四、自组装多肽生物材料在再生医学中的应用

自组装多肽水凝胶已用于多种组织损伤的再生修复研究，在减少组织损伤后细胞凋亡、促进组织功能的恢复等方面均显示了一定的效果，尤其是针对不同组织特异性添加了功能片段后，仿生功能自组装多肽展示了更加明显的介导组织再生作用。另外，自组装多肽材料复合细胞或其他材料的使用，发挥多种成分的协同作用，是提高组织再生效果，实现组织或器官功能替代的努力方向（图11-3）。

1.自组装多肽在皮肤及其附属器官再生中的应用

皮肤是身体最大的器官，因暴露在体表而极易受到损伤。2008年，Aurore Schneider等人利用纳米生物技术通过结合自组装多肽水凝胶纳米纤维支架和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）来提高伤口的上皮化的速度。该研究中所应用的自组装多肽水凝胶为常见的RADA16-Ⅰ，所用的皮肤模型为人工制备的人皮肤替代物（bioengineered human skin equivalent，HSE），这种组织模型具有许多人类皮肤的形态和表型特性，能够用于检测伤口的再上皮化情况。将HSE制作成一个全层深度的伤口后，伤口边缘的上皮细胞经过一系列的调控，能够使伤口再上皮化。研究人员在这种HSE伤口表面滴加RADA16-Ⅰ溶液，在不到30分钟的时间内，RADA16-Ⅰ溶液迅速自组装形成水凝胶，完全填充伤口，并覆盖伤口表面。RADA16-Ⅰ经历了自组装，形成了独特的三维结构，稳定地覆盖在伤口表面，表明这种材料可以作为一种伤口敷料。自组装多肽水凝胶支架模拟了ECM的结构和孔隙度，生长因子和营养物质可以缓慢、自由地扩散到支架内。于是有研究将EGF包裹在自组装多肽水凝胶中（SAP-EGF），来提升其对伤口愈合的速率。SAP-EGF在磷酸缓冲液（PBS，一种含磷酸盐的生理盐水）中48小时的EGF释放曲线显示，EGF仍然存在于SAP支架材料中，并且在与PBS的孵育过程中没有被释放出来。而当SAP-EGF与伤口接触时，EGF才会从水凝胶中释放出来。通过测量伤口上皮化过程中上皮层伸展的长度，研究人员发现，含有EGF的自组装多肽可以使伤口的覆盖率提高5倍，比不使用EGF的SAP要高出3.5倍。而由SAP-EGF引起的伤口快速上皮化主要是由于EGF促进了上皮细胞的增殖。这些结果表明，这种自组装多肽水凝胶具有许多适合于皮肤伤口治疗的特性，包括伤口覆盖、生物材料的功能化、局部生长因子的释放等，可以加速伤口的上皮化，促进伤口愈合，有望发展成为一种有效的促伤口愈合制剂。

上述研究结果是基于体外模型，科学家们利用鼠的烧伤模型对其功能进行了更深入的研究。

烧伤是世界上第四常见的创伤，Ⅲ度烧伤是皮肤最严重的损伤之一。每年有数以百万计的人因热水、火焰和热油而遭受严重残疾甚至死亡的危险。尽管随着医疗水平的不断进步和创伤后护理水平的提升，烧伤患者的存活率和恢复率也有所提高，但是对于严重烧伤患者来说，恢复过程是漫长的，同时还伴随着感染的风险，甚至会引起死亡。烧伤包扎在伤口愈合过程中起着至关重要的作用，伤口愈合的各个阶段都需要提供一个最佳的微环境，才能达到满意的组织修复。烧伤伤口与切除的伤口不同，在烧伤的伤口上，伤口在损伤后会进一步扩大，周围组织继续坏死，导致伤口再上皮化减慢和产生过多的液体渗出物，从而导致烧伤伤口水肿。因此，抑制坏死和炎症应该是烧伤伤口敷料的重要功能。即使在理想的条件下，伤口的愈合也会伴随着瘢痕组织的形成，并且可能会损害愈合组织的外观和功能。此外，由于凝血区产生的氧化和炎症压力，烧伤的伤口与撕裂和钝伤相比有更高的坏死风险。因此，如果烧伤不及时恰当地处理，会导致损伤区域附近的正常组织转化为坏死组织，增加伤口的深度和范围。严重烧伤损伤也会产生快速而强烈的系统免疫反应，毛细血管通透性增加，蛋白质漏入组织间隙，以及免疫细胞大量表达促炎症因子等，可导致休克。因此，需要研发新的技术来解决烧伤损伤的独特的病理生理需求，即组织的快速修复、瘢痕的最小化以及功能的重建和美观的重现。

虽然许多伤口敷料已经应用于临床实践，但很少有伤口敷料能完全满足伤口愈合要求。例如，多年来，网状的棉纱布敷料已被有效地应用于渗出物严重和坏死的伤口，但是这种敷料缺乏促进伤口愈合的作用。天然的多糖伤口敷料，如右旋糖酐、海藻酸钙和甲壳素，以及合成的伤口敷料，如聚氧乙烯敷料和硅胶敷料，在炎症和清创的阶段有一定作用，但对上皮组织和肉芽组织的形成没有什么帮助。胶原蛋白和猪小肠黏膜下层组织材料具有显著增加上皮化速率的作用；然而，它们的潜在抗原性极大地限制了其临床应用。理想的敷料应能够防止感染，维持皮肤水分，清洁伤口，并为组织再生提供适宜的微环境。而仿生的自组装多肽水凝胶在这些方面拥有很好的应用前景。

