一、生物活性玻璃对创面修复的细胞学研究

生物活性玻璃具有良好的生物相容性和生物活性,已成功应用于硬组织(如骨、牙组织等)修复,在其应用于硬组织修复的过程中发现,它们除了能和骨组织形成稳定的键合外,还能促进细胞的增殖,调节损伤修复相关基因的表达,具有基因激活的作用,提示其可用于皮肤等软组织的修复。

创伤修复是一个由多种细胞、细胞因子及细胞外基质共同参与的生物学过程,过程复杂但高度有序,总的来说,主要包括细胞的迁移、增殖和分化,细胞因子的分泌、细胞外基质的沉积和重塑等。其中,细胞对推动创面修复进程起到了关键作用。因此,研究生物活性玻璃对参与创面修复的细胞的调控作用具有重要意义。参与创面修复的细胞主要包括各种炎性细胞(如中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和组织修复细胞(如表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等)。近年来,相关研究取得了一些重要的进展。本小节将分别就生物活性玻璃对巨噬细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的调控作用进行重点叙述。

(一)生物活性玻璃对巨噬细胞的作用研究

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,在创面修复中发挥重要的免疫功能,包括吞噬作用和抗原呈递。另外,巨噬细胞能产生很多细胞因子和化学趋化因子,从而激发新生血管的形成、胶原的合成及纤维化等过程。Leibovich等发现巨噬细胞缺陷的小鼠表现出创面修复迟缓的症状,包括上皮化过程延迟、血管再生延迟及肉芽组织形成异常等。创面部位的巨噬细胞可呈现出不同的表型,根据它们的活化状态和功能,可分为两类:M1型——经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)和M2型——替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage)。事实上,巨噬细胞存在一系列连续的功能状态,而M1型和M2型只是这种连续状态的两个极端。在相关因子的调节下,如细菌产物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和炎性因子干扰素(interferon,IFN)等,巨噬细胞能分化为 M1型巨噬细胞。M1型巨噬细胞通过释放炎性介质诱导产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、一氧化氮(NO)和白介素-6(interleukin-6,IL-6),从而促进炎性反应并表现出抗菌性能。另外,M1型巨噬细胞在IL-4和IL-13的作用下能分化为M2型巨噬细胞,它能抑制炎症反应和适应性免疫反应。这两种巨噬细胞对于创面修复来说都很重要,因此,两者之间平衡对于创面修复的不同阶段非常重要。比如说,创伤修复初期,需要更多的M1型巨噬细胞来清除坏死碎片和杀死可能侵入的抗原,而在创面修复的后续阶段,如肉芽组织快速增殖期,M2型巨噬细胞将发挥更大的作用。而在病理性修复过程中,这两者之间的平衡可能被打破,导致创面难愈。

近年来的研究发现,生物活性玻璃可影响巨噬细胞的行为及活化状态。早在2002年,Bosetti等便发现生物活性玻璃颗粒可被巨噬细胞吞噬,与58S溶胶-凝胶生物玻璃相比,45S5生物玻璃可促进巨噬细胞的黏附、伸展,并可上调细胞因子如肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。Day等发现45S5及磷酸锌生物活性玻璃可调控人巨噬细胞及单核细胞细胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌。当巨噬细胞被脂多糖激活成M1型巨噬细胞时,45S5可显著降低其分泌的细胞因子TNF-α及IL-6的表达,磷酸锌生物活性玻璃也可下调巨噬细胞IL-6的表达量;同时,IL-10的表达水平在两种生物活性玻璃的刺激下均得到有效的提升。这一研究表明生物活性玻璃可抑制促炎性因子的表达,并能升高抗炎性因子的水平,提示我们生物活性玻璃可调控巨噬细胞分泌炎症相关细胞因子来抑制炎症反应的发生。Varmette等研究了溶胶-凝胶生物活性玻璃即58S、含锌生物活性玻璃、含铜生物活性玻璃对脂多糖激活的巨噬细胞的作用,结果表明,巨噬细胞先与生物活性玻璃共培养再加入脂多糖被其激活后,TNF-α的表达量比先加脂多糖后加生物活性玻璃(或生物活性玻璃释放离子产物)要显著地降低;同时,与58S生物活性玻璃相比,含锌生物活性玻璃及含铜生物活性玻璃对巨噬细胞TNF-α的表达有更好的下调效果,提示这三类生物活性玻璃可应用于预防创面出现过度的炎症反应,具有良好的前景。

