第一章 机械灌注的历史及现状

第一节 机械灌注历史

自从1954年美国医生Murray成功施行孪生子间肾移植并获得长期存活以来，肾移植已逐渐发展成一门定型的外科手术并用于临床慢性肾衰竭。这不但掀开了现代器官移植的篇章，且推动了其他脏器如肝脏、肺、心脏等的移植的探索研究及成功在临床中的应用。目前，器官移植技术渐趋成熟和完善，已逐渐成为治疗终末期器官衰竭唯一有效的手段。然而，器官供体短缺成为目前阻碍器官移植发展的重大障碍。为解决这一问题，一方面要扩大器官的来源，另一方面则是要找到保存供体的最有效方法。器官保存是器官移植的三大支柱之一。机械灌注（machine perfusion，MP）是器官获取后将其血管连接至机械灌注系统，系统在器官保存、转运阶段将灌注液在一定温度、压力条件下持续至灌注离体器官，同时供给离体器官氧气、营养物质等。与传统静态冷保存（static cold storage，SCS）相比，其能够更好地保存离体器官、甚至挽救标准外器官。根据维持温度不同，可以分为低温型（hypothermic machine perfusion，HMP，4~6℃）、亚低温型（subnormothermic machine perfusion，SMP，20~25℃）及常温型（normothermic machine perfusion，NMP，32~37℃）。根据氧合可分携氧MP与非携氧MP。

在这一领域的最初应用是肾脏活体体外灌注法，人工心室辅助机作灌注和原位灌注等。但这些方法不能延长离体肾保存时间，因此未引起人们的重视。1964年，Humphries团队为推动HMP的研究和应用做出了开拓性的贡献。Humphries等使用经稀释的自体血作为灌注液，选用40mmHg灌注压，灌注犬的离体肾脏，连续灌注24小时后，移植肾功能良好。Belzer等于1967年在Humphries方法的基础上进行了改良，设计了第一台机械灌注的装置，由1L犬自体血浆加上2mmol硫酸镁、250ml右旋糖酐、80U胰岛素、200 000U青霉素以及100mg的氢化可的松配制成灌注液（pH在7.4~7.5），灌注压设定在50~80mmHg之间，氧分压在150~190mmHg之间，在8~12℃条件下连续脉冲式灌注犬离体肾脏，72小时后肾脏移植回体内，同时切除对侧肾脏，犬存活良好，他同时将该灌注设备应用于临床肾移植手术中，成功地将肾脏保存时间延长至50小时，只有8%的患者术后需要进行血液透析。Starzl等在1968年首次将低温含血机械灌注应用于11例临床肝脏移植。该项模式逐渐引起了人们极大的兴趣，从而奠定了近代机械灌注法在器官保存中的地位，并得到了广泛的应用和研究。同时，另外一些学者进行着常温机械灌注的研究。HMP操作较简单，但不可避免地会引起冷保存损伤进而导致内皮细胞水肿甚至酸中毒。NMP营造了一个十分接近机体内环境的灌注条件，为确保器官功能，人们开始尝试器官常温灌注的方法。Starzl等在1967年首次使用常温灌注的肝脏进行肝移植手术并取得成功。同年，Neely首次提出了供心的不停跳保存模型：通过左心房插管泵入灌注液，经左心室从主动脉引出。由于主动脉远心端的顺应器可模拟类似于人体主动脉扩张的生理现象从而形成主动脉根部的压力，最终使灌注液进入冠状动脉营养心肌。

然而，1969年之后，由于冷保存液的改进大大改善了移植效果，加上操作简单易行，SCS一跃成为临床上器官保存的金标准。同时由于MP机器的庞大，操作的繁复和成本因素，很快淡出了视野。SCS具有简便安全、价格低廉及保存效果较好等优点，目前仍然是供器官保存的主要方法。这种方法基于低温条件下降低细胞代谢的原理将供器官保存在特殊的器官保存液中，然而低温时细胞的代谢活动并未完全停止。在低温保存期间，氧气和营养因子的来源终止，细胞内高能磷酸化合物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的合成持续减少，而ATP持续降解并到最终耗竭，引起细胞内代谢产物的异常堆积。Na+-K+-ATP酶（Na+泵）和Ca2+-Mg2+-ATP酶（Ca2+泵）进一步失活，导致细胞膜完整性破坏、细胞内外电解质浓度梯度失衡以及线粒体内钙超载等，钙离子进一步激活磷脂酶、蛋白酶及核酸酶等，进而导致供器官细胞凋亡和坏死。缺血过程中，由于钙依赖性蛋白酶的激活导致黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，再灌注后大量次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下形成尿酸，期间释放大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS）导致脂质过氧化反应，成为引起移植物功能障碍的原因之一。另外，再灌注后微循环障碍、Kupffer细胞的激活、白细胞黏附聚集及炎性细胞因子的释放等进一步导致移植物功能受损。因此，SCS具有保存时间有限，供体器官切取之前热缺血损伤不可逆，保存过程中产生时间依赖性损伤等局限。20世纪90年代，由于器官的短缺、心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供器官质量下降、远距离长时间的器官转运需求以及便携式机械灌注装置的研发成功，机械灌注在器官移植中应用再次获得关注。