四川大学的赵晓军团队利用大鼠烧伤模型对RADA16-Ⅰ在皮肤烧伤伤口方面的应用进行了研究，并与常用的敷料：壳聚糖、PLA和Ⅰ型胶原蛋白等进行了比较分析。与其他敷料相比，在所有伤口愈合阶段，RADA16-Ⅰ治疗的伤口愈合率明显提高。在受伤3小时后，观察到RADA16-Ⅰ治疗组没有明显的水疱出现，而壳聚糖治疗组中，伤口处有水疱产生。RADA16-Ⅰ治疗的伤口结痂在第5天开始，第17天脱落。壳聚糖处理过的伤口结痂在第8天开始，第22天脱落，延迟了3～5天。这说明RADA16-Ⅰ可以加速伤口愈合。RADA16-Ⅰ治疗组的平均伤口愈合率总是比其他组（壳聚糖、PLA、胶原蛋白和空白组）高10%～30%，在受伤后的第21天愈合率几乎达到80%，而其他治疗组只有45%～60%（P<0.05）。在伤口愈合的第50天，与壳聚糖相比，RADA16-Ⅰ治疗的伤口处再生了更多的毛发。这表示自组装的RADA16-Ⅰ多肽水凝胶伤口敷料可以减少组织坏死，促进上皮化和肉芽组织的形成，进而更有效地促进伤口愈合。

2014年，Yihua Loo等利用超短肽（小于7个氨基酸）自组装成的水凝胶治疗大鼠的烧伤，取得不错的效果。这项研究选择的两个超短肽都含有赖氨酸（Ac-ILVAGK-NH₂和 Ac-LIVAGK-NH₂），它可以促进开放性伤口的止血。赖氨酸的类似物和衍生物，如ε-氨基苯丙酸和环己酸是抗纤溶剂，可以通过竞争性抑制蛋白水解酶活性来防止血液流失，从而防止血凝块的分解。组织坏死过程中，细胞释放的核酸能激发免疫反应；这两种短肽可以结合DNA减弱其免疫刺激效果，这在一定程度上可减轻烧伤引起的炎症反应。选择含有赖氨酸的多肽的另一个好处是，它们在盐溶液作用下，如正常的生理盐水和PBS，成胶性能增强，且得到的凝胶具有更大的硬度。因此，用PBS来制备水凝胶敷料，不仅可以保持生理pH，还可以增加敷料吸收伤口渗出物的能力。

该研究进一步用大鼠局部深度烧伤模型，以Mepitel^®为对照，对超短肽水凝胶作为伤口敷料的疗效进行了评价。Mepitel^®是一种临床应用的标准敷料，由一种涂有硅酮的柔性聚酰胺网组成。使用水凝胶作为烧伤敷料的一个重要优点在于它们可能促进坏死结痂的组织自溶性清创。自溶性清创优于物理方法，在于物理方法可能会在去除坏死的结痂组织的同时破坏正在修复的组织。研究中用的这两种超短肽水凝胶都刺激了自溶性清创。实验显示，在第8天，所有超短肽水凝胶处理的实验动物伤口全部启动了清创；相比之下，用Mepitel^®处理的实验动物伤口在第10天才全部启动了清创。超短肽处理的实验动物伤口在第12天完成了全部的清创，而Mepitel^®处理的实验动物伤口在第14天才完成。所有超短肽水凝胶处理的伤口清创无论是开始还是完成时间都早于Mepitel^®。通过加速对坏死组织的自溶性清除，超短肽水凝胶为细胞提供了进入损伤区域并开始组织再生的空间。伤口的重新上皮化在保护机体免受病原体侵害方面起着重要的屏障作用。当皮肤屏障被破坏时，免疫系统就会产生细胞因子来击退入侵的病原体。严重烧伤中，细胞因子的过度生产（细胞因子风暴）会引起过度的炎症，从而引发器官衰竭并导致患者死亡。通过加速再上皮化来关闭伤口并恢复皮肤屏障，可降低感染的风险。与使用Mepitel^®治疗组相比，使用超短肽水凝胶治疗的伤口愈合速度要快得多。在第 10天，Ac-ILVAGK-NH₂和 Ac-LIVAGK-NH₂处理的伤口再上皮化分别为58.6%和55.0%，而Mepitel^®只有47.3%。在第14天，超短肽水凝胶达到了86.2%和92.9%的伤口上皮化，这明显高于Mepitel^®敷料的62.8%。同样，组织学检测结果显示，到第14天，超短肽水凝胶处理的伤口几乎完成了表皮的再生，超过90%的受伤组织被新的上皮组织覆盖，而新的表皮几乎和健康的皮肤一样厚。表皮的基底细胞也开始进入受伤的真皮中形成新的毛囊的前体。相比之下，在Mepitel^®处理的伤口上皮化区域更小、更薄、更脆弱。因此，与Mepitel^®相比，超短肽水凝胶伤口敷料促进了上皮组织的再生，进而降低了感染的风险。研究结果还表明，这两种超短肽之间的微小氨基酸序列差异可能会影响伤口愈合的速度；Ac-LIVAGK-NH₂促伤口上皮化效果更佳。

