第二节 免疫检测入门简介

免疫检测利用试剂识别样本中的微量分析物并产生信号，从而进行测试。比如，免疫检测类似于用磁铁在水里收集铁屑。我们把一个磁铁固定在绳子末端并置于水中，水中的铁屑会被吸引到磁铁上。在免疫检测中，抗体（antibody）代替了磁铁用于捕获分析物，固相基质代替绳子用于固定抗体。抗体具备很高的选择性，可以在复杂的样本体系中识别目标分析物。通常样本中的目标分析物浓度极低，仅仅捕获它们仍难以得到检测结果。因此，人们引入另一试剂来识别被捕获的分析物并产生信号。在不同分析物浓度下，免疫检测中信号强度存在差异，通过对信号的强度水平进行测量和计算即可反映出待测分析物的浓度。

免疫检测具有特异性强、灵敏度高和设计灵活的特点，这些优势源自试剂中抗体具有的以下优点：

● 抗体能够广泛地识别天然或人造的各类物质，如化合物、生物分子、细胞、病毒等。

● 抗体针对结合的目标物质具备优异的特异性。

● 抗体与目标分析物的结合具备一定强度。

抗体可通过对目标动物体内接种抗原产生，这一过程被称为免疫接种（Immunization）。

一、免疫计量法

免疫检测中最简单的设计是免疫计量（Immunometric）法（图1-2-1）。在此类检测中，一个抗体被固定在塑料表面（如微孔板中的样本孔），用于从样本中捕获（capture）分析物；另一个抗体，特异性识别分析物的另一结构并用于构建信号生成系统（signal generation system）。后者被称为“标记”抗体，如放射性同位素是一种常见的标记物。在检测过程中，标记抗体识别并结合目标分析物，而未结合的标记抗体通过清洗被洗脱。检测体系中被保留的标记抗体会产生信号，信号强度与样本中分析物浓度存在一定的比例关系，通过对信号的测量即可实现对分析物浓度的测定。

免疫检测中被标记并产生信号的成分通常被称为示踪剂（tracer）。在检测中通过清洗可以有效地去除未结合的示踪剂，即分离（separation）。分离的效果对检测结果的准确性至关重要。免疫检测中固定抗体的材料称为固相（solid phase）载体，其中以塑料材质最为常用。在免疫计量分析法中，捕获抗体、分析物和标记抗体形成 “三明治夹心”结构，因此该方法也称作夹心（sandwich）检测法。

与之类似，当待测物为血样中的抗体时，人们选择合适的抗原作为“诱饵”对分析物进行捕获，这种设计广泛应用于感染性疾病的检测。如病毒表面的抗原可以被固定在塑料基质上，固定的抗原可以识别并捕获血样中由病毒诱发产生的人源抗体。已捕获的待测抗体可被标记的动物抗人抗体所识别，从而产生信号（图1-2-2）。通常这一类动物抗人抗体称为第二抗体，即二抗（second antibody）。

除了放射性同位素，酶（enzyme）也可以通过化学方式与抗体偶联（conjugate）作为示踪剂（图1-2-3）。酶与抗体类似，也是能够与特定目标分子结合的蛋白质。同时，酶具有催化特性。酶催化反应中的起始原料称为底物（substrate）。酶与合适的底物分子进行催化反应时，能够产生颜色、荧光、化学发光等信号，这些信号可以被光学或电子设备测定。每一个酶分子可以催化众多底物分子产生高强度信号，使检测系统具备高灵敏度。采用酶标记物为发光源的免疫检测的分析方法称为酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

二、竞争法

免疫计量法适用于大分子检测，待测物需具备足够表面积并可同时被两个不同抗体分子所识别。但是当待测物为小分子时，如药物分子，则通常选择竞争性（competitive）免疫分析法（简称“竞争法”）（图1-2-4）。竞争法通常只采用一种抗体，且在反应体系中抗体数量相对于待测物质数量是有限的或不足的。示踪剂通过标记目标分析物的类似物进行制备，其能够产生待测信号，如放射性同位素或酶。示踪剂与样本中的待测物共同竞争有限的抗体位点，被捕获示踪剂的数量与样本中分析物的浓度成间接比例关系。在竞争法中，固定化抗体和示踪剂的准确数量至关重要，这类检测有时也称为试剂限量（reagent limited）。与之对应，夹心法（三明治法）免疫检测则称为试剂过量（reagent excess）。

抗原（antigen）是指能够引起机体抗体响应的物质。在免疫检测中，与抗体结合的物质也被称为抗原。在竞争法中，有时待测分子过小无法引发动物体内的抗体响应，常引入化学手段将其与较大分子连接（偶联）以产生抗体。在偶联物的刺激下，动物体内也会形成可以识别游离小分子的抗体。这种需偶联才能在动物体内形成抗体的小分子称为半抗原（hapten），使动物产生免疫反应的游离分子或偶联分子称为免疫原（immunogen）。

三、均相免疫检测

上述免疫检测均需要在信号检测前去除未结合的示踪剂，因此这类方法称为非均相（heterogeneous）免疫检测。在非均相免疫检测中，通过对体系中未结合示踪剂的有效分离（如在信号产生之前用缓冲液对固相进行彻底的清洗）使检测信号随样本浓度变化。与之对应，另一类免疫检测无须分离操作，示踪剂仅在与免疫计量中分析物结合后或与竞争法中抗体结合后才可产生信号，称为均相（homogeneous）免疫检测（图1-2-5）。

四、定标

免疫检测过程中产生的信号与分析物浓度成比例关系，采用标准曲线（standard curve）匹配上述比例关系用于分析物定量的过程称为定标（calibration）。标准曲线通过一系列测试而建立。标准曲线建立时采用与样本分析时相同的方法进行测试，样本选择由已知分析物浓度样本稀释形成的具备浓度梯度的样本。在商品化检测试剂盒中，标准曲线通常由用户对一组预先标定浓度的溶液进行检测而获得。这些溶液称为校准品（calibrators），使用校准品产生的曲线称为校准曲线（calibration curve）。

通过标准曲线或校准曲线获得分析物浓度的免疫检测为定量（quantitative）检测。另一类免疫检测无须得到准确定量结果，仅需判断样本中是否含有待测分析物，即定性（qualitative）检测，如指示尿样来自怀孕妇女或非怀孕妇女。妊娠检测为日常生活中常见的定性测试。

五、小结

为了更深入地了解免疫检测，读者可参阅第一节“如何使用本书”，以确认免疫检测构建形式、组成成分、应用领域等具体信息的书内位置。

（张轶　译，何建文　审）