六、丝胶蛋白作为药物载体在肿瘤治疗中的应用

恶性肿瘤是导致我国乃至世界人口死亡的主要原因之一，严重威胁着人们的身心健康，给家庭和社会带来了沉重负担，是全球性的公共卫生问题。在2015年，我国约有430万例新增癌症病例和281万例癌症死亡病例发生。随着我国人口数量的增长和老龄化程度的加深，恶性肿瘤负担将持续加重。现代医学技术的飞速发展，使得肿瘤的诊疗困境在一定程度上得到了改善，尤其是先进的肿瘤外科技术和各种抗癌新药，让部分恶性肿瘤患者特别是早期患者获得完全缓解且长期生存，但是针对病情急剧恶化和发生转移的晚期肿瘤患者，目前尚未找到完全有效的治疗策略。此外，肿瘤耐药性、肿瘤干细胞等治疗难点，使得现有的临床治疗方法面临着极大挑战。因此，继续研究新的肿瘤治疗策略刻不容缓。

（一）恶性肿瘤及其化疗概述

肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致细胞异常克隆增生而形成的肿块。根据其细胞学特性及其对机体的影响程度可将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤呈现出更大程度的侵袭性和转移性，对机体的危害更为显著。目前较为明确的导致恶性肿瘤发生的因素主要包括两大类：①外源性因素：包括物理性因素、化学性因素、生物性因素等；②内源性因素：包括遗传因素、内分泌因素和免疫因素等。

化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤最有效的手段之一，与放疗、手术治疗并称为治疗恶性肿瘤的三大主要手段。化疗作为一种全身性的治疗方式，主要用于发生远处扩散的中晚期患者。化疗药物根据来源、化学结构和作用机制不同，可分为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、植物药、铂类、免疫制剂、激素等种类。化疗药物可通过靶向DNA化学结构以及核酸合成或转录、微管蛋白合成等过程发挥作用。给药途径包括静脉注射、口服、腔内给药等。但是，传统的化疗模式在实际应用中存在着不可忽视的局限性：①基于细胞膜上的药物输出泵（如P-糖蛋白）、谷胱甘肽解毒酶、DNA修复或DNA拓扑异构酶等异常机制产生的肿瘤耐药性往往会导致化疗失效；②传统的化疗方式——全身性给药使化疗药物无选择性地散布于全身各组织器官，不仅降低了药物到达肿瘤部位的浓度，而且会导致严重的系统性毒副作用；③某些小分子化疗药物循环稳定性差，易被机体清除，也进一步减弱了化疗效果。因此，需要借助外源性辅助手段来提高传统化疗的有效性，同时减少药物的毒副作用。其中，药物载体的合理设计及其在肿瘤化疗中使用是改善传统化疗模式的有效方法之一。

（二）药物载体及其在肿瘤治疗中的应用

药物载体（drug carriers）是指能以包裹、吸附或连接等方式携带药物并输送到作用靶点的系统。药物载体可以提高化学药物的选择性、有效性和安全性，在药物控释技术中起着至关重要的作用。药物载体的控释主要通过长期缓慢释放药物或者在某些刺激下（如pH、温度、光、生物酶、氧化还原环境等）触发式释放药物来实现。药物载体可改善药物的药代动力学特性，提高药物的生物利用度，增加药物到达作用靶点的浓度，并且降低药物对正常组织的损伤。简而言之，理想的药物载体可以实现定时、定位、定速释放药物，因此可弥补传统化学药物选择性差、不可调控等缺陷。

常用的药物载体种类有脂质体、纳米粒、微球、微囊泡、凝胶等。用于制备药物载体的材料主要包括两大类：①天然高分子材料：如脂类、多糖类、蛋白质类材料等；②人工合成高分子材料：如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等。目前已有一些载体类化疗药物被批准临床使用，如戈舍瑞林植入剂（戈舍瑞林-聚乳酸-羟基乙酸共聚物）可用于膀胱癌、乳腺癌的治疗，白蛋白结合型紫杉醇可用于转移性乳腺癌的治疗，多柔比星脂质体可用于卵巢癌的治疗等。

