三、结果

（一）THP-1的黏附和形态学改变

图8-2为PDMS网格上贴壁THP-1巨噬细胞1～7天的显微照片。第1天，THP-1贴壁细胞（图8-2A1～D1）细胞形态和分布在所有拓扑表面具有可比性，其形态与PBMC来源的初级巨噬细胞相似。黏附细胞由所有PDMS表面的圆形亚群和细长亚群组成。第1～3天，THP-1细胞扩散性显著增加，但到第7天略有下降。有趣的是，细胞扩展随着PDMS网格尺寸的增大而减小（图8-2A2～D2）。THP-1细胞收缩力足够强大而扭曲底层PDMS网格，最明显的是500nm（图8-2C1，C2）和1μm大小网格（图8-2D1、D2）第1天和第3天的样本。第7天的样本与第3天的样本具有相同的趋势，在较大的拓扑上细胞的扩散减少（图8-2A3～D3）。

图8-3为THP-1细胞扩增、细胞黏附密度和伸长的形态学测量结果。形态学计量分析显示，细胞在第1天（图8-3）各表面积上的扩散结果类似，但在第3天和第7天，细胞扩散随着网格宽度的增加呈下降趋势。拓扑诱导的细胞迁移在第3天变化显著，在300nm与1μm组之间以及500nm与1μm组之间均有统计学差异（P<0.05）。在较大拓扑结构上细胞伸展面积的下降，可能和细胞和平面的接触面积减少有关。在平面上，细胞有60%的细胞膜面积与平面接触，但是在1μm网格上接触面积降低至小于25%。细胞黏附点密度在所有PDMS网格尺寸中均类似（图8-3B）。细胞伸长的量化使用平均R值测量，该数据在第1天和第3天没有显著差别，但在第7天表现出对拓扑结构的显著差异（图8-3C）。增加拓扑结构大小，在细胞培养第7天，R值在各个组均下降（方差分析，P<0.01），最明显的差异在1μm组和500nm组之间（P<0.05）以及平面对照组（P<0.01）。黏附和延展的细胞（R值≥2.5，边界与网格相对夹角≤30°）比例很小，不到10%的总贴壁细胞（图8-3D）。在 THP-1细胞中没有观察到拓扑学变化与细胞延展系数的相关性（图8-4）。

（二）THP-1细胞因子分泌谱图

图8-5显示了在第1天、第3天和第7天测量到的THP-1细胞因子水平（pg/ml，每 1 000个细胞）拓扑结构诱导的变化。使用多元分析，我们检测了9个细胞因子：IL-1受体激动剂（IL-1ra）、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。 检测到的细胞因子根据其在异物反应过程中的作用进行分类：促炎或抗炎、促修复或抗修复。除抗炎/抗修复细胞因子IL-10外，分化初期检测到的细胞因子均有较高的表达水平：①抗炎/促修复细胞因子 IL-1ra；②促炎/促修复细胞因子 IL-1β和VEGF；③促炎/阻碍修复细胞因子 TNF-α、MIP-1α、MCP-1。

IL-1ra作为促进修复和抗炎细胞因子，其分泌量从第1天到第3天一般增长2倍多（pg/ml，每1 000个细胞），然后在第7天下降到初始水平（图8-5A）。与平面对照组相比，PDMS拓扑线索IL-1ra水平在第1天降低了一半以上：300nm（P<0.05）、500nm（P<0.05）和1μm 网格（P<0.05）。 IL-1ra与后期（第3天和第7天）的拓扑诱导变化无明显相关性，图8-5B显示抗炎/抗修复的细胞因子IL-10，在前期未检测到，但在第7天随着拓扑尺寸的增大呈明显的升高趋势（P<0.05）。平面样品300nm与500nm网格（P<0.005）比较差异有统计学意义；在300～500nm网格样品之间差异有统计学意义（P<0.01）。

IL-1β与VEGF作为促炎症和促修复细胞因子，在分泌的变化趋势上有一定差异。IL-1β是早期炎症常见的细胞因子，从第1天到第3天，其表达量增加2倍，从第3天至第7天其表达量下降90%（图8-5C）。VEGF水平随着时间的变化逐渐增加（图8-5D）。在各个时间点没有发现这两种细胞因子与拓扑结构变化有任何关联。在每个时间点也对促炎症和抗修复细胞因子TNF-α、MIP-1α、MCP-1进行检测（图8-5E～G）。TNF-α分泌量随着时间变化而逐渐降低，并且没有发现与拓扑结构的相关性（图8-5E）。同样，MIP-1α分泌也没有显示和拓扑结构的相关性，并且在第7天的表达量显著下降（图8-5F）。MCP-1水平于第1天至第3天逐渐升高，而在第7天下降（图8-5G）。拓扑结构变化对于MCP-1分泌水平的影响在第1天具有统计学意义（P<0.05），与平面对照相比，细胞在PDMS网格上的分泌量下降，各组均有统计学差异（P<0.005）。上清液中未检测到IL-6和IL-12（促炎和抗修复细胞因子）。为了统一呈现不同类型的数据，将所有细胞因子（图8-6A）根据细胞数量统一化。对于各个时间点每个组的相对表达量根据平面对照组进行标准化，趋势仍然非常相似（图8-6B）。

