第一节 粮食中蛋白质的检测方法

一、食品中蛋白质检测方法概述

（一）粮食中蛋白质的组成及含量

蛋白质是复杂的含氮有机物，主要由碳、氢、氧、氮四种元素组成。蛋白质组成的最大特点是含有氮元素，这是蛋白质与其他有机化合物的最大区别。有些蛋白质还含有微量的硫、磷、铁等元素，这些元素按一定结构组成氨基酸。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。构成蛋白质的氨基酸有20多种，氨基酸组成的数量和排列顺序不同，使人体中蛋白质达10万种以上。它们的结构、功能千差万别，形成了生命的多样性和复杂性。人和动物只能从食品中得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，所以蛋白质是人体的重要营养物质，也是食品中重要的营养指标。

食品种类很多，蛋白质在各类食品中的种类与含量分布是不均匀的。表1-1中列出了一些食品中蛋白质的含量。从中我们可以看出，一般动物性食品蛋白质含量高于植物性食品，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物蛋白主要分布在植物种子中，豆类食品含蛋白质最高。

（二）蛋白质检测的意义

蛋白质是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质。衡量食品的营养高低，蛋白质含量是一项重要指标。蛋白质除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。蛋白质在食品中的含量是相对固定的。测定食品中的蛋白质含量，对于评价食品的营养价值、合理利用食品资源、优化食品配方、评价食品质量均有重要意义。

（三）蛋白质检测的方法

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子质量很大。在蛋白质测定中，利用蛋白质含有氮元素而区别于其他有机化合物的特点，通过测定食品中的总含氮量来计算食品的蛋白质。一般情况下，大多数食品中蛋白质含氮量为16%，即1份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。因此，不同种类食品的蛋白质系数也会有差异，不能都采用6.25为蛋白质系数。关于换算系数的采用目前尚无定论。在本教材中如无特殊说明，还以通用的6.25作为蛋白质系数。

凯氏定氮法是通过测出试样中的总氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于试样中含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。此外，双缩脲法、染料结合法、紫外分光光度法、比色法等也常用于蛋白质含量的测定。另外，国外采用红外分析仪，利用波长在0.75～3μm范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收及反射的特性，依据红外线的反射强度与食品中蛋白质含量之间存在的函数关系而建立了近红外光谱快速定量方法。由于此方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。

二、粮食中粗蛋白含量的检测

（一）常量凯氏定氮法检测蛋白质含量

1.原理

采用凯氏定氮常量法测定样品中粗蛋白的含量，其原理为样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。以甘氨酸为例，该过程的反应方程式如下。

（1）消化 将试样与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。

在消化过程中，利用浓硫酸的脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮，反应式为：

NH₂ CH₂ COOH+3H₂ SO₄→2CO₂ +3SO₂ +4H₂ O+NH₃↑

同时浓硫酸又具有氧化性，使炭化后的碳进一步氧化为二氧化碳，硫酸同时被还原成二氧化硫，反应式为：

2H₂ SO₄ +C→CO₂ +2SO₂ +2H₂ O

最后二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵，留在酸性溶液中：

2NH₃ +H₂SO₄→（NH₄）₂SO₄

（2）蒸馏 在消化完全的试样消化液中加入碱液（浓氢氧化钠）使之碱化，消化液中的氨被游离出来，通过加热蒸馏释放出氨气，反应方程式如下：

（NH₄）₂SO₄ +2NaOH→2H₂O+Na₂SO₄ +2NH₃↑

（3）吸收与滴定 蒸馏所释放出来的氨，用弱酸溶液（如硼酸）进行吸收，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定。吸收及滴定反应方程式如下：