超短肽的体内生物相容性在多个动物模型中得到了充分的研究，均表明它们不引起细胞和体液免疫反应，细胞对植入的水凝胶反应轻微，没有发现产生抗体，多种验证实验都证明了它们的非诱变、非免疫原性和非过敏性特性。

在伤口愈合过程中，细胞因子和生长因子之间复杂的相互作用促成了不同细胞的迁移和增殖，以调节炎症、肉芽组织、再上皮化、基质形成和重塑的过程。为了深入了解水凝胶在烧伤愈合中对细胞因子表达水平的影响，在伤口愈合的第7天和14天取皮肤样本检测其中10种细胞和生长因子的表达量，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-1α（IL-1α）、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TGF-β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血管内皮生长因子-α（VEGF-α）。 在第7天，在水凝胶治疗组与Mepitel^®治疗组之间，这些细胞因子表达水平没有统计学上的显著差异。到第14天，用 Ac-LIVAGK-NH₂和 Mepitel^®治疗的伤口的细胞因子表达量与健康皮肤相当，而Ac-ILVAGKNH₂显著提高了 IL-4、IL-6、TNF-α 和 GM-CSF 的表达，后三种是促炎细胞因子。IL-1α由表皮角质细胞生成，具有维持屏障功能。当皮肤屏障被破坏时，IL-1α被分泌以刺激胶原蛋白生成和细胞增殖。IL-1α还与TNF-α协同作用诱发炎症并促进伤口再上皮化。IL-6是另一种不可或缺的细胞因子，它间接诱导白细胞浸润、血管生成和上皮形成。同样，GM-CSF通过直接促进角质细胞增殖和间接调节IL-6来促进伤口重新上皮化。由于用Ac-LIVAGK-NH₂治疗的伤口已几乎完全被重新上皮化，这些促炎细胞因子的表达被下调，达到接近未损伤皮肤的水平。而在Ac-ILVAGK-NH₂治疗组，IL-1α，IL-6和TNF-α呈较高的表达水平，是由于伤口愈合较慢，伤口正在进行上皮化。因此，这两种超短肽之间表现出的不同炎症反应过程可以归因于再上皮化速率的差异。

超短肽水凝胶的应用，加速了自溶清创，刺激上皮细胞增殖，促进伤口闭合，加快了重度烧伤的恢复。超短肽水凝胶结合了商业敷料和传统水凝胶纳米纤维支架的优点，为组织再生提供了新的思路。其无色透明的特点便于伤口的观察，在证明了生物相容性和有效性之后，未来的应用前景包括与抗生素等联合使用，以防止感染和加速组织再生。这种自组装多肽也便于对不同配方设计进行修改，从可以补充水分的膜，到局部凝胶以及喷雾配方，配方的多功能性将促进不同需求的商业化。在应用的时候，可以通过在冻干的多肽干粉中加入一定量的无菌水来重新构建水凝胶。这种配方设计将大大降低运输成本，并有可能为急诊医学带来革命性的变化，为部分深度烧伤患者提供方便易用的一线治疗产品。

2017年Fatih Yergoz等人用PA作为治疗烧伤的伤口敷料。所选的多肽序列为带正电荷的K-PA（lauryl-VVAGK-Am），带负电荷的 HM-PA（Lauryl-VVAGEGD（K-psb）S-Am）和带负电荷的 E-PA（lauryl-VVAGE）。HM-PA分子的结构中引入磺酸基、羟基和羧基来模拟肝素，E-PA作为非生物活性的对照多肽。在中性环境中，以上两种带负电荷的多肽分别按比例与带正电荷K-PA混合，可以自组装成纤维网络，形成与ECM相似的结构。为了观察HM-PA（与K-PA 2∶1混合）水凝胶作为伤口敷料的作用，研究分别以非生物活性的E-PA（与KPA 1∶1混合）的水凝胶、蔗糖溶液（用于配制水凝胶）以及商品化的敷料3M^TMTegaderm^TM为对照。在第12、14和16天，相比于蔗糖溶液，HM-PA组的伤口面积明显减小，而E-PA组和3M^TMTegaderm^TM组并没有明显加快伤口的愈合。

