四、丝胶蛋白在皮肤修复中的应用

皮肤损伤在临床上十分常见，虽然人体皮肤具有一定的自主修复能力，但大面积皮肤缺损却易引起组织坏死甚至功能丧失，往往导致严重的不良后果。近年来，随着医学科技的快速发展，皮肤创伤修复的方法正不断地更新，由早期单纯的敷料治疗到之后的自体或异体皮肤移植，再到目前新兴的组织工程皮肤替代物，皮肤创伤的修复治疗取得了众多进展。

（一）皮肤的结构与功能

皮肤是人体面积最大的器官，覆盖整个人体外表面。一般成年人的皮肤总面积为1.5～1.7m²，总质量约占体重的1/16。皮肤是人体与外界环境之间的重要天然屏障，承担着保护机体、排泄汗液、调节体温、感受刺激等多种重要功能，调节机体与外界环境相适应。

皮肤组织由表皮、真皮和皮下组织三部分构成，其中表皮和真皮间存在大量血管、淋巴管和神经，同时，某些部位还具有毛发、汗腺、皮脂腺、毛囊等附属器官（图10-5）。

表皮是皮肤的最浅层，主要由角化形成细胞构成，其典型结构由内到外依次为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。基底层主要由位于基底膜上的基底细胞组成，是角化形成细胞的生发中心；从棘层到透明层，细胞逐步分化为成熟的角化形成细胞；角质层主要由终末分化状态完全角化的死细胞构成。表皮基底层的角质形成细胞逐步分化成熟，不断向上推移最终从角质层脱落。脱落的细胞可由基底层的增殖细胞进行补充，提示该处具有一定数量的干细胞，此类表皮干细胞的不断增殖分化使得表皮始终处于持续的更新状态。此外，在角质形成细胞间还零散分布有少量的非角质细胞，如决定皮肤颜色的黑色素细胞、能识别抗原与免疫相关的朗格汉斯细胞，以及具有突触样结构的梅克尔细胞等，它们与角质细胞共同维持皮肤的正常结构与功能。

真皮位于表皮下层，通过基底层与表皮相连，主要由结缔组织构成。真皮一般分为乳头层和网织层两部分。乳头层胶原纤维和弹性纤维致密排列，含大量的细胞和毛细血管，同时还有许多游离的神经末梢，与皮肤触觉相关；网织层位于乳头层下方，由致密的结缔组织组成，含大量弹性纤维和胶原纤维束，使得皮肤具有较大弹性和韧性。此外，该层还有较多血管、淋巴管和神经，某些部位还含有毛囊、皮脂腺、汗腺等结构。

皮下组织由疏松的结缔组织和脂肪组织构成，位于真皮下层且与真皮无明显界限，它将皮肤与深部组织进行连接，使得皮肤具有一定的可动性。

（二）皮肤损伤及修复

皮肤作为保护体表的重要组织器官，很容易受到外界或其他因素的损伤，其损伤原因主要包括外伤、烧伤、炎症、溃疡、糖尿病坏疽及先天性疾病等。

通常情况下，当皮肤损伤部位面积较小、程度较轻时，可通过自身的修复能力愈合。皮肤创面愈合过程可分为创面早期炎症反应、细胞增殖及血管新生以及基质成熟重塑（即瘢痕形成）三个阶段（图10-6）：①创面早期炎症反应阶段，皮肤创伤发生后数小时内便出现炎症反应，表现为充血、浆液渗出、白细胞浸润以及局部红肿，同时伤口处血液和渗出液中的纤维蛋白原很快凝固形成凝块；②细胞增殖阶段，主要表现为角质形成细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞的迁移、增殖和分化，从而实现再上皮化，形成肉芽组织，使创面愈合；③成熟和重塑阶段，主要包括胶原纤维交联增强，由杂乱无序的排列趋于有序的水平排列，Ⅲ型胶原蛋白逐步被Ⅰ型胶原蛋白替代，过度增生的毛细血管逐渐消失，细胞外基质中氨基多糖和水分含量减少，该过程历时较长，伤口处还可能出现瘢痕。