NH₃ +4H₃ BO₄→NH₄ HB₄ O₇ +5H₂ O

NH₄ HB₄ O₇ +HCl+5H₂ O→NH₄ Cl+4H₃ BO₃

本测定中滴定指示剂是用按一定比例配成的甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。甲基红在pH4.2～6.3变色，由红变为黄，终点为橙色；溴甲酚绿在pH3.8～5.4变色，由黄变蓝，终点为绿色。当两种指示剂按适当比例混合时，在pH5以上呈绿色，pH5以下为橙红色，在pH5时因互补色关系呈紫灰色，故此滴定终点十分明显，易于掌握。

2.适用范围及特点

凯氏定氮法可适用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量的测定，最低检出量为0.05mg氮，相当于0.3mg蛋白质。由于样品中常含有核酸、生物碱、含氨类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故本法测出的结果为粗蛋白质含量。

3.试剂

（1）浓硫酸（密度为1.8419g/L）。

（2）硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）。

（3）硫酸钾（K₂SO₄）。

（4）硼酸（H₃BO₃）。

（5）氢氧化钠（NaOH）。

（6）0.1mol/L盐酸标准溶液。

（7）甲基红指示剂（C₁₅H₁₅N₃O₂）。

（8）溴甲酚绿指示剂（C₂₁H₁₄Br₄O₅S）。

（9）亚甲基蓝指示剂（C₁₆H₁₈ClN₃S·3H₂O）。

（10）95%乙醇（C₂H₅OH）。

（11）硼酸溶液（20g/L）称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。

（12）氢氧化钠溶液（400g/L）称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

（13）硫酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。

（14）甲基红乙醇溶液（1g/L）称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（15）亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（16）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（17）混合指示液 2份甲基红乙醇溶液（14）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（15）临用时混合，也可用1份甲基红乙醇溶液（14）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（16）临用时混合。

4.主要仪器

（1）凯氏定氮蒸馏装置，如图1-1所示。

（2）天平 感量为1mg。

（3）量筒（10mL）。

（4）容量瓶。

（5）1mL、2mL、10mL刻度吸量管。

（6）自动凯氏定氮仪。

5.操作步骤

（1）消化 精密称取0.2～2.0g均匀固体试样、2～5g均匀半固体试样或吸取10～20mL液体试样（相当于氮30～40mg），精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，按图1-1安装消化装置，轻轻摇匀后在瓶口放一小漏斗，将瓶以45 °角斜支于有小孔的电炉石棉网上。在通风橱内小心加热，先用慢火待内溶物全部炭化，泡沫完全停止后，再加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5～1h。取出放置冷却至室温，向瓶中小心加水20mL。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

（2）测定 按图1-1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及几毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

（3）向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0mL试样处理液，由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH5.4；1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。同时做试剂空白试验。

6.结果计算

试样中蛋白质的含量按式（1-1）进行计算。

式中 X——试样中蛋白质的含量，g/100g；

V₁——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V₂——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V₃——吸取消化液的体积，mL；

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；

0.0140——1.0mL硫酸 [c（1/2H₂SO₄）=1.000mol/L] 或盐酸 [c（HCl）=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m——试样的质量，g；

F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留3位有效数字；蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

7.自动凯氏定氮仪法

称取固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（相当于30～40mg氮），精确至0.001g。按照仪器说明书的要求进行检测。

8.说明及注意事项

（1）所有的试剂溶液应用不含氮的蒸馏水配制。

（2）将样品加入凯氏烧瓶中时，应注意勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至瓶底部再放样品；如是固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶竖起，卷纸内的样晶即完全放在烧瓶底部。

（3）消化时由于会放出SO₂，因此需将烧瓶放置在通风橱内或通风处进行消化，或在消化架上进行。消化时不要用强火，应保持和缓微沸以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。

（4）样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。

（5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL，再继续加热消化。

（6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。

一般消化至透明后，继续消化30min即可，但对于特别难以氨化的氮化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等，需适当延长消化时间。有机物分解完全时，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁较多时，呈较深绿色。