Dong等研究了生物活性玻璃的离子产物对巨噬细胞M1型向M2型转变的调控作用及巨噬细胞表型转变与修复细胞之间的作用关系,结果显示生物活性玻璃离子产物可激活巨噬细胞向M2型转变,使其分泌更多抗炎性因子(IL-10和TNF-β)及促血管生长因子[血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)]、并表达更少的促炎症因子(TNF-α和IL-1β)。此外,在使用巨噬细胞及生物活性玻璃共培养后的条件培养基培养内皮细胞和成纤维细胞后,内皮细胞的成血管能力及成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白的能力均得到提升。通过体内实验表明,生物活性玻璃降低了创面的炎症反应周期,且创面中可见更少的中性粒细胞及巨噬细胞,并加快了创面修复。因此,生物活性玻璃通过调控巨噬细胞表型转变来抑制炎症反应可能是其促进创面修复的一个重要的原因。

总的来说,目前关于生物活性玻璃对巨噬细胞的调控作用及机制的报道相对较少。因此,后续关于生物活性玻璃对巨噬细胞的行为调控、表型变化及相关机制等方面尚需深入研究,以期更好地阐明其促进创面修复的相关原理。

(二)生物活性玻璃对成纤维细胞的作用研究

成纤维细胞是皮肤真皮层的主要细胞,在创面修复的多个阶段都发挥了重要的作用。创面发生初期,创面周边本处于静息状态(quiescent)的成纤维细胞被激活并开始增殖,之后在创面处多种细胞因子的吸引下向创面迁移。一旦成纤维细胞迁移到创面部位,它们就开始合成新的富含胶原的细胞外基质,以替代创伤发生初期形成的临时基质-纤维蛋白凝块。随着新的细胞外基质逐渐增多,创面处的细胞外基质的应力增加。在细胞外基质高应力及转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的共同刺激下,一部分成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞同样可以合成胶原。同时,它们还具有收缩能力,从而促进创面收缩,有利于创面尽快闭合。但是,在创面修复后期,肌成纤维细胞的凋亡不足或过度分化均与病理性瘢痕的形成密切相关。此外,成纤维细胞能通过分泌多种生长因子,如 bFGF、TGF-β、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)等,促进创面的再生修复。

近年来研究表明,生物活性玻璃可调控成纤维细胞的生长、分泌、迁移及分化等行为。Day等在2004年就发现,低浓度(0.01~0.2wt%)45S5生物活性玻璃(<5μm)涂层与成纤维细胞共培养24小时后,能促进成纤维细胞的增殖,并检测到显著升高的VEGF表达水平。将人成纤维细胞和包裹有45S5生物活性玻璃(0~1wt%,平均粒径4μm)的海藻酸盐微球共培养发现,在生物玻璃的浓度为0.01wt%和0.1wt%时,成纤维细胞能分泌大量的VEGF,但浓度为1wt%的微球无法刺激成纤维细胞分泌VEGF,表明成纤维细胞对生物玻璃的应答具有浓度依赖性。此外,将人成纤维细胞培养在含有45S5BG的涂层上,能分泌大量的VEGF和bFGF,共培养后,收集到的成纤维细胞条件培养基也能刺激内皮细胞的增殖和血管的形成。Yu等发现生物活性玻璃可诱导成纤维细胞高表达VEGF、bFGF、表皮生长因子、Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白,经生物活性玻璃激活后,成纤维细胞膜片可显著加快创面的修复。Li等也发现,生物活性玻璃可激活成纤维细胞和内皮细胞共培养体系中的成纤维细胞高表达VEGF,从而提高内皮细胞的成血管能力,共同加快创面的修复。Wang等研究了掺铜生物活性玻璃复合支架对成纤维细胞的作用,发现其具有良好的生物相容性,并可提高成纤维细胞表达成血管相关生长因子如VEGF、PDGF和bFGF的水平,提高支架的成血管能力,促进创面修复。陈晓峰课题组发现生物活性玻璃微球可促进成纤维细胞的迁移,并调控其细胞外基质的分泌和向肌成纤维细胞的分化,进一步研究明确生物活性玻璃微球对成纤维细胞分化的调控作用是通过TGF-beta-Smad信号通路介导的。

