二、复合小分子化合物生物材料在骨修复再生中的应用

骨具有再生能力。随着年龄增长，骨量减少，脆性骨折和骨质疏松症（OP）的发生增加。另外，年龄相关的细胞改变，成骨细胞介导的异常骨形成和破骨细胞介导的骨吸收，骨髓脂肪化以及成骨祖细胞的减少，都将影响创伤后的骨修复。另外，在创伤、肿瘤消融和先天性骨异常等造成的大量骨缺损中，还需要治疗干预以指导再生和促进骨修复。自体骨移植被认为是骨缺损治疗的金标准。不幸的是，自体移植的骨组织来源有限，修复效率低并伴有术后综合征。同时异体移植和异种移植存在疾病传播和免疫排斥的风险。因此，组织工程技术是潜在的骨骼修复的重要手段。

小分子化合物为基础的组织工程在骨骼肌修复和再生中发挥重要作用。由于高通量筛选技术的进步，在过去的十年中已经发现了一百多种成骨小分子化合物。在这些成骨小分子化合物中，许多可能成为促进骨修复的新生代药物。它们的成骨活性已经在各种临床前动物模型中被证实。一方面通过小分子化合物诱导能够获得靶细胞，用于细胞移植；另一方面可以通过载体直接用于损伤局部，活化骨组织自身修复潜能，促进骨的原位再生。目前将这些小分子化合物与生物材料一起应用，能够更好地发挥促进骨再生作用。

骨修复相关的小分子化合物复合生物材料

1.嘌吗啡胺（purmorphamine）

嘌吗啡胺是一种2，6，9-三取代嘌呤，是具有促进骨修复功能的小分子化合物，具有比BMP-4更有效的诱导成骨的效果。有趣的是，即使高达20μM的嘌吗啡胺浓度，也没有观察到显著的细胞毒性。嘌吗啡胺刺激的小鼠胚胎来源成纤维细胞C3H10T1/2，碱性磷酸酶（ALP）活性显著增加近50倍，成骨分化相关基因，如核结合因子α1（Cbfa1/Runx2）明显上调。在分化过程中，嘌吗啡胺通过激活Hh信号通路诱导成骨，并调节其下游靶基因，如Gli1和Patch。另外，嘌吗啡胺能够活化人（hMSC）Hh途径，在体内、外增加下游靶基因（如Smo、Ptch1、Gli1和Gli2）的表达。

目前，已有骨修复相关负载嘌吗啡胺的载体。Belotiet等以3μmol/L的嘌吗啡胺处理纯钛表面，接种到该材料中的hMSC其成骨细胞相关基质合成明显上调，并有骨样结节形成。另外，磷酸三钙和咯嘌呤胺（0.01和0.1wt%）的复合骨粘合剂负载嘌吗啡胺后形成的生物材料不具有细胞毒性，持续释放嘌吗啡胺，并显著上调Gli表达，从而促进骨再生。

2.氧化型胆固醇（oxysterols）

氧化型胆固醇是在动物和植物中丰富的胆固醇和植物甾醇的氧化产物。它们能够调控细胞分化方向，例如它们能促进干细胞成骨分化，同时抑制脂肪方向分化。M2-10B4小鼠来源间充质干细胞（MSC）在短期暴露于氧化型胆固醇后，能够显著增加ALP活性和诱导矿化作用。长时间氧化型胆固醇诱导可明显提高MSC成骨基因骨钙素（OCN）和成骨细胞分化相关的关键转录因子Runx2的表达。Amantea等证实氧化型胆固醇通过非经典Wnt途径调节Dickkopf相关蛋白1（Dkk-1）诱导骨生成。此外，Hh通路蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶A（PKA）依赖性机制，可能也参与了氧化型胆固醇诱导的骨形成。

氧化型胆固醇可与生物材料联合用于骨修复。负载有氧化型胆固醇混合物的多孔PLGA支架被植入骨缺损部位，具有显著促进骨形成及再生效应。另外，负载氧化型胆固醇的生物可降解水凝胶支架植入大鼠颅骨缺损后，能够诱导体内骨再生。近来，对于氧化型胆固醇类似物的合成进行了大量研究，并制备出一系列具有高诱导效力的新型氧化型胆固醇，可显著增加氧化型胆固醇药物家族的成骨效力。

3.他汀类药物

他汀类药物也被称为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，能够抑制HMG-CoA向甲羟戊酸的转化，因此被广泛用作降胆固醇药物。然而，根据许多报道，他汀类药物还可诱导干细胞的体内、外成骨分化。研究显示他汀类药物美维诺林（mevinolin）促进了小鼠骨髓 MSC克隆的 D1细胞中 OCN、CD44、CD47和CD51的表达，并增强ALP活性。辛伐他汀能够直接诱导鼠ESC分化为成骨细胞，成骨标志物如Ⅰ型胶原蛋白（Colla1）、Runx2、成骨相关转录因子（OSX）和骨钙素（OCN）的表达明显增加。值得注意的是，辛伐他汀的效果具有剂量依赖性，在高浓度情况下会产生严重副作用。此外，研究表明，其他他汀类药物，如康帕丁也可促进干细胞成骨效应，明显增加BMP-2、骨保护素（OPG）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，同时抑制向脂肪细胞分化。