9.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（二）微量凯氏定氮法检测蛋白质的含量

1.原理

同常量凯氏定氮法。

2.适用范围及特点

微量凯氏定氮法可适用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量的测定。

3.试剂

0.01mol/L盐酸标准溶液，其他试剂同常量凯氏定氮法。

4.主要仪器

凯氏烧瓶（100mL），微量凯氏定氮装置。

5.操作步骤

（1）试样消化 消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀待测。

（2）蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行（如图1-2所示）。

①仪器的洗涤：仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞需浸在10% NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，最后安装并固定在一只铁架台上。

仪器使用前，全部管道需经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸汽洗涤5min即可。较长时间来使用的仪器，重复蒸汽洗涤，不得少于3次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。

首先在蒸汽发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨液蒸出而影响结果，并放入少许玻璃珠，以防爆沸。沿小漏斗加入蒸馏水约10mL进入反应室，夹紧漏斗橡皮管，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸汽进入反应室，反应室内的水迅速沸腾，蒸汽进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。连续蒸煮5min，停止加热。冲洗完毕，夹紧蒸汽发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到汽水反应室中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，仪器即可供测试样使用。

②试样消化液的蒸馏：取洁净的100mL锥形瓶一只，加入4%硼酸溶液10mL（或2%硼酸溶液25mL），亚甲基蓝-甲基红指示剂（呈紫红色）2～3滴，承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前必须先打开汽水分离器下活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取消化稀释液10mL由小漏斗加入，用少量蒸馏水冲洗小漏斗3次。然后用量筒向小漏斗中加入10mL40%NaOH溶液，夹紧橡皮管。用5mL蒸馏水冲净小漏斗，关闭汽水分离器下活塞，加热蒸汽发生器，进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色起，再蒸馏10min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝臂下口1cm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，准备滴定。

③滴定：试样和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。用酸式微量滴定管以0.01mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后又出现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在1～2min内不变，则视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL。每组试样的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接收瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液体积，供计算用。

6.结果计算

同常量凯氏定氮法。

7.说明及注意事项

（1）每次蒸馏试样前需要先检查仪器的气密性并对仪器进行彻底清洗。

（2）蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3体积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。

（3）在蒸馏过程中，蒸汽供给要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。

（4）加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用封闭措施，以免氨由此逸出损失。

（三）燃烧法检测蛋白质的含量

1.原理

试样在900～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪（TCD）进行检测。本法适用蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类、乳粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。

2.仪器和设备

（1）氮/蛋白质分析仪。

（2）天平 感量为0.1mg。

3.分析步骤

按照仪器说明书要求称取0.1～1.0g充分混匀的试样（精确至0.0001g），用锡箔包裹后置于样品盘上。试样进入燃烧反应炉（900～1200℃）后，在高纯氧（≥99.99%）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（NO_x）被载气CO₂ 运送至还原炉（800℃）中，经还原生成氮气后检测其含量。

4.分析结果的表述

试样中蛋白质的含量按式（1-2）进行计算。

式中 X——试样中蛋白质的含量，g/100g；

C——试样中氮的含量，g/100g；

F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

5.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（四）蛋白质含量的其他检测方法

1.双缩脲比色法检测蛋白质的含量

蛋白质含有肽键，结构与双缩脲相似，因此也能发生双缩脲反应。在一定范围内，蛋白质含量与反应所生成的颜色深浅成正比，可用比色法测定，λ_max为540nm。本法适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类样品的测定。在0～10μg/L蛋白质含量范围内呈现良好的线性关系，灵敏度较低，但操作简单迅速。

2.福林（Folin）酚试剂法检测蛋白质的含量

蛋白质分子中含有肽键及带酚基的氨基酸，能与福林酚试剂反应生成蓝色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法定量测定，λ_max为750nm。该法灵敏度高，在0～100mg/L蛋白质含量范围内呈现良好的线性关系。当样品中含有酚类及柠檬酸等时对测定有干扰，某些浓度较高的试剂如硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸等对测定也有干扰。