（三）基于丝胶蛋白的药物载体及其在肿瘤治疗中的应用

丝胶蛋白是一种天然高分子蛋白质，作为药物载体具有较好的应用前景，主要原因在于其具有以下三个特点：①可塑性：丝胶蛋白含有大量羧基、氨基等化学活性基团，易于修饰与改性，可被制成多种剂型的药物载体以灵活应用于多种肿瘤类型；②良好的生物安全性：丝胶蛋白是一种天然蛋白，化学毒性弱，对细胞具有很好的相容性，且其免疫原性较低，在体内不会造成严重的急、慢性炎症反应，因此具有很好的生物相容性；③生物可降解性：丝胶蛋白在体内可经溶解和酶解等方式降解。这种可降解特性一方面可使药物经丝胶生物材料本身的降解得以释放，另一方面可实现无残留的药物治疗，进一步提高药物载体在体内使用的安全性。

目前研究中基于丝胶蛋白的药物载体类型主要有丝胶纳米粒、丝胶蛋白包裹的无机纳米粒及丝胶水凝胶，以下将分类进行阐述。

1.基于丝胶纳米粒的药物载体

纳米粒是目前研究最多的药物载体类型，其尺寸大小通常在10～100nm，可由天然高分子物质或合成高分子物质制备而成，常见的形式主要有纳米球和纳米囊。纳米粒与其他类型的药物载体最大的区别在于其可控的肿瘤靶向性。它一方面可以因高渗透长滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR effect）被动靶向肿瘤组织，另一方面可以在其表面修饰特异性结合某一受体的配体以主动靶向到肿瘤组织和细胞。此外，纳米粒主要是通过细胞内吞作用进入内涵体-溶酶体，这有利于躲避耐药性细胞膜上的药物外排通道而维持胞内的药物浓度；另外，还可以根据内涵体-溶酶体内的特殊环境设计刺激响应性的纳米粒以达到药物控释的目的。

（1）纯丝胶纳米粒：

纯丝胶纳米粒是由单一的丝胶蛋白作为原材料合成的纳米级细微型颗粒，其生物相容性良好、亲水性强、形态稳定，可用于搭载和递送化疗药物或某些肿瘤治疗性基因。通过对丝胶纳米粒进行功能化修饰还可提高其肿瘤靶向性。

1）叶酸耦联型丝胶-多柔比星纳米粒：通过pH敏感性的腙键将疏水性的小分子蒽环类化疗药物多柔比星连接于亲水性的肼基化丝胶蛋白，在水中可自组装成携有多柔比星的丝胶纳米粒。叶酸共价修饰于丝胶纳米粒上作为结合位点可主动靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞。这种叶酸耦联型丝胶-多柔比星纳米粒的粒径为36.2～71.4nm，表面电势约为-15mV。由于多柔比星是通过pH敏感的腙键连接于丝胶蛋白，因此多柔比星从载体的释放依赖于腙键在酸性环境中的断裂，即pH响应性药物释放。该纳米粒能够特异性地被叶酸受体高表达的肿瘤细胞内吞，进入酸性细胞器溶酶体，快速释放多柔比星至细胞核，实现肿瘤特异性化疗。

2）阳离子型丝胶纳米粒：通过乙醇去溶剂化技术（ethanol desolvation technique）和戊二醛交联法可形成单一分散的球形丝胶纳米粒，其粒径为100～150nm，表面电势约为-25.6mV。这种丝胶纳米粒能够被细胞吞噬，且细胞毒性较低。用多聚赖氨酸进一步修饰该纳米粒可使其表面电势转变为+30mV，形成阳离子型丝胶纳米粒，搭载负性核糖核酸或化学药物，用于肿瘤的基因治疗或化疗。

（2）复合型丝胶纳米粒：

复合型丝胶纳米粒是由丝胶蛋白与其他天然或合成高分子化合物形成的混合原料所合成的纳米级颗粒，可搭载和递送亲水性和疏水性的化学药物，适用于多种肿瘤的治疗。

1）丝胶/泊洛沙姆纳米粒：

聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物泊洛沙姆（poloxamer），又名普兰尼克（pluronic），是一种两亲性非离子表面活性剂，即具有固定的亲水端和疏水端。将丝胶蛋白与泊洛沙姆的混合溶液滴加至水相中，可自组装成粒径约为100nm的胶束样“核-壳”式纳米粒，可用于搭载亲水性或疏水性的抗肿瘤药物。其中，亲水性的药物结合于亲水性的“壳”部，而疏水性的药物结合于疏水性的“核”部（图10-9）。例如，搭载了疏水性抗肿瘤药物紫杉醇的丝胶/普兰尼克纳米粒可以有效杀伤人乳腺癌细胞MCF-7。