烧伤伤口的修复不仅体现在伤口本身的愈合，还包括新形成的胶原蛋白替换受损的ECM，伤口局部的清创，以及形成新的皮肤附属器官。通过对肉芽组织形成、再上皮化、结痂形成、伤口收缩和皮肤附属结构的再生过程进行评价，以确定伤口修复的程度。皮肤伤口修复的主要特征之一是肌纤维细胞的收缩活动造成肉芽组织面积逐渐减少。HM-PA水凝胶处理的伤口在第7天肉芽组织区域显著缩小，这表明肝素模拟水凝胶增强了成纤维细胞的招募和/或局部成纤维细胞分化成肌纤维细胞的能力。除了损伤部位的物理收缩外，伤口的恢复还取决于ECM的局部重构包括清创和新基质蛋白的累积。HM-PA水凝胶在早期阶段对伤口闭合有显著的影响，而它对 ECM重塑的影响更持久。HM-PA水凝胶处理后伤口部位的成功重建也与伤口结痂的清除迅速有关，在第14天的时候，结痂的面积比蔗糖溶液和3M^TMTegaderm^TM处理的伤口大幅减小。另外，在第7天和第14天，HM-PA水凝胶处理后伤口中有大量血管生成，这说明其可以促进伤口早期的血管生成。VEGF和FGF-2的qRTPCR分析进一步支持了这些结果，在HM-PA水凝胶治疗组中，第7天时这些血管生成因子表达量显著增加。

严重烧伤伤口的特征是强烈的局部免疫反应，损伤部位的代谢率更高，皮质醇和细胞因子水平升高，从细胞外空间到伤口部位的液体、氧气和营养素的输送有限，导致受影响的组织逐渐坏死。因此，有效修复烧伤伤口需要调节代谢、免疫、稳态和血管生成等环节。肝素和硫酸乙酰肝素在烧伤部位大量表达可以通过防止凝血来促进早期伤口愈合，同时激活一系列的促炎和抗炎信号，并与生长因子结合，如 VEGF、FGF、HGF 和 TGF-β，刺激成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的增殖。然而，动物来源的肝素有传播人畜共患病的风险，这使得研发具有肝素功能的先进材料更有必要性。多肽水凝胶材料在这方面有很多优势，包括它们与ECM的相似性，易于修饰，能够不断地给受伤部位补水以及可以与细胞因子、抗生素、生长因子和/或干细胞联合应用等。HM-PA水凝胶模拟肝素活性，并在中性pH条件下形成一种生物相容性水凝胶。HMPA水凝胶曾被证明可以结合生长因子，促进骨、软骨分化，提高胰岛移植的成功率等。HM-PA水凝胶模拟肝素活性可以结合生长因子、锁住水分和具有黏多糖特征，能有效地促进深度烧伤的损伤修复。HM-PA水凝胶处理的伤口有较多的皮肤附属结构形成，伤口愈合和再上皮化速度提高，以及减少结痂形成，这与肝素在早期伤口愈合过程中所扮演的重要角色相同。

在烧伤的伤口内，缺氧和营养贫瘠的环境对组织的再生非常不利，这使得血管生成在伤口愈合中的作用特别重要。然而，在伤口愈合过程完成后，血管通常会被重新吸收，而在伤口愈合的后期，过度的血管生成也会影响组织修复和功能，例如可能会导致瘢痕过度形成。因此，血管生成和抗血管生成之间的平衡对于伤口的愈合是至关重要的，而HM-PA水凝胶能够通过调节血管生成和吸收来满足这一需求。因此，在早期伤口愈合过程中，HM-PA的存在能够有效地刺激血管生成，而在接下来的几天里它的降解将使重构得以继续。HM-PA中模拟肝素的结合位点可以与VEGF165结合，保留住内源性的VEGF，在伤口处刺激细胞自分泌信号，以此促进血管生成。此外，肝素与其他因子（如EGF）结合，可以促进成纤维细胞的招募、增殖和分化，这都可能是HM-PA加速伤口愈合的原因。

组织烧伤后，伤口部位的胶原蛋白基质完全变性，留下一个紊乱的、坏死性的细胞外环境。在伤口修复过程中，伤口部位的细胞碎片被清除，新的、交联的胶原蛋白基质由成纤维细胞产生。因此，胶原蛋白的排列可以用来测量伤口愈合的过程，健康的ECM的特征是两轴胶原蛋白纤维相互交织，形成一个网状的外观，而功能失调的ECM则只表现出单轴的胶原蛋白。在蔗糖和3M^TMTegaderm^TM治疗的伤口中，定位分析显示胶原蛋白纤维仅排列在一个轴上，而正常皮肤和HM-PA水凝胶治疗组织的胶原蛋白呈两轴纤维相互交织排列。总之，研究证明了肝素模拟多肽水凝胶能够促进伤口收缩和再上皮化，防止瘢痕过度形成，促进烧伤伤口修复。

皮肤附属结构的再生是伤口愈合的一种理想结果，反映了皮肤结构的完整再生。但人皮肤严重损伤后，缺失的皮肤附属器基本不能再生；目前的细胞化组织工程（人工）皮肤仅能再生皮肤的表皮结构，实现创面的覆盖，但缺乏皮肤的附属器官如毛囊、皮脂腺、汗腺等的再生，从而缺少了正常皮肤的外观和许多功能（所形成的皮肤如瘢痕，伸缩差，影响关节活动；皮肤感觉迟钝、干燥发炎、怕热等），给患者带来很大痛苦。皮肤附属器官的再生是实现完整的皮肤再生的瓶颈部分。