3.紫外光吸收法检测蛋白质的含量

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸时，在280 nm处有吸收，吸收值与其浓度成正比，可定量测定。该法迅速、简便，不受低浓度盐干扰，但所测蛋白质与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量差异较大时，有误差，且样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质对测定有干扰。

三、蛋白氮及非蛋白氮含量的检测

（一）蛋白态氮含量的检测

1.原理

样品在水溶液中，当硫酸铜过量时，蛋白质被氢氧化铜沉淀而形成不溶于热水的化合物，使真蛋白质沉淀。然后用水洗去盐类和溶解性的氨化含氮物，将真蛋白质的沉淀物进行常规凯氏定氮法的消化、蒸馏、滴定过程测定其含量，将结果乘以蛋白质的换算系数后即得真蛋白质的含量。

2.适用范围及特点

本方法适用于各类食品中蛋白氮的含量测定。

3.试剂

（1）全部试剂均为分析纯，实验用水均为不含氮的蒸馏水。

（2）硫酸铜（60g/L）。

（3）氢氧化钠（12.5g/L）。

（4）氧化钡（100g/L）。

（5）凯氏定氮催化片或凯氏混合催化剂。

（6）硫酸（1.84g/L）。

（7）氢氧化钠（400g/L）。

（8）硼酸（20g/L）。

（9）盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。

（10）混合指示剂 甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合。

4.主要仪器

（1）凯氏蒸馏装置 半微量定氮蒸馏器，推荐使用自动定氮仪。

（2）消煮炉或电炉。

（3）粉碎机。

（4）分析天平 感量0.1mg。

（5）半微量滴定管。

（6）250mL消化管。

（7）250mL凯氏瓶。

（8）250mL锥形瓶。

5.操作方法

（1）样品的前处理 准确称取试样2～3g（精确到0.1mg）于250mL烧杯内，加入50mL蒸馏水加热至沸，然后向烧杯内倒入25mL（60g/L）硫酸铜溶液略搅，再徐徐加入25mL（12.5g/L）氢氧化钠溶液搅动，注意不要倒得太快，否则局部氢氧化钠溶液浓度太高时将溶解蛋白质。静置2h，用双层定量滤纸过滤，用热蒸馏水反复洗涤残渣，直至滤液不混浊为止（洗液用氯化钡溶液检查）。然后将漏斗连同滤纸置于65～70℃烘箱内下干燥2h。

（2）样品的消化 将烘干的试样连同滤纸一起放入凯氏烧瓶中，按凯氏法定氮。加入凯氏定氮催化片1片、25mL浓硫酸于凯氏烧瓶内或250mL消化管中摇匀，然后置于电炉或消煮炉中，先低温（100～200℃）小心加热并不断搅动，待内容物全部炭化、泡沫全部停止后，加大火力，温度至375～420℃，待液体澄清透明后，再继续加热1h（全过程消化2h左右），然后取下凯氏烧瓶或消化管放冷。

（3）定容 向冷却后的消化液加入20mL蒸馏水，摇匀后移入100mL容量瓶中，并用少量水洗涤凯氏瓶或消化管，洗液并入容量瓶中，反复洗涤直至消化液全部转入容量瓶中，冷却至室温后，定容至刻度，摇匀备用，此即试样分解液。

（4）半微量蒸馏法 采用半微量凯氏定氮蒸馏法。先将水蒸气发生器与半微量凯氏定氮蒸馏器连接好。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL（20g/L）吸收液和2滴混合催化剂的锥形瓶内，蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴、硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。取20mL2%硼酸水溶液于250mL锥形瓶中，加0.1%甲基红乙醇溶液5～6滴，0.5%溴甲酚绿乙醇溶液2～3滴，摇匀，然后将锥形瓶置于半微量凯氏定氮蒸馏器的末端，使冷凝管末端浸入此吸收液面下2/3处。准确移取试样分解液10mL，注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入5～10mL（400g/L）氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4～5min，降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏，准备滴定。此时应夹断气源，接出废液，准备下一个样品的测定。