2）丝胶/壳聚糖纳米粒：

丝胶/壳聚糖纳米粒可通过物理-化学两步交联法合成。首先，负电性的丝胶蛋白与正电性的壳聚糖通过电荷间的相互作用进行结合，接着引入碳二亚胺[1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]进行化学交联以提高纳米粒的整合性和稳定性（图10-10）。这种丝胶/壳聚糖复合型纳米粒粒径约为200nm，且具有pH触发式电荷翻转的特性，即在中性环境（pH 7.4）下带负电荷，在弱酸性环境（pH 6.0）下翻转为正电荷，且随着pH的降低，其表面电势进一步升高，这与纳米粒在酸性环境下的氨基/羧基比例增加有关。这种pH触发式的电荷翻转特性，一方面可增强纳米粒在血液中的稳定性，延长纳米粒的循环时间，另一方面可提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取。丝胶/壳聚糖纳米粒通过吸附作用搭载抗肿瘤药物多柔比星，且随着pH的降低，纳米粒搭载药物的效率降低，释放药物的速率升高。细胞对纳米的摄取效率也随着pH的降低显著升高，因此，携带多柔比星的丝胶/壳聚糖纳米粒对肿瘤细胞的杀伤力也随着pH的降低而增强。

2.基于丝胶蛋白包裹的介孔二氧化硅纳米粒的药物载体

介孔二氧化硅纳米粒（mesoporous silica nanoparticle，MSN）是一种具有规则有序孔道结构的无机纳米材料，具备极高的比表面积和比孔容、可调的孔径和粒径大小、可供化学修饰的内外表面、较低的生理毒性等优良特性，在药物搭载和控释的研究中发挥了重要作用。介孔二氧化硅纳米粒主要通过吸附作用搭载药物，其孔径和比表面积决定了对药物的吸附能力。在孔径足以吸附药物的前提下，纳米粒的比表面积越大，其吸附药物的能力越强。介孔二氧化硅纳米粒控释药物主要通过在其外部设计合适的“阀门”实现。这些“阀门”在到达作用靶点前通常处于关闭状态，以避免药物的提前泄漏。当暴露于特定的刺激下，“阀门”打开并释放出药物，即刺激响应性药物释放。常用的“阀门”实体物质有聚合物、无机纳米粒能、环糊精、生物大分子等。

将丝胶蛋白作为“阀门”包裹于负载药物的介孔二氧化硅纳米粒表面，可提高纳米粒的药物包封、细胞内吞以及细胞内药物释放效率，其原因在于：①丝胶蛋白具有天然的细胞黏附性，将丝胶蛋白包裹于介孔二氧化硅纳米粒外层时，可通过与细胞间黏附作用提高细胞内吞纳米粒的效率；②丝胶蛋白富含多种可供化学修饰的极性基团（如氨基、羧基、羟基等），利用这些化学基团将丝胶共价连接于介孔二氧化硅纳米粒上，可有效防止药物的提前泄漏，还可以刺激响应性药物释放；③丝胶蛋白可被木瓜蛋白酶家族水解酶水解，而肿瘤细胞的溶酶体内高表达各种组织蛋白酶。由于溶酶体是纳米粒被细胞内吞进入细胞内的必经细胞器，丝胶蛋白的这种蛋白酶可降解性为实现细胞内多重刺激响应性药物的释放提供了重要基础。

丝胶蛋白包裹的介孔二氧化硅纳米粒（sericin coated MSN，SMSN）的制备和药物搭载过程包括：①通过逐步化学修饰合成醛基化的介孔二氧化硅纳米粒；②通过将载体分散在药物（如多柔比星）溶液中进行混匀而实现药物搭载（多柔比星＠醛基化介孔二氧化硅纳米粒）；③通过丝胶蛋白的氨基与介孔二氧化硅纳米粒的醛基的化合作用将丝胶蛋白包裹于载药纳米粒的表面，并形成酸敏感的亚胺键。因此，该载体进入细胞后快速释放药物同时依赖于溶酶体中的两种刺激，即强酸性环境和丰富的蛋白酶（图10-11）。