毛囊作为身体最小的器官，是皮肤附属器官的重要组织部分。毛囊由上皮和间充质细胞构成，其中蕴藏干细胞，并有皮脂腺等结构的附着，结构比较复杂。毛囊除了形成毛发外，还参与皮肤的感知功能。皮脂腺分泌的油脂能滋润皮肤、毛发，同时保护皮肤，防止皮肤水分蒸发，而且皮脂呈弱酸性，可以抑制和杀灭皮肤表面的细菌。皮脂腺是维护皮肤内稳态所需的重要保障，萎缩性皮脂腺会影响皮脂成分进而影响皮肤的生理屏障。因此，组织工程皮肤如果能再生毛囊和皮脂腺，对于提高患者皮肤修复后的功能和生活质量均具有重要意义。

同体内其他器官的形成原理类似，毛囊的形成与再生也是上皮干细胞和诱导细胞（间质细胞）相互作用的结果。研究证明，成人的皮肤存在多种具有形成毛囊能力的上皮干细胞（epithelial stem cells），它们位于皮肤的表皮基底层和毛囊，但它们均依赖恰当的微环境，包括合适的间充质细胞和ECM分子，单独将皮肤上皮干细胞注射到成人或成年鼠皮肤往往不能形成新的毛囊。因此，通过新材料，尤其是能够介导毛囊形成所需要的关键信号的合成材料，构建毛囊再生微环境，对于实现皮肤损伤后的毛囊再生以及构建具有毛囊再生能力的组织工程皮肤均具有重要意义。

基于自组装多肽的多方面的优点及在皮肤和其他多种组织损伤修复中所展示出的作用，清华大学深圳研究生院吴耀炯研究组对自组装多肽水凝胶对干细胞毛囊形成过程中的支持作用进行了研究。该研究中选用的多肽序列除了经典的 RADA16-Ⅰ还有 Ac-RADARADARADARADAGPRGDSGYRGDS-CONH₂（PRG）。 PRG是在RADA16-Ⅰ的基础上加了一段序列，添加的这段序列中含有两个RGD功能化片段。RGD序列有利于细胞的黏附和生长，使多肽具有更高的生物活性。研究人员用原子力显微镜（AFM）检测两种多肽的纳米纤维形成情况显示，在低浓度下，PRG形成的纳米纤维会比较短小（图11-4），在高浓度下，PRG不能形成纳米纤维结构（图11-5）。这可能是因为PRG序列中添加的功能片段有较大的空间位阻，影响了多肽的自组装。而两种多肽RADA16-Ⅰ和 PRG按照 1∶1的比例混合后（RADA-PRG），不论在低浓度还是高浓度下，RADAPRG均可以自组装成纳米纤维结构。

自组装多肽的一个特性就是在适当的条件下会自组装形成排列有序的纳米纤维，进而纳米纤维交叉形成类似于ECM的结构。将浓度为1%（w/v）的三种多肽溶液分别放入西林瓶中，倒置西林瓶。结果发现，RADA16-Ⅰ形成了水凝胶，它不会从瓶底滑落；PRG液体从瓶底沿壁流下，不能形成水凝胶；RADA-PRG与RADA16-Ⅰ类似，保留在西林瓶底部。这个结果也验证了之前AFM的结果，形成纳米纤维结构是形成水凝胶的必要步骤。流变学检测也得出相似的结论，其结果如图11-6所示，其中G’代表储能模量，而G”代表损耗模量，G’和G”分别表示了材料的弹性和黏性，RADA16-Ⅰ和RADA-PRG的G’储能模量远大于G”损耗模量，这说明它们具有较好的弹性和成胶性能，而PRG的G’储能模量和 G”损耗模量接近，说明PRG的成胶性能较差，流动性比较好。

研究显示，RADA-PRG多肽水凝胶对真皮干细胞（skin derived precursor，SKP）具有良好的支持作用。将培养的SKP经绿色荧光蛋白（GFP）基因标记后种在三种不同的自组装多肽水凝胶中（RADA16-Ⅰ、PRG 和 RADA-PRG），pH中和之后，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。每2天进行一次换液，培养3天时，在荧光显微镜下观察细胞的形态。结果如图11-7所示，在显微镜下观察到PRG中的细胞没有RADA16-Ⅰ和RADA-PRG中的那么铺展；而高倍镜下可清晰观察到RADA-PRG中的SKP更为伸展，RADA16-Ⅰ中部分细胞伸展较好，而PRG中的细胞伸展较少，显示RADA-PRG能够更好地支持SKP黏附。

荧光标记SKP的方法只能观察到细胞在水凝胶中的形态，而观察不到细胞与水凝胶的相互作用。因此，研究采用了扫描电子显微镜的方法，结果如图11-8所示，可以看到，SKP在三种多肽水凝胶中都可以生长，而且无论是在水凝胶的表面还是内部，都可以观察到细胞伸展的众多突起和对多肽纤维的黏附。

研究进一步观察了SKP在多肽水凝胶中的长期生存情况。培养3天的时候，RADA16-Ⅰ和RADA-PRG水凝胶中的SKP数量明显高于普通培养和PRG水凝胶；而7天之后RADA-PRG中的细胞数量明显高于其他组，这种趋势一直延续到14天。这说明RADA-PRG较其他两种多肽水凝胶能更好地支持SKP的生长和增殖。