（5）滴定 蒸馏后的吸收液立即用0.0500mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。

（6）空白试验 在进行样品测定的同时进行空白测定。空白测定除不加试样外，计算其他操作步骤与试样相同，空白试验消耗的盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL。

6.结果计算

蛋白氮含量按式（1-3）计算：

式中 V₂——滴定试样时所需标准溶液体积，mL；

V₁——滴定空白时所需标准溶液体积，mL；

c——盐酸标准溶液浓度，mol/L；

m——试样的质量，g；

V′——试样消化液分取体积，mL；

V——试样消化液总体积，mL；

0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol；

6.25——蛋白质的换算系数。

7.说明及注意事项

（1）在试样的前处理过程中，“煮沸” 要求是加热至沸并保持30min，目的是使试样中的非蛋白氮类物质充分溶解于水中。加10%硫酸铜溶液和25%氢氧化钠溶液时，最好采用移液管移取，然后沿着烧杯内壁缓慢滴加，一方面防止局部氢氧化钠太浓将溶解部分蛋白质，这将会导致最终结果偏低；另一方面是为了使试样中的真蛋白质充分盐析；放置2h或静置过夜也是这个道理。沉淀物宜以双层中速定量滤纸过滤，双层滤纸可以加快过滤速度，同时又不至于将沉淀物过滤掉。

（2）消化时应经常转动凯氏烧瓶以便使消化进行得迅速而完全。在炭化时如有黑色碳粒溅在瓶壁上应将凯氏烧瓶移出，待冷却后用少量蒸馏水冲洗，然后再继续消化。

（3）对胶体物质或脂肪含量较高的样品，消化时应防止泡沫溢出瓶口，如发现有泡沫溢至瓶颈时应立即移开火源，并加l～2滴蒸馏水再继续消化。

（4）蒸馏过程中要注意气体通路。即管夹要有一个打开，以免烫伤。在加试样分解液或碱液于反应室时要快。应先检查气源是否夹断，废液流出口是否畅通。开始蒸馏时应先通蒸汽后夹断废液排出口，否则所加液会回流排出。

（二）非蛋白氮含量的检测

1.原理

用15%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，滤液经消化、蒸馏后，用0.01mol/L盐酸滴定，计算氮含量，即为样品中非蛋白氮的含量。

2.适用范围及特点

本方法适用于乳及乳制品中非蛋白氮的含量测定。本法参照了GB/T 21704—2008中的方法。

3.试剂

（1）水 GB/T 6682—2008《分析实验用水规格和试验方法》规定的一级水。

（2）蔗糖（C₁₂H₂₂O₁₁）含氮不大于0.002%（质量分数），使用前不能在烘箱中干燥。

（3）三氯乙酸溶液 150g/L，称取15.0g三氯乙酸（CCl₃COOH），加水溶解并稀释至100mL，混匀。

（4）盐酸标准滴定溶液 [c（HCl）=0.01mol/L] 配制标定按GB/T 5009.1—2003附录B执行。

（5）其余试剂同GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》中试剂。

（6）定量滤纸 中速。

4.主要仪器

（1）分析天平 感量0.0001g。

（2）均质机 转速6000～18000r/min。

（3）定氮蒸馏装置或定氮仪。

5.操作方法

（1）试样制备 贮藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达到室温。

（2）液态试样 准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于预先已称量的烧杯中，待测。

（3）固态试样 准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于烧杯中；乳粉加入90mL温水，搅拌均匀；干酪加入40mL温水，均质机匀浆溶解；黄油温热融化。吸取10mL于预先已称量的烧杯中，称量，待测。

（4）沉淀、过滤 量取40mL的三氯乙酸溶液，加入至上述盛有试样的烧杯中，摇匀，准确称量，静置5min，中速滤纸过滤，收集澄清滤液。

（5）测定 准确称取滤液20g，精确至0.0001g，用0.01mol/L盐酸标准滴定溶液代替0.1mol/L盐酸标准滴定溶液，按GB/T 5009.5—2003第一法规定执行。