基于他汀类药物溶解度的不同（脂溶性或水溶性），需要不同的药物载体系统，以水凝胶载药系统最为常见。Benoit等通过合成氟伐他汀释放单体，然后将这些大分子结合到PEG水凝胶。研究人员利用释放氟伐他汀的水凝胶载体系统，成功地将hMSC诱导为成骨细胞。另有研究显示，可生物降解的明胶水凝胶可以用于控制释放辛伐他汀促进骨再生。最近，一种基于PEG的辛伐他汀前药（SIM-mPEG）装置被研制出来，它能够自组装成胶束并包裹游离辛伐他汀包封成SIM/SIMmPEG胶束。SIM/SIM-mPEG胶束将被周围的炎性细胞和其他细胞摄取，并释放辛伐他汀，从而促进骨骼愈合。另外，可生物降解的聚氨酯载药系统复合多种他汀类药物后被证实均具有增强骨再生效果。因此，他汀类药物是一种极具前景的治疗骨缺损及骨质流失疾病的小分子药物。

4.地塞米松（DEX）

DEX是一种合成的糖皮质激素，对诱导干细胞的成骨分化具有时间和剂量依赖性。据报道，DEX能够协同Runx2/Cbfa1促进干细胞成骨分化，并通过调节丝氨酸残基（Ser125）的磷酸化，对Runx2发挥负调控作用。由于其诱导干细胞成骨作用，DEX是大多数成骨介质中不可或缺的添加剂。

近年来，已有关于复合DEX的生物材料诱导干细胞成骨分化方面的研究报道。Nuttelman等制备PEG-水凝胶支架可以持续释放DEX，其成功地将包裹的hMSC分化为成骨细胞。另外，应用DEX加载的羧甲基壳聚糖/聚（酰氨基胺）树状大分子NP与羟基磷灰石（HA）和淀粉-聚己酸内酯（PCL）复合的3D支架，能够在体外分化大鼠MSC为成骨细胞。另外，DEX/抗坏血酸-2-磷酸/β-甘油磷酸盐负载的微球支架有效延缓成骨分化因子释放，并成功地诱导支架上生长的干细胞分化为成骨细胞。

5.白藜芦醇

白藜芦醇是一种可食用的多酚二苯乙烯植物雌激素，最初是从葡萄皮和药草中获得。它在降低低密度脂蛋白（LDL氧化）和抑制血小板聚集等方面起着重要作用。白藜芦醇在促进干细胞成骨分化和预防骨质疏松方面发挥重要作用。白藜芦醇提高干细胞ALP活性和成骨细胞分化相关基因的表达。此外，它还活化雌激素信号通路，通过沉默调节蛋白1/叉头框蛋白3α（Sirt1/Foxo3a）轴增强hMSC的成骨分化，增加成骨基因如Runx2和OCN的表达水平。此外，Shakibaei等提出成骨转录分子Runx2的乙酰化/去乙酰化水平在hMSC的成骨过程中起关键作用，研究显示Runx2乙酰化降低Sirt-1表达。此外，据报道白藜芦醇还可以通过活化Wnt信号通路，促进成骨。

因为白藜芦醇可显著增强未分化细胞的成骨分化，它已被用于促进骨形成，治疗骨关节炎，并可用于在植入组织工程支架前的预处理。Kamath等将白藜芦醇负载到白蛋白纳米粒（RNP）后，进一步封装在PCL-RNP复合支架中。该体系既可以持续释放白藜芦醇，也能够促进hMSC分化为成骨细胞。

6.生物类黄酮

生物类黄酮（如槲皮素、染料木黄酮和淫羊藿苷）、吡喃酮衍生物具有抗氧化剂和抗微生物等特性。类黄酮还能抑制骨吸收和促进干细胞的成骨分化。在黄酮类化合物中，淫羊藿苷是在传统中药淫羊藿（epimedii）中提取，已被深入研究。淫羊藿苷（icariin）被证实能够以剂量依赖的方式促进人和大鼠MSC的成骨分化，ALP活性和Runx 2表达水平的显著升高。此外，淫羊藿苷还通过激活BMP信号来诱导BMP-4的产生。最近又有研究表明淫羊藿苷通过雌激素受体途径激活细胞外调节蛋白激酶（ERK）和Jun氨基末端激酶（JNK）促进细胞分化为骨细胞。另外，淫羊藿苷能诱导骨保护素（OPG）的产生和破骨细胞的凋亡，从而保护骨免于被吸收。总之，淫羊藿苷是促进骨修复和再生潜力的小分子化合物，它不仅促进干细胞成骨，而且还诱导OPG的产生，与RANKL结合从而抑制破骨细胞分化。