大量文献表明，相比于SCS，MP具有突出的优势：

1.维持血管床通畅，通过持续动态灌注模拟机体内环境维持血管张力。

2.持续的营养及氧气供应，去除代谢废物及毒素，并向移植物提供ATP　在SCS低温保存期间，氧气和营养因子的来源终止，细胞内ATP的合成持续减少，而ATP持续降解并到最终耗竭，引起细胞内代谢产物的异常堆积，最终导致细胞凋亡和坏死。研究发现应用MP保存的供体移植后，细胞内ATP水平恢复更快，介导细胞凋亡的穿孔素蛋白表达比SCS组少。

3.减轻移植物血管内皮细胞的损伤　研究表明，SCS因缺乏流体作用而导致转录因子2及内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitricoxide synthetase，eNOS）表达减少，一氧化氮生物利用度的降低，NO是公认的血管舒张因子，因此加剧了血管活性物质内皮素以及血栓素A2的生成，从而导致血管内皮细胞功能紊乱。MP提供的流体剪切力通过增加磷酸化eNOS来保护NO信号通路，从而改善移植物微循环和血管阻力。

4.减轻移植过程中的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）　线粒体是IRI的前沿诱导物，冷保存导致线粒体含氧量降低，极大增加了再灌注的前10分钟内的氧耗，同时，电子传送链的电子泄漏导致ROS的释放，进而引起并加重IRI。低温氧化机器灌注依靠氧化代谢的可逆性抑制改变了线粒体氧化状态，并且在随后常温再灌注中减少了初始ROS释放。

5.实时动态监测移植物功能　通过实时收集胆汁分泌量及灌注液中肝酶水平可以动态反映肝脏活力及功能，利于供肝质量评估。

1993年，Beyersdorf等首次提出控制性下肢灌注（controlled limb reperfusion，CLR）的概念，将灌注应用于急性下肢缺血再灌注损伤治疗。Schon等于2001年首次对缺血60分钟的猪DCD供肝进行4小时常温机械灌注，术后移植物存活率明显提高。Vairetti等于2007年使用20℃携氧的Krebs-Henseleit（KH）液离体灌注大鼠肝脏6小时，首次验证了SMP相较于SCS的对肝脏的保护作用。SMP的提出主要是为了避免使用携氧载体和温度控制，让肝脏在室温保存，旨在综合HMP和NMP的优势、避免两者的不足。SMP的研究大多还停留在动物实验水平，有文献比较了不同灌注温度（10℃、20℃、30℃、37℃）对大鼠肝移植后代谢改变的影响，证实10℃或者20℃对肝脏损伤较少尤其是缺氧损伤。总的来说SMP避免了冷保存损伤而且不需要额外的温度控制，但是这项技术尚未开展临床试验，安全性和有效性有待评估。2009年Guarrera等首次完成了HMP保存供肝的临床试验。该研究对20例接受HMP（Vasosol液，4~6℃，灌注3~7小时）保存肝脏的受者与20例采用SCS保存肝脏的受者进行对比，结果显示：HMP组胆道并发症发生率较低，早期移植物功能丧失发生率更低，血清损伤标志物水平也更低，住院时间更短，提示HMP与SCS相比，是一种更加安全、可靠的保存供肝方式。随后的一些实验也证实了上述结果。同年，Moers等认为，脑死亡供体（donation after brain death，DBD）供肾HMP相比于SCS能够显著减少肾移植术后受者移植肾功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）的发生，同时较少的DGF发生使肾脏原发性无功能发生率（primary non-function，PNF）和急性排斥反应的发生率降低，并提高移植肾和移植患者的存活率。Op Den Driesa等于2013年首次对临床弃用的DCD肝脏进行常温灌注，证实常温机械灌注对DCD供肝的修复作用及其临床可行性。牛津大学研究小组于2013年首次对常温灌注24小时的肝脏进行临床移植，患者术后恢复较好，且2018年nature medicine杂志报道了常温灌注设备的临床试验结果，共纳入220例移植患者，结果显示常温机械灌注显著改善移植术后肝功能且有效减少肝脏弃用率，表明NMP实验成功延长了肝脏保存时限，有利于提高肝脏利用率。

Michel等于2014年比较了HMP和SCS在猪心脏保存中的差异，结果显示两组在心脏收缩功能方面没有差异，HMP组预示着较好的移植物存活率和患者生存率，但需要更多的动物及临床试验来证实。2015年，Abbas Ardehali将一项关于器官呵护系统保存供心的多中心随机对照临床研究结果发表于国际顶尖医学杂志柳叶刀，该研究共纳入2010年6月—2013年9月的130例心脏移植患者，结果发现接受多器官呵护系统保存的供心在延长近2小时的离体时间的前提下，与接受冷保存的供心相比，短期各项临床结果均无显著性差异。由此看来，常温不停跳灌注的供心保存技术的远期效果还需进一步观察和研究。同时，考虑实施心脏NMP，需要解决在心肌无收缩的情况下，增加心脏保存时间，并在移植前评估心脏功能状态，是摆在学者面前的难题。NMP在肺移植中应用前景乐观，供肺在再灌注过程中通过气管插管可得到氧气，并在移植前通过检测灌注液中的氧合水平来评估移植物状态。而对于胰腺，由于其血流量较低，易于受到灌注液的压力伤害，既往一些关于胰腺机械灌注的研究由于未控制好灌注的压力与流量，常不能取得令人满意的效果，故其研究进展要远远落后于肾脏与肝脏，依然需要大量研究探索（图1-1）。