天和11天减轻了炎症反应，减小了卒中腔的尺寸，增加了梗死周围区神经元的数量，并促进了成神经细胞在室管膜下区的迁移，并使室管膜下区和损伤皮质的细胞凋亡减少。EPI皮质传递介导的HAMC水凝胶应用，是EPO向大脑递送的一种很有前景的微创治疗方法。

疾病和损伤后的大脑修复非常困难，因为招募和动员干细胞到病变区域很困难。更重要的是，缺乏结构和营养支持来维持有限的干/祖细胞存在。2014年的一项研究探讨可注射的明胶水凝胶吸引室管膜下区（SVZ）的神经祖细胞向移植水凝胶移动。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-line-derived neurotrophic factor，GDNF）包裹在水凝胶内，水凝胶内的空隙阻止胶质瘢痕形成。直接将水凝胶植入室管膜下区，成神经细胞可以迁移入水凝胶中。在植入水凝胶7天后，由于GDNF的作用，水凝胶周围的双皮质素（doublecortin，DCX）阳性的成神经细胞与病变的对照组相比明显增多。21天后，在水凝胶周围没有观察到成神经细胞，说明神经细胞迁移已经停止了，成神经细胞成熟了或没有存活。可注射的明胶水凝胶的研制对某些神经变性疾病和脑损伤的治疗有重要意义。GDNF和水凝胶的孔隙能有效防止胶质瘢痕形成，使植入物与周围神经组织之间更好地融合和相互作用。

干细胞结合生物可降解的可注射支架释放生长因子在再生医学，尤其是神经系统疾病的治疗方面有很大的应用前景。在2017年Kandalam的一项研究中，结合人类骨髓中分离出的成人多向诱导（multilineage-inducible，MIAMI）干细胞和药理活性微载体（pharmacologically active microcarriers，PAMS），合成可注射的无毒硅烷化羟丙基甲基纤维素（silanized-hydroxypropyl methylcellulose，Si-HPMC）水凝胶，获得一种可注射的无毒的细胞和生长因子递送系统。它直接指示移植细胞的存活和/或神经元分化，将它们安全移植到中枢神经系统，并增强它们的组织修复性能。用一种模型蛋白来优化脑源性神经营养因子（BDNF）的纳米沉淀条件后，将DNF的纳米沉淀包载入纤维连接蛋白（FN）涂料的PAMS水凝胶中。体外释放实验表明，在该凝胶中BDNF表现出一种延长的、双相的释放且不产生突释效应。研究表明，PAMS和Si-HPMC水凝胶在1周后增加了MIAMI细胞神经分化标记物的表达。此外，3D环境（PAMS或水凝胶）促进了MIAMI细胞分泌生长因子和趋化因子。这些结果表明，PAMS结合Si-HPMC水凝胶传递BDNF在神经系统疾病中是一种新的局部传递工具，它不仅提供了有神经保护作用的BDNF，还提供了骨髓干细胞。这为神经系统的血管新生、神经保护和轴突生长促进系统的研究发展提供了初步证据。

对于神经修复的神经装置来说，由于插入装置时不可避免的神经损伤和宿主细胞异物排斥反应形成的致密鞘都会导致装置性能下降，因此为了确保神经假体的长期性能，可能需要局部药理干预。2009年Jhaveri SJ的研究认为神经营养因子的局部给药，能提高神经元的存活和促进神经元向装置电极生长，从而提供改进的电极神经通信和设备性能来记录和刺激中枢神经系统的活动。在这项研究中，开发了三种不同类型的聚甲基丙烯酸羟乙酯[poly（2-hydroxyethyl methacrylate），PHEMA]水凝胶，并评估了它们的存储容量和神经营养因子、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的释放率。此外，开发出了一种使用不同的PHEMA水凝胶常规涂层的微型神经义肢装置。用背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元原代培养对来自水凝胶的神经生长因子的生物学反应进行了测定。神经元生长过程被用来评估释放NGF的生物学反应。研究表明，PHEMA水凝胶涂料可用于神经装置，符合大脑局部神经营养因子传递的需要。

（四）其他系统疾病

括约肌或其支持神经和血管损伤会导致压力性尿失禁。2013年Liu的团队研究出过度表达VEGF的尿源性干细胞（urine-derived stem cells，USC）并将其包载入Ⅰ型胶原水凝胶内，体内植入后发现该材料具有一定的促进血管生成、细胞存活、细胞生长、移植细胞的骨骼肌表型分化和神经支配的作用。USC用含有人VEGF165和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的腺病毒转染。 将 USC-GFP、USC-VEGF-GFP、USC-VEGFGFP与内皮细胞、表达GFP的人体骨骼肌细胞（作为对照）分别加入胶原水凝胶中并注射入裸鼠皮下。实验观察发现与 USC-GFP组相比，USCVEGF-GFP组表现出更广泛的血管生成和更多的植入细胞存活，且表达内皮标记物、肌源性标记物的细胞和表达了神经标记物的再生神经纤维也明显增加。表达VEGF的USC通过促进血管生成从而提高了移植细胞的存活率，促进了USC的骨骼肌表型分化和再神经支配。这种方法对细胞疗法治疗压力性尿失禁的发展具有重要的临床意义。

在骨组织再生领域，2007年Kim及其团队将丙烯酸酯化的透明质酸（hyaluronan，HA）水凝胶作为骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）与人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的支架，研究其对大鼠颅骨缺损再生的作用。骨髓间充质干细胞和/或BMP-2在成胶过程中加入水凝胶。与对照组相比，加入BMP-2水凝胶中的细胞存活率提高了55%。活体颅骨缺损再生的实验中，设立了五个不同的组别（即对照组、水凝胶组、水凝胶与BMP-2组、水凝胶与MSC组、水凝胶与BMP-2和MSC组），植入4周后组织学结果表明，与其他组相比，含有BMP-2和MSC的水凝胶具有最高的骨钙素表达量，促进干细胞向成骨细胞分化和新生血管生成。本研究表明HA水凝胶可用于组织再生的细胞和生长因子载体。

缺血性外周动脉疾病中，EPO作为一种有效的血管生成因子能够减轻缺血器官损伤，但它的应用受到不良的全身红斑效应和血浆半衰期短的限制。2009年，Li将EPO浸泡的明胶凝胶微球（gelatin hydrogel microspheres，GHM）肌内注射到股动脉结扎的大鼠后肢，结果表明凝胶微球会不断释放少量EPO，局部刺激血管生成，并没有产生严重的不良反应。8周后，与其他组相比，EPO-GHM组缺血肢体的血液灌流获得明显改善。血红蛋白水平没有增加，内皮祖细胞也没有增加。然而，毛细血管和小动脉密度显著增加。虽然治疗不影响血管内皮生长因子或白介素-1的水平，但是它上调了EPO受体和基质金属蛋白酶-2，激活了下游信号蛋白激酶（Akt）通路和内皮型一氧化氮合酶，这可能与这种水凝胶明显的血管新生和动脉性效应有关。这种药物输送系统有望成为一种新的无创性治疗缺血性外周动脉疾病的药物。

血管闭塞性疾病的治疗中，各种促进侧支血管生长发育的生长因子被认为是理想药物。然而，一个有效的递送系统尚未建立。2004年，Hosaka设计了一个方法，用酸性凝胶微球（acidic gelatin hydrogel microsphere，AGHM）结合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来增强侧支血管的功能，研究了动脉内应用bFGF-AGHM，被释放的bFGF可以被留在远端小口径血管，通过动脉形成的过程，诱导功能性侧支血管，保证血液供应。