淫羊藿苷用于骨修复已经引起越来越多的关注，近年来已经开发出一系列的载体系统。载有淫羊藿苷的壳聚糖/HA支架表现出很好的骨诱导性和缓释性，增强体外hMSC的成骨分化并促进体内长时间骨缺损的修复。聚羟基丁酸戊酸酯（PHBV）支架也已经用于淫羊藿苷的载体。这些多孔支架持续释放淫羊藿苷，研究证实0.1%淫羊藿苷支架能够有效改善成骨细胞的成骨性。

7.褪黑素

褪黑素也被称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，由松果体分泌，是关乎睡眠质量的重要激素。它在癌症治疗、抗衰老和调节昼夜节律方面发挥重要作用。褪黑激素通过MT2受体和BMP/ERK/Wnt通路诱导细胞成骨分化，显著增加ALP活性和上调成骨细胞相关标志物的表达，如Runx2、OCN、骨涎蛋白（BSP）和 BMP-2。 目前有包裹褪黑素的PLGA微球，该微球能够持续释放褪黑激素，并大大增强了MSC的成骨效应。此外，高生物相容性的铝酸钙-褪黑素支架也被证实有助于促进hMSC的体外成骨及体内促进缺损颅骨的再生。

8.双膦酸盐（BP）

BP具有 P-C-P骨架结构，广泛用于代谢性骨疾病的治疗，并抑制骨吸收。同时它能够诱导破骨细胞凋亡，其结构特点使它们能够与钙晶体结合。BP能够促进干细胞的成骨分化。含氮的BP阿仑膦酸盐上调成骨相关标志物的表达水平，如BSP、OPN和BMP-2，并且以剂量依赖性的方式增加ALP活性。阿仑膦酸钠通过磷酸化ERK和 JNK来发挥作用。氯膦酸盐（clodronate）是另一种类型的BP，直接促进ST2细胞（多能间充质细胞系）成骨分化，可能与蛋白酪氨酸磷酸酶和/或丝氨酸/苏氨酸磷酸酶失活有关。另外，BP可以刺激成骨样细胞产生OPG，从而保护骨吸收和预防骨质疏松症。

近几年来，许多研究都集中在发展支架/微球包裹BP的控释系统来诱导干细胞的成骨分化。在各种类型的BP中，阿仑膦酸钠诱导成骨效率最高，所以人们对其最为关注。按照所需生物材料的不同，目前载体系统分为三种类型。第一种载体系统是由无机材料组成，主要包括HA、介孔二氧化硅（MS）和磷酸钙。第二种递送系统主要由生物聚合物组成，如 PCL、PLGA、PHBV和壳聚糖。这些生物聚合物通常被设计成微球体、多孔微球体或水凝胶，可以通过物理和化学相互作用加载药物。第三种载体是生物聚合物的复合物和无机材料。该载体系统的药物装载体系和机械性能均具有可调节性。MS-HA/PLGA或HA/PLGA复合支架能够持续释放阿仑膦酸钠，并成功诱导滑膜MSC向成骨细胞体外分化（SMSC）。体内研究显示负载阿仑膦酸盐的PLGA支架能够显著改善颅骨缺损。

9.其他

除上述提到的小分子化合物，还有很多小化学物质能够促进干细胞成骨分化。1，25-二羟基维生素 D[1，25（OH）₂D]是维生素D的代谢产物，能够促进未分化细胞向成骨细胞谱系分化，并且能与TGF-β发挥协同作用。维生素D衍生物处理细胞后，成骨相关标志物，如 BMP-2、BMP-6、Runx2/Cbfa1和 OSX，显著上调，最终诱导未分化细胞分化为成骨细胞。雌激素，又叫17β-雌二醇，通过提高ALP活性增强骨生成，以剂量依赖的方式促进BMP-2、OCN和Cbfa1的表达。该过程由雌激素受体（ER），特别是ERα介导。视黄酸（RA）也能够以剂量依赖的方式诱导成人脂肪来源MSC成骨分化，增加BMP受体亚型ⅠB的水平，它在干细胞向成骨细胞的分化中起关键作用，提高Runx2、OPN和OCN的表达。此外，水杨酰亚胺-2-苯硫酚，治疗发热和风湿性疾病，能够通过激活MAPK途径促进hMSC的骨化。

总之，小分子化合物可以通过活化成骨相关信号通路，包括 Hh、Wnt、MAPK、BMP、AMPK 来控制干细胞成骨分化方向，调节成骨相关靶基因，最终促进骨修复及再生。因此，负载小分子化合物的组织工程技术是未来治疗骨疾病的有效措施。