碱性磷酸酶（AP）水平是反映SKP诱导毛囊形成能力的可靠指标，培养3天后，AP在三种多肽水凝胶中的活性为：RADA-PRG>RADA16-Ⅰ>PRG。其他毛囊再生相关的一些基因的表达水平也有差异，RADA-PRG组较其他两种水凝胶组，大部分相关基因表达水平都有所提高，其中，Bmp6、Wnt5a和Alx3提高明显，Akp2显著高于其他两组，这与之前AP蛋白活性检测结果一致。另外还可以看出，部分基因如Sox18、Pdgfra、Nog、Fgf7 在PRG中的表达有所下降，显示PRG水凝胶对SKP的支持作用不够充分。

上述体外实验结果显示，多肽水凝胶，尤其是RADA-PRG对SKP的存活、增殖和毛囊诱导相关基因的表达均具有良好的支持作用，提示RADAPRG可作为干细胞毛囊形成支持材料。为此，该研究进行了动物实验检验。将SKP（和新生鼠表皮细胞）与不同的多肽水凝胶混合后移植到裸鼠背部皮肤伤口中，同时用Matrigel作为对照。3周后，观察小鼠毛囊再生的情况如图11-9所示，所有组中，裸鼠的背部均长出明显的毛发，其中，以 RADAPRG为支持材料的移植部位生长出来的毛发明显多于其他组，而对照组所生长出的毛发数量相对较少。组织切片荧光显微镜下分析显示，GFP标记的SKP形成了毛囊的毛乳头（dermal papilla，DP）结构（图11-10）。另外，组织学分析细胞移植后不同时间伤口组织中CD45⁺的白细胞的数量，未见水凝胶引起白细胞数量的增多。这与既往研究结果一致，显示多肽水凝胶组织相容性好，不引起炎症反应。总之，本研究显示，RADA-PRG对于皮肤干细胞的生长和毛囊再生有很好的支持作用，并且有理想的组织相容性，是作为组织工程皮肤支架的较理想材料。

2.自组装多肽水凝胶材料在神经再生中的应用

自组装多肽水凝胶广泛用于周围神经及中枢神经组织损伤的再生修复研究，取得了一些令人鼓舞的效果，预示一定的临床应用前景。

周围神经较易受到损伤，当神经断端之间的间隙很小时，主要采用神经接合的治疗方式，但在损伤较大时，通常需要移植自体神经或神经导管。神经导管虽然解决了自体神经来源不足的问题，但因其内部是空的，当损伤较大时，其修复效果较差。向神经导管中注入适宜的支架可以提高其修复能力。有文献报道，通过一定的技术，PA多肽可以在神经导管中沿着轴向定向排列，形成与天然周围神经类似的结构。为了进一步改善生物学性能，该研究将两个功能短肽RGD和IKVAV分别接到了PA上，并注射到神经导管PLGA中，形成神经移植物PLGA/PA-RGD和PLGA/PA-IKVAV。利用大鼠坐骨神经缺损模型，比较了不同移植物对神经修复的作用。结果显示，相比于PLGA组，自体神经、PLGA/PA-RGD和PLGA/PA-IKVAV组明显加快了大鼠运动和感觉功能的恢复。组织学显示，PLGA/PA-RGD和PLGA/PA-IKVAV组的缺损处显示了更多的神经轴突和施万细胞。

诸多因素阻碍中枢神经损伤后的再生修复，如瘢痕形成、组织坏死后液化形成腔隙、成熟脑组织中多种抑制轴突形成和生长的因子。既往大量研究显示，RADA16-Ⅰ及在其基础上添加功能片段形成的衍生物，如RADA16-IKVAV、RADA16-RGD或两者的混合物RADA16-IKVAV/RGD形成的水凝胶，均能促进中枢神经组织和周围神经的修复与再生。概括其机制，主要有以下方面：①快速拟合中枢神经组织损伤造成的间隙：一方面RADA16具有快速止血功能，减少急性损伤造成的出血；另一方面，自组装多肽纳米纤维提供有助于神经再生的介质，例如，有研究显示，将RADA16-Ⅰ溶液用于仓鼠脑组织刀切割损伤的部位，有助于视觉的恢复，提示RADA16-Ⅰ可能有助于损伤神经轴突纤维的再连接；②减少损伤造成的神经元凋亡：有研究显示，RADA16-IKVAV/RGD能够抑制损伤神经组织的炎症反应，促进神经干细胞的成活与分化，减少神经损伤后凋亡神经元数量；③促进神经细胞功能恢复：体外研究显示，RADA16-Ⅰ不仅支持PC12细胞的生长，还促进体外培养的海马神经元形成功能性突触；RADA16-IKVA有助于神经干细胞黏附，并诱导其向神经元定向分化。体内研究显示，RADA16-IKVAV不但促进神经干细胞移植后成活，并显示出对神经干细胞向神经元分化的定向诱导功能。最近有研究显示，携带层粘连蛋白功能片段IKVAV的多肽水凝胶与胚胎干细胞来源的脑皮质神经祖细胞共同移植到大鼠脑梗死区域，可见多肽材料明显促进移植物的成活和向神经元的分化，进而促进组织再生和功能恢复。