（三）原发性巨噬细胞黏附、形态改变及FBGC融合

为了扩展巨噬细胞对拓扑反应的体外模型，使用原代人巨噬细胞以提高其临床相关性和应用性至关重要。从人全血中分离出PBMC，并使其分化为巨噬细胞，将巨噬细胞种植在带有拓扑结构的PDMS样品上。图8-7显示在第1天、第3天和第7天，PBMC源巨噬细胞可以稳定地黏附在平面、300nm、500nm和1μm PDMS网格上。第1天各组形态学变化差异不大（图8-7A1～D1），除了一些细胞有所伸展。并且对于大尺寸拓扑结构，即500nm（图8-7C1）和 1μm 网格（图8-7D1），细胞沿着网格方向生长。在第3天的样本中（图8-7A2～D2），细胞保留了与第1天类似的形态。有趣的是，在这个时间点伸展和沿着网格生长的细胞数量轻微上升。为了在体外模型中诱导FBGC融合，第3天向培养基中添加IL-4。第7天的样品显示细胞伸展明显，未观察到细胞伸展状态（图8-7A3～D3）。

对于PDMS表面上黏附的巨噬细胞进行形态学检测，结果显示第1天和第3天无明显差别，形态学数据在第3天到第7天之间显著增加（图8-8A）。细胞黏附密度在第1天和第3天显示对于拓扑学的高度敏感性（图8-8B），但是在第7天没有明显趋势。尽管少数细胞确实在拓扑表面明显伸长，但是平均R值没有显示其与拓扑学和时间具有相关性（图8-8C）。异物反应的功能测量包括检查拓扑对FBGC融合的影响（图8-8D）：与平面对照相比，巨噬细胞在 PDMS网格（300nm、500nm和1μm）的融合能力显著降低（P<0.05），但在第3天受到IL-4刺激后，第7天融合能力显著增加（P<0.05）。与平面对照组相比，FBGC融合能力在500nm网格（P<0.05）和1μm网格组上最为显著（P<0.05）。

（四）原代巨噬细胞细胞因子释放

图8-9展示了原代巨噬细胞在PDMS网格作用下的细胞因子分泌情况，由于细胞黏附在不同形态学尺寸下的变化，细胞因子分泌根据细胞数量做统一量化（pg•ml^-1/100细胞）。拓扑诱导的细胞因子变化通过检测抗炎和促修复细胞因子来表示，第1天，IL-1ra在各组之间具有统计学差异（ANOVA，P<0.001），与平面对照相比，其分泌量在300nm 组（P<0.05）、500nm 组（P<0.05）和 1μm 组（P<0.05）明显下降（图8-9A）。同样，IL-10作为一种抗炎/抗修复细胞因子，与平面对照相比，细胞在PDMS拓扑网格上的分泌量明显降低（ANOVA，P<0.001），与平面对照组相比，各组在第1天分泌量均小于对照组（图8-9B）。IL-1β与 VEGF作为促炎促修复细胞因子，在对于拓扑结构的变化在第1天的结果相似。与对照组相比，IL-1β在PDMS网格中分泌量下降（方差分析，P<0.001），各组均有统计学差异（图8-9C）。VEGF的表达和变化趋势与之类似（图8-9D）。

一般来说，促炎/抗修复细胞因子TNF-α、MIP-1-α、IL-6和MCP-1在第1天高表达（约比其他细胞因子高出一个数量级），并在早期表现出对于拓扑变化的敏感性（图8-9E～H）。TNF-α是一个强效的早期炎症细胞因子，与平面对照相比，在PDMS网格上培养的细胞，在第1天其分泌水平升高（ANOVA，P<0.001，图8-9E）。 增加拓扑大小使得TNF-α水平下降，与平面对照组相比，每组都均有统计学意义，在300nm与500nm组之间也具有统计学差异（P<0.05）。在第1天MIP-1α分泌量高（超过标准曲线数据），在第3天其表达量减少至其1/3，但在第3天和第7天其表达量与拓扑学变化无关（图8-9F）。

IL-6的分泌趋势与TNF-α一致，在第1天和第3天，有一些细胞因子表达水平发生变化（图8-9G）。在第1天，相比平面对照组，IL-6分泌量在PDMS网格上显著减少（方差分析，P<0.01）。IL-6分泌在300～500nm网格间显著降低（P<0.005）。第3天，PDMS网格诱导IL-6分泌量高于平面对照组。

同样，分泌 MCP-1的镜像分子MIP-1α的趋势，除了第1天，拓扑的变化产生显著差异（ANOVA，P<0.001，图8-9H）。一般来说，随着拓扑尺寸增加，MCP-1分泌量降低，除了在1μm组其表达量小幅上升。与平面对照相比，300nm组的表达量下降水平最为显著（P<0.005）；500nm 组（P<0.05）和1μm组（P<0.005）与300nm组相比也存在统计学差异。

IL-12是促炎和抗修复细胞因子，在上清液中未检测到。每个细胞因子的检测下限为3.2pg/ml。细胞因子总水平（图8-10A）及其相应的相对表达量，并与各时间点平面对照组细胞密度和细胞因子分泌水平统一化计算（图8-10B）。

（五）吞噬作用的活动

在第1天、第3天和第7天，通过PDMS网格和平面对照组观察贴壁THP-1细胞的吞噬活性（图8-11，图8-12）。拓扑结果的变化对第1天样品的吞噬活性影响不大，但是PDMS网格上THP-1细胞吞噬率在第3天降低（ANOVA，P<0.05）。与平面对照相比，所有3个PDMS网格的吞噬活性在第3天都较低，但此时拓扑尺寸的增加对应着吞噬百分比的增加。尤其是细胞的吞噬活动，300nm组与平面对照组相比显著下降（P<0.05），和1μm组相比也显著下降（P<0.05）。第7天的吞噬活性较第1天和第3天高，但对拓扑结构的变化没有显著差异。THP-1细胞中荧光标记的微球和细胞膜的吞噬作用如图8-13A～C所示。