（6）空白测定 准确称取0.1g蔗糖于烧杯中，加入16mL的三氧乙酸溶液，按上述操作进行，作为空白值。

6.结果计算

非蛋白氮含量按式（1-4）计算。

式中 c——盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V₁——试样消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；

V₀——空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；

m₂——加入40mL三氯乙酸溶液后的试样质量，g；

0.065——响应因子；

m₁——用于沉淀蛋白的试样质量，g；

m₃——用于消化滤液的质量，g。

7.说明及注意事项

（1）取样 称取或量取样品时应仔细；液体样品应摇匀后取样，以免因取样不匀造成测定结果有误差；蛋白质含量低的样品，可加大取样量，重新消化测定1次，以免产生较大误差。

（2）消化 样品消化时应先用小火。采用自调式变压器或可调式电炉，以便能随时控制样品消化过程中的火力，防止爆沸溢出产生误差或造成实验失败；将全部样品浸泡在消化液中过滤后再消化，可加快整个消化工作的进展速度；H₂ SO₄按常规加入量可能酸量不足，应在后期补加5mLH₂ SO₄，以使样品消化更为彻底。

（3）蒸馏 蒸馏时加碱量是否充足，以蒸馏时反应室液体变成褐黑色为宜。可根据反应室的大小用更浓的碱液加入；蒸馏是否彻底，用pH试纸测试，至收集口馏出液呈中性时为止；蒸馏时馏出液管尖应插入吸收液中，至馏出液呈中性后，管尖离开液面以免发生倒吸，再蒸馏1min左右。

（4）滴定 指示剂的配制应适当，以利于滴定终点的观察。以0.1%甲基红醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液按1∶ 5的体积混合，碱性时为绿色，酸性时为酒红色。同时应做空白对照。

四、水溶性蛋白质含量的检测

1.原理

用水提取样品中的水溶性蛋白质，硫酸使含氮化合物转化成为硫酸铵，加强碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸滴定计算含氮量，乘以换算系数计算出大豆中水溶性蛋白的含量。

2.适用范围及特点

本方法适用于大豆中水溶性蛋白质的含量测定，本法参照了NY/T1205—2006中的方法。

3.试剂

（1）硫酸。

（2）盐酸。

（3）20g/L硼酸溶液 称取100g硼酸溶于5000mL水中。

（4）400g/L氢氧化钠溶液 称取2000g氢氧化钠溶于5000mL水中。

（5）盐酸标准溶液 [c（HCl）=0.1mol/L] 量取8.3mL盐酸，溶于1000mL水中。

标定：精密称取经270～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠0.15g，加水50mL，溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定到溶液由绿色变为紫红色。煮沸2min，冷却至室温，继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白试验。

盐酸标准溶液的浓度按式（1-5）计算：

式中 m——无水碳酸钠的质量，g；

V₁——盐酸溶液用量，mL；

V₂——空白试验盐酸用量，mL，

0.0530——Na₂ CO₃的毫摩尔质量，g/mmol。

（6）混合指示剂 1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中；两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。

（7）混合催化剂 [ξ（CuSO₄ +K₂SO₄）=10 +100] 称取10g硫酸铜和100g硫酸钾，混匀，研磨，过ϕ0.42mm筛。

4.主要仪器

（1）采用凯氏定氮法为原理的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪，或常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式蒸馏装置。