然而，当皮肤损伤部位面积过大时，正常皮肤组织所剩无几，自体皮源不能及时封闭创面，新生的皮肤组织不能完全覆盖伤口，且过大的创面也可能造成感染，严重的甚至会危及生命。在这种情况下，则需要通过自体移植、异体移植或使用皮肤替代物的方式来进行修复。自体移植修复创面的效果良好，但面临缺乏可供移植的自体皮肤组织、有时需要二次手术等问题；异体组织移植除了上述局限外，还可能引起免疫排斥反应和潜在的病毒感染；人工皮肤替代物虽然在临床治疗深度烧伤、慢性病导致的难以愈合的创伤以及皮肤溃疡等方面取得了良好的效果，但是目前皮肤替代物的研发还处于初级阶段，研究的产品仍存在诸多问题。因此，开发一种更为理想的组织工程皮肤替代物来进行大面积皮肤缺损的修复是亟待解决的临床问题。

（三）皮肤损伤的组织工程修复

近年来随着组织工程学的发展，含有细胞或生长因子成分的组织工程化皮肤成为研究的热点。通过组织工程技术制备的类似正常组织的人工皮肤用于皮肤创面修复，既能有效加速伤口愈合、减轻瘢痕痉挛，又解决了供体不足和免疫排斥等问题。应用于皮肤创面修复的组织工程人工皮肤必须满足以下几个特点：①来源丰富且易获取，制备工艺简便，成本较低；②能够在体外长期保存；③具有与人体皮肤类似的机械强度和柔韧性；④具有良好的生物相容性，不引起机体免疫排斥反应；⑤能够有效阻止细菌的侵入；⑥能够清除创面坏死组织，防止进一步损伤；⑦具有一定的保湿性，既能吸收创面的渗出液，又能保持合适的湿润程度。

用于制备组织工程人工皮肤的生物材料主要包括天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类。其中，天然生物材料因具有易获取、可降解性以及良好的生物相容性等多种优点而被广泛应用于皮肤修复材料的制备中。常见的天然生物材料主要包括：①胶原蛋白，作为细胞外基质的主要成分，可在创面愈合过程中补充暂时缺失的基质，并能对愈合过程进行有效的调控。其中最常见的是胶原蛋白/壳聚糖复合支架，该支架具有优良的力学性能和生物可降解性，但缺点是壳聚糖本身具有免疫原性；②明胶，是胶原经部分水解后得到的蛋白，具有无抗原性、易于吸收等优点，但其力学性能较差，为了改善这一缺陷常需要与其他材料复合使用；③壳聚糖，是由自然界广泛存在的几丁质经脱乙酰作用而得到的一种多糖，因其具有良好的血液相容性、安全性及可降解性被广泛关注，且其表面含有较多游离羟基和氨基，可通过引入不同的基团得到具有不同性能的壳聚糖衍生物，但其免疫原性限制了它的应用；④透明质酸，是一种广泛分布于人体各部位的酸性黏多糖，独特的高吸水性和良好的生物相容性使其在创伤愈合中具有良好的生物活性；⑤丝素蛋白，是蚕茧的主要成分，不仅具有良好的生物相容性和降解性能，而且易加工修饰、降解产物无毒，其机械强度也优于其他生物材料。

因皮肤修复的临床需要，目前已有许多商品化的皮肤替代物被应用于皮肤损伤的治疗。例如1996年问世的Integra^®被用于Ⅲ度烧伤治疗中，能够明显缩短创伤的愈合时间；1998年出现的人工皮肤Apligraf^®被广泛应用于糖尿病性溃疡和静脉性溃疡的治疗中，效果显著；再如2001年美国公司研发的真皮替代物Dermagraft^®也已被成功应用于各类烧伤及糖尿病溃疡的治疗中；此外，2007年空军军医大学（第四军医大学）自主研发的组织工程双层皮肤“安体肤”，适用于烧烫伤、糖尿病溃疡及各种难愈型皮肤创面的修复，在临床上取得了较为理想的治疗效果。