另外，最近有研究显示自组装多肽有助于改善阿尔茨海默症。有研究将连接了IKVAV的PA注射到动物阿尔兹海默症小鼠模型，两周后结果显示，该多肽通过干扰皮质和海马中Aβ淀粉样斑块的形成，改善了大脑的认知障碍。另一项研究则显示，从β淀粉样蛋白中间片段衍生出的短肽连接到PLGA纳米微球上，可以有效抑制Aβ淀粉样斑块的形成。这些报道为研究阿尔茨海默病新的治疗方法带来了新思路，但需要更多的研究进一步明确其效果及作用机制。

自组装多肽水凝胶特别适合用于急性脊髓损伤的治疗。在急性脊髓损伤部位使用自组装多肽水凝胶可快速填充受损的组织空隙，减少进一步出血。另外，多肽水凝胶可抑制脊髓损伤后的炎症反应，从而减少后续组织变性引起的神经纤维退化。对于慢性和亚急性脊髓损伤，组织修复最大的挑战是损伤后形成的脊髓空洞。最近有研究显示，功能化多肽水凝胶RADA16-IKVAV/RGD填充的脊髓组织缺损能够诱导神经纤维向材料内延伸。但由于多肽水凝胶内在的局限性，如难以形成按一定方向规整排列的粗纤维，与静电纺丝技术结合使用是一个发展方向。静电纺丝是一种广泛使用的生产微结构和纳米结构支架材料的技术，能够产生理想的按一定方向排列的纤维。多种合成材料如聚己酯（PCL）、PLGA、聚乙烯对苯二酸盐和天然材料如海藻酸、透明质酸、胶原蛋白等已成为静电纺丝的原料。最近有研究将自组装多肽溶液进行静电纺丝，形成规则排列的多肽纤维，这有可能成为一种较理想的修复脊髓损伤的材料，但其效果有待进一步研究。

鉴于神经再生过程的复杂性，单纯一种材料的作用具有明显的局限性，未来不但需要研发出更多的功能化多肽，可能还需要与不同生物材料、药物和/或细胞的巧妙结合，但这些复合元素在提高了治疗效果的同时，也增加了产品审批的复杂性。

3.自组装多肽水凝胶材料在心肌再生中的应用

以RADA16为代表的自组装多肽材料已用于多个心脏损伤修复研究，无论多肽水凝胶本身，还是结合细胞或生长因子，均显示对于损伤心肌的修复作用。在RADA16-Ⅰ基础上添加整合素结合位点RGD形成的自组装功能多肽PRG或添加VEGF功能片段形成的功能多肽KLT[Ac-（RADA）₄G₄KLTWQELYQLKYKGI-CONH₂]，与间充质干细胞一起注射到小鼠梗死心肌后，见心肌内血管密度明显增加，左心室功能（左心射血分数）显著改善。

Notch 1信号通路对于心肌再生有重要作用。因此，大量研究试图通过激活Notch 1信号通路促进损伤心肌的再生。从临床应用角度考量，Notch 1配体在体内不稳定，单独使用效果不会理想；基因过表达Notch 1配体或受体方法受到基因治疗技术环节不成熟的限制，短期内难以应用于临床。比较可行的方法是将Notch 1配体结合到材料上，实现缓释和持久效果。最近有研究将Notch 1配体Jagged-1功能片段（H₂N-CDDYYYGFGCNKFCRPROH）结合到自组装多肽RADA16-Ⅱ上形成Notch信号功能化自组装多肽，将该多肽水凝胶注射到大鼠梗死心肌后，显示其能够显著抑制心肌梗死后的纤维化，大幅改善左心室功能。

大量研究显示，多肽水凝胶与生长因子结合可增加后者在体内的稳定性，随着多肽材料的降解，生长因子被缓慢释放。血小板生长因子-BB（PDGF-BB）通过诱导心肌细胞AKT磷酸化，激活AKT信号通路，阻止缺血心肌细胞发生凋亡；这种作用与PDGF-BB介导的AKT信号的强度和持续时间有关。研究显示，多肽水凝胶复合PDGF-BB后注射到大鼠梗死后心肌，能够使PDGF-BB持续释放达14天可显著减少梗死后心肌细胞死亡，缩小心肌梗死面积，改善左心室收缩功能，而单独注射多肽水凝胶或PDGF-BB则效果不明显。同样，有研究通过生物素-链霉亲和素（biotin-streptavidin）结合机制将胰岛素样生长因子-1（IGF-1）嫁接到自组装多肽骨架上，形成IGF-1自组装多肽水凝胶。将其注射到心肌后可持续释放IGF-1达28天；如将IGF-1自组装多肽水凝胶与心肌细胞一起注射到大鼠梗死心肌，则显示更加明显的心肌修复效果。最近有研究在IGF-1多肽水凝胶内混合间充质干细胞，一起移植到兔梗死心肌；结果显示，相比于单独使用IGF-1多肽水凝胶，结合了间充质干细胞的水凝胶显示了更加明显的减轻心肌炎症反应和心肌细胞凋亡的效果。