（2）分析天平 感量0.001g。

（3）粉碎机。

（4）可控温往复式摇床，频率150次/min，全振幅60mm，（20±2）℃可控。

（5）消煮炉。

（6）离心机。

（7）快速滤纸。

5.操作步骤

（1）提取 称取粉碎试样5g，精确至0.01g，装于50mL离心管中。吸取50mL20℃蒸馏水于离心管中，振摇使样品不结块，均匀分散。将离心管固定于摇床，温度控制在（20±2）℃，振荡60min。取下离心管，以2000 r/min离心10min。取出离心管，将上清液倒入250mL容量瓶中。向离心管残渣中重新加入50mL20℃蒸馏水，同前，再振荡60min，离心10min，将上清液倒入上述250mL容量瓶中，此操作重复2次，将提取液全部收集合并倒入该容量瓶中，加蒸馏水定容至250mL。

（2）消化 将容量瓶中溶液混合均匀后，快速滤纸过滤至250mL锥形瓶中，弃去最初的10～15mL滤液。准确吸取10mL提取液于500mL蒸馏管中，加入2～3g混合催化剂、10mL硫酸，充分混匀。将蒸馏装置于通风橱中加热消化。开始用100℃低温加热0.5h，至黑泡沫消失，控制瓶中泡沫不超过瓶管的2/3，然后再升温至400～430℃，加热1.5h，至消化液呈透明的蓝绿色时，继续加热0.5h。

（3）蒸馏、滴定 待消化液冷却至室温，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式蒸馏装置蒸馏、滴定。

（4）仪器参考条件 设定硼酸吸收滴定模式、20mL水、70mL氢氧化钠溶液、50mL硼酸溶液，蒸馏滴定总时间220s，150s后开始滴定，输入滴定标准盐酸溶液浓度。

6.结果计算

水溶性蛋白质含量按式（1-6）计算。

式中 c——盐酸标准溶液的浓度，moL/L；

V₁——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；

V₀——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；

m——样品质量，g；

0.0140——氮的毫摩尔质量，g/mmol；

6.25——氮换算为蛋白质的系数。

7.说明及注意事项

（1）水蒸气发生器内的水应保持酸性，这样可避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。为此，在发生器内的水中加入数毫升硫酸及甲基红指示剂，水应呈橙红色。

（2）定氮仪各连接处不能漏气。

（3）所用橡皮管、塞需经处理。方法是：浸在10%NaOH溶液中煮约10min。水洗，水煮10min，再水洗数次。

（4）在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。

（5）废液排除及洗涤：一次蒸馏结束后，在小玻杯中倒入冷蒸馏水，并加大煤气灯火焰，待蒸汽很足、反应室外壳温度很高、反应室中液体沸腾、连续不断冒泡后，用右手轻提棒状玻塞，使冷水流入反应室的同时，立即用左手使劲捏橡皮管，这时因反应室外壳中的蒸汽比反应室中的多，遇冷收缩较大，压力降低较多，结果反应室中废液通过反应室插管自动被抽到反应室外壳中。

（6）其他注意事项同常量法。

五、氮溶解指数测定

氮溶解指数（Nitrogen Solubility Index）是指水溶性氮占总氮的百分率或水溶性蛋白质占粗蛋白质的百分率。氮溶指数是一项衡量食品中蛋白质变性程度的重要指标。

1.原理

用一定浓度的氢氧化钾溶液提取试样中的可溶性蛋白质，在催化剂作用下用浓硫酸将提取液中可溶性蛋白质的氮转化为硫酸铵；加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用盐酸滴定测出试样中可溶性蛋白质含量；同时，测定原始试样中粗蛋白质含量，计算出试样的氮溶解数。

2.适用范围及特点

本方法适用于含有可溶性蛋白质的所有食品的氮溶解指数的测定。

3.测定方法

可溶性蛋白质的含量测定参考本章中可溶性蛋白质含量的测定方法；粗蛋白含量的测定参考本章凯氏定氮法测定。

4.结果计算

氮溶解指数（NSI，%）按式（1-7）或式（1-8）计算：

或

式中 N₁——水溶性氮的质量，g；

N——样品中总氮的质量，g；

N_水——水溶性蛋白质的质量，g；

N_粗——粗蛋白质的质量，g。