综上所述,生物活性玻璃可促进成纤维细胞的增殖、迁移,并上调相关生长因子的表达,促进创面的修复;此外,生物活性玻璃还可通过调节成纤维细胞的分化,从而促进创面修复进程,在创面修复领域具有良好的应用前景。

(三)生物活性玻璃对内皮细胞的作用研究

在创面修复过程中,血管内皮细胞会参与血管再生等过程。血管再生是一个复杂的动态的生理过程,在细胞和生长因子、黏附物质等调节下,机体内的血管会以出芽或者微血管融合的方式生成新血管,创面附近的血管内皮细胞也会进行分裂、增殖并最终演变成毛细血管,并最终成熟为血管。新生血管对创面修复尤其重要,不仅能为创面输送氧气和营养物质,还能为新生的肉芽组织起支架的支撑作用。正常情况下,内皮细胞一般为静止的,机体受损后,受到各种生长因子和细胞因子等调控,如bFGF和VEGF等,创面边缘的内皮细胞开始迁移至创面部位,并形成新生毛细血管。因此,通过增殖、分化、迁移及参与血管再生等生理过程,血管内皮细胞可对创伤修复产生重要作用。

早期研究已发现生物活性玻璃可促进内皮细胞的增殖及血管形成。45S5生物玻璃能促进内皮细胞的增殖、增加内皮细胞血管化因子的表达。研究表明,无论是细胞直接与45S5生物玻璃颗粒接触,还是与含有生物玻璃溶出离子或离子基团的浸提液接触,都会增加新生血管的形成速度;将含有45S5生物玻璃颗粒涂层的高分子支架材料移植到大鼠皮下后也能观察到新生血管的形成。后续研究发现45S5生物活性玻璃能显著提高成纤维细胞表达和分泌血管化相关生长因子VEGF、bFGF的量,将这些被激活的成纤维细胞的培养基用于培养人真皮微血管内皮细胞发现其增殖明显加快,血管网形成明显增多。此外,45S5生物玻璃和胶原的复合支架可促进内皮细胞的增殖,并在体外和体内均表现出良好的成血管性能。

近年来,由于血管再生在创面修复中的重要作用,生物活性玻璃与内皮细胞的相互作用研究越见深入。同济大学王德平教授课题组/上海市第六人民医院张长青教授课题组联合制备了微米尺寸的硼酸盐生物活性玻璃纤维和掺铜硼酸盐生物活性玻璃纤维。体外培养时发现硼酸盐生物活性纤维形成的离子微环境对成纤维细胞和内皮细胞无毒性,且能促进内皮细胞的迁移、成纤维细胞的管状形成、成血管相关生长因子的分泌和成血管基因的表达。应用于全层皮肤缺损创面修复时,与空白对照组相比,两种硼酸盐生物活性玻璃纤维能加速伤口愈合,促进创面处胶原的沉积、成熟和有序排列,显示出优异的全层皮肤创伤修复性能。同时基于更好的血管化效应,掺铜硼酸盐生物活性玻璃纤维相较于无掺杂的硼酸盐生物活性玻璃纤维,有着更佳的创伤修复性能。陈晓峰课题组研究了内皮细胞在微纳米生物活性玻璃影响下的增殖、迁移及体外成血管性能,发现其能促进细胞的迁移、增殖,并能上调血管再生相关基因(VEGF、bFGF等)及其主要受体和它们的下游调节基因内皮型一氧化氮合成酶的表达,从而提高其体外成血管的性能。动物实验也证实纳米生物活性玻璃能加快创面中血管的形成,促进难愈合创面的修复。同时,生物活性玻璃的复合纳米纤维支架可促进内皮细胞的增殖及成血管蛋白的表达,在体内可促进创面血管化,并加快创面愈合。此外,掺铜生物活性玻璃复合支架也可促进内皮细胞的增殖及成血管,有利于创面修复。Li等制备了生物活性玻璃/鸡蛋壳膜材料,发现其可提高内皮细胞表达VEGF及其受体(VEGF receptor 2,KDR)、低氧诱导因子(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)、内皮细胞一氧化氮(endothelial nitric oxide,eNOS)的水平,并可在体内促进血管的形成及诱导创面快速愈合。

总的来说,生物活性玻璃可诱导创面中巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞等修复相关细胞积极参与创面修复,从而促进创面快速愈合。