尽管目前已有多种生物材料及皮肤替代物应用于皮肤的创伤修复，然而这些生物材料都存在各自的缺陷，尚不能达到理想的修复效果，所以研究者们仍需进一步探索和研发新型组织工程产品应用于皮肤的创伤修复。

（四）丝胶蛋白在皮肤损伤修复中的应用

丝胶蛋白作为一种天然蛋白，近年来因其优良的生物相容性、生物可降解性以及低免疫原性等优势引起了国内外研究学者的关注。目前研究中涉及丝胶生物材料的组织工程化皮肤材料主要包括：①柞蚕茧丝胶蛋白与聚丙烯酰胺（PAA）以四甲基乙二胺（TEMED）交联形成的复合水凝胶，不仅成胶迅速，具有适宜的力学强度，可吸收创面渗出液，可于体内降解，而且能促进细胞黏附和增殖，无细胞毒性，适于真皮损伤的修复；②覆于聚四氟乙烯上不含交联剂的柞蚕蚕茧丝胶膜，不仅解决了丝胶蛋白本身的易碎性和延展性较差等问题，还具有更高的机械强度，以及良好的生物相容性和低免疫原性；③以戊二醇为交联剂对丝胶蛋白和胶原蛋白进行交联，不仅能改善丝胶蛋白的溶胀性和稳定性，还能促进成纤维细胞及角质细胞的生长、增殖，使其成为组织工程皮肤创面修复材料的合适选择之一。

王琳教授课题组采用碱提法从丝素缺失型蚕茧中提取丝胶蛋白，并进行了甲基丙烯酸酐化学修饰，继而将修饰后的丝胶蛋白在光引发剂I2959的作用下通过紫外线交联制备了一种可注射型丝胶水凝胶——甲基丙烯修饰的丝胶蛋白水凝胶（Ser-MA丝胶水凝胶），用于皮肤创面修复并取得了较好的修复效果（图10-7）。

该SerMA丝胶水凝胶在实验中表现出适于皮肤修复的诸多优点，主要体现为：①具有良好的生物相容性：将人类脐静脉细胞（HUVEC）与该水凝胶共培养96小时后，仍有90%以上细胞存活；②能够促进细胞黏附及增殖：将小鼠成肌细胞（C2C12）种植于水凝胶表面，能促进细胞的迅速黏附，并表现出良好的促细胞增殖特性；③能够促进细胞迁移：将小鼠成纤维细胞（NIH 3T3）与该水凝胶共孵育时，能促进细胞更快地迁移，因此能提高皮肤损伤的修复效率；④低免疫原性：将小鼠巨噬细胞（RAW264.7）与该水凝胶共培养时，细胞形态未发生明显变化，不发生分化，且不会引起炎性因子的上调。这些结果证明了SerMA丝胶水凝胶具有较低的免疫原性，且能有效促进细胞的黏附、增殖和迁移，是一种性能良好的生物材料。

王琳教授课题组将SerMA丝胶水凝胶应用于小鼠皮肤损伤模型的治疗中，取得了较好的治疗效果，主要体现为：①该水凝胶能够促进皮肤损伤的修复，且新生组织接近于正常组织；②该水凝胶能有效减少小鼠创面簇分化抗原68（CD68）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）阳性细胞数量，即能够减轻皮肤损伤前期的炎症反应；③该水凝胶能够促进皮肤创面的 VEGF、簇分化抗原31（CD31）以及平滑肌动蛋白（α-smooth muscles actin，α-SMA）等多种促血管生长因子的表达，并能够有效促进创面血管的再生。

王琳教授课题组研究证明：将SerMA丝胶水凝胶应用于小鼠的皮肤创面修复能够显著促进受损皮肤组织的修复与新血管的生成，同时能有效减少瘢痕组织。该丝胶水凝胶具有良好的创面修复效果，因此可作为良好的生物材料用于皮肤的创伤修复。