自组装多肽水凝胶与细胞的联合移植，显示了两者的协同作用。有研究将RADA16自组装多肽单独或与骨髓单个核细胞混合注入猪梗死心肌，显示两者对心肌梗死后的组织重建过程均有明显的作用，多肽水凝胶本身对梗死后左心室的收缩功能的恢复有改善，而多肽水凝胶复合骨髓单个核细胞则对梗死后左心室的收缩和舒张功能均有明显改善。最近有研究将RADA16-Ⅰ与间充质干细胞混合后的溶液敷在大鼠陈旧心肌梗死（心肌梗死后4周）部位的心脏表面（心外膜面），两者立即形成含间充质干细胞的多肽水凝胶层。结果显示，该间充质干细胞水凝胶制剂提高了多个心肌损伤修复基因的表达，减轻了心肌纤维化，促进了心肌内新的血管形成，总体上显示出对陈旧性心肌梗死病变有较大改善。

4.自组装多肽材料在骨和软骨组织再生中的应用

骨移植是治疗骨缺损的重要治疗方法，但由于供体骨来源不足，发展受到限制。因此，组织工程骨的研发是解决骨来源的重要途径。组织工程骨的制备，支持材料是一重要环节，可介导成骨信号的自组装多肽已用于多个成骨研究。

骨形态发生蛋白质家族（bone morphogenetic proteins，BMPs）是转化生长因子β超家族的重要成员。BMP2和BMP7具有诱导间充质细胞向成骨和成软骨分化的功能，其中BMP2已经在临床上用于促进骨折愈合以及脊柱融合治疗。但它们的单独使用存在成本高、体内易于降解、作用短暂、需重复性给药等弊端。为此，有多个研究试图将其功能片段连接到RADA16-Ⅰ，既能增加 RADA16-Ⅰ对成骨的支持与诱导作用，也能延长BMP的生物作用。

既往研究证明，仿BMP2功能片段P24（KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD），具有类似BMP2的促成骨生物功能，能够诱导骨髓基质细胞向成骨分化及异位骨形成。将 P24连接到 RADA16-Ⅰ形成RADA16-P24，RADA16-P24虽然仍然具备自组装成水凝胶的能力，但作为成骨材料，存在降解过快的不足。PLGA作为仿生成骨支持材料，有比较理想的机械强度、生物相容性和生物可降解速度。有研究将RADA16-P24与PLGA复合形成RADA16-P24-PLGA共聚物，在此基础上负载骨髓来源的间充质干细胞，RADA16-P24-PLGA明显支持间充质干细胞黏附，两者共同移植到大鼠皮下后，可见有类似骨组织形成。

同样，有研究将BMP-7的三个潜在功能片段连接到 RADA16-Ⅰ的 C末端，分别形成 RADASNV、RADA-KPS和 RADA-KAI。将它们分别与RADA16-Ⅰ按1∶1的比例混合形成水凝胶，观察不同水凝胶对椎间盘髓核细胞表达胶原蛋白Ⅱ，聚蛋白多糖（aggrecan）和sox-9的影响，发现RADA-KPS更具类似BMP7的生物功能，能够使椎间盘髓核细胞表达更高水平的聚蛋白多糖。另外，RADA-KPS和RADA16-Ⅰ混合形成的水凝胶对间充质干细胞增殖也具有明显的支持作用，当该水凝胶与间充质干细胞一起移植到体外椎间盘模型时，它能够显著促进间充质干细胞的存活。

多个研究显示，自组装多肽RADA16可作为间充质干细胞软骨形成的支持材料。为进一步增强多肽材料对间充质干细胞的成软骨诱导能力，最近有研究合成了一类含有N-cadherin（钙黏着蛋白）功能片段的自组装功能多肽，并显示了明显的促进间充质干细胞向软骨分化的功能。N-cadherin是一个细胞膜蛋白，通过影响细胞间的连接和信号传递，调控软骨的形成与发育；抑制N-cadherin的表达会导致透明软骨形成障碍。从N-cadherin细胞外片段衍生而来的含HAVDI序列的片段，具有类似N-cadherin的诱导软骨形成功能。将该片段连接到自组装多肽KLD-12，形成仿生功能化自组装多肽，与人间充质干细胞共培养，见对后者有明显的成软骨分化诱导作用，表现为成软骨基因表达升高，蛋白聚糖（proteoglycan）和Ⅱ型胶原蛋白合成分泌增加等。关节软骨损伤与退行性改变是影响关节功能的常见疾病，这些研究进展为后续研究软骨修复与再生的新方法奠定了基础。

5.自组装多肽临床应用研究

微量的RADA16可使伤口在15秒内止血。新近研究进一步发现，RADA16主要通过激发血块形成促进血液凝固，而基本不引起血小板和补体 C3a激活。RADA16作为止血剂已经进行了用于内镜治疗后伤口止血的临床研究，初步结果显示治疗安全、有效。P₁₁-4是根据骨组织的ECM分子特点设计的自组装多肽，该材料已用于治疗早期龋齿修复的临床研究，希望通过材料吸引矿物沉积修复牙齿骨组织缺损，初步结果显示治疗安全、有效。