这种具有双重响应性的丝胶-介孔硅纳米药物载体不仅能够高效搭载化疗药物，还可实现药物的控释，即在中性和弱酸性环境下几乎无药物泄漏，而在酸性和蛋白酶存在的条件下快速释放药物。搭载了多柔比星的丝胶-介孔硅纳米粒不仅能够杀伤药物敏感性肿瘤细胞，还可逆转药物外排泵介导的肿瘤多重耐药性，在小鼠耐药性乳腺癌移植瘤模型中有效抑制肿瘤的生长。此外，这种纳米药物载体生物安全性高，能够显著减弱多柔比星对小鼠重要组织器官的损伤。

3.基于丝胶水凝胶的药物载体

丝胶水凝胶由丝胶蛋白在水介质发生交联而形成。将药物溶解或分散于丝胶蛋白水溶液中，或者利用化学键将药物连接于丝胶蛋白上并溶解于水介质中，通过交联可形成携带有药物的丝胶水凝胶。丝胶水凝胶可分为纯丝胶水凝胶和复合型丝胶水凝胶两种类型。后者是将丝胶蛋白与其他天然或合成高分子材料共混交联而成，可通过各组分性能之间取长补短来获得单一组分水凝胶无法达到的综合性能。由于丝胶蛋白是一种生物可降解型高分子材料，因此药物从丝胶水凝胶中释放出来的速率一方面取决于药物本身在体系中的溶解性，另一方面取决于丝胶水凝胶在释放环境中的降解速率。研究表明，丝胶水凝胶在碱性环境中的降解速度大于在中性和酸性环境中的降解速度，且药物在生理性条件下从丝胶水凝胶中释放的时间能维持在20天以上。通过改变复合型水凝胶的成分比例还可调控水凝胶的降解率和药物的释放速度。

丝胶水凝胶主要是通过化学键交联而成。如纯丝胶水凝胶可通过引入交联剂京尼平或戊二醛交联而成。丝胶/葡聚糖复合型水凝胶则通过丝胶的氨基结合葡聚糖的羟基交联而成。丝胶水凝胶作为药物载体用于肿瘤治疗时的给药途径主要包括两种：①将体外已成型的丝胶水凝胶药物载体经皮切口包埋于肿瘤旁；②将丝胶水凝胶前体液或半固态液通过注射器注入瘤旁或瘤内，使其在内部生理条件或外源性刺激下原位成胶，即可注射水凝胶。这种给药方式与皮下包埋相比创伤性小、操作简便、组织定位性强，且能降低非靶点部位的药物浓度从而减小毒副反应。

由于丝胶蛋白具有独特的荧光特性，因此将药物搭载于丝胶水凝胶用于体内时，可以通过荧光探测器无创性监测体内的丝胶降解和药物释放情况。将纯丝胶水凝胶和丝胶/葡聚糖复合型水凝胶注射于小鼠皮下均能检测到较强的荧光信号，且荧光稳定性高，不易猝灭。将搭载多柔比星的丝胶/葡聚糖复合型水凝胶注射于黑色素瘤荷瘤小鼠的瘤旁区域，不仅能抑制肿瘤的生长，还能实时、长期监测体内水凝胶的降解和多柔比星的缓释情况。因此，通过监测的数据可对影响药物释放的各因素加以分析，从而优化水凝胶的设计策略，以满足各种治疗需求。

肿瘤的异质性减弱了传统化疗的治疗效果，限制了传统化疗的适用范围。由于丝胶生物材料具有多种优越特性，使其可作为合适的化疗药物载体应用于肿瘤的靶向治疗：丝胶蛋白的可塑性使其可被制成多种剂型以便针对性地应用于不同肿瘤的靶向治疗，丝胶蛋白的细胞黏附性使得药物载体可被肿瘤细胞高效摄取，其生物可降解性可使药物载体在肿瘤微环境或肿瘤细胞内响应性快速释放药物，实现对肿瘤的特异性杀伤。此外，丝胶蛋白的天然荧光特性还可被用于药物载体在体内的实时示踪。王琳教授课题组基于丝胶多功能药物载体的研究为肿瘤的靶向治疗提供了新材料和新方法，具有广阔的研究与应用前景。