活性氧自由基最新测定方法主要有电子自旋共振、高效液相色谱、化学发光、电化学及荧光分析法等。寻求有效的活性氧自由基清除剂和抗氧化剂可预防各种疾病的发生，促进疾病的治疗。对于活性氧自由基的研究将为预防和治疗困扰人类的癌症、心血管疾病和衰老等慢性疾病做出贡献。

由于活性氧自由基反应活性强、寿命短、存在浓度低，在有关涉及活性氧自由基的研究中，其测定方法就显得特别重要。目前，测定活性氧自由基的主要方法有电子自旋共振、高效液相色谱、化学发光、电化学及荧光分析法等方法。

电子自旋共振法（electron spin resonance，ESR）又称电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR），是检测自由基最直接最有效的方法，像含有未成对电子的羟基自由基等顺磁性物质都可以用ESR进行检测。但由于自由基寿命极短，一般不易用电子自旋共振法直接检出，自旋捕集（spin trapping）技术建立，为化学反应中的自由基中间体和生命过程中自由基的ESR检测技术开辟新途径。其基本原理是利用捕捉剂与活泼自由基反应形成较稳定的自由基，即自旋加合物，然后再用ESR进行检测。

目前，较常用的自旋捕捉剂有2-亚硝基特丁烷（NtB），α-苯基-N-丁基氮氧化物（N-tert-butyl-α-phenylnitrone，PBN）及5，5二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5，5-Dimethyl-pyrroline-N-oxide，DMPO）。常用•OH捕捉剂是5，5-二甲基吡咯啉-1-氮氧化物（DMPO），DMPO对被捕捉的自由基很敏感，且具有较大的速率常数，根据DMPO与•OH反应生成的稳定加合物，可以检测出•OH。也有文献报道利用二甲基亚砜作为•OH的反应物而间接测定•OH。

由于很多自旋加合物的寿命仍然很短，只有几分钟或几十分钟，必须在捕集自由基后立即进行ESR测量，从而限制了许多实验研究。采用低温贮存技术，由捕捉剂DMPO与 、•OH等自由基产生的自旋加合物，通过对不同保存时间的自由基加合物ESR信号强度进行对比，发现保存时间延长至3天时，自旋加合物的浓度基本不变。这对实验室没有ESR测定条件且不能实时进行ESR测定的研究者提供了用ESR测定短寿命自由基的途径，即选择合适的捕捉剂捕捉待测自由基后立即置于液氮中保存，测定时取出，解冻后马上进行测定即可。

生物样品（组织、体液）中•OH的测定多采用HPLC测定自由基。在分离检测前需先用捕获剂捕集自由基，因此捕获剂不但要能捕获所需测定的自由基，反应产物具有一定稳定性，还要有利于HPLC分离和检测。如果捕获剂捕获自由基后的生成物具有荧光性质，也可用荧光检测器进行检测，其灵敏度比用紫外可见光检测要高。多种物质均可作为•OH的捕获剂，包括水杨酸、二甲亚砜、酚类物质等。

水杨酸是最常用的捕获剂，其羟基化产物是2，3-以及2，5-二羟基苯甲酸。Jen等将Fenton反应产生的•OH用水杨酸捕获，HPLC分离水杨酸和它的羟基化衍生物之后，用一个传统的电化学检测器配备一个UV检测器来检测，从羟基化衍生物的总浓度可以估算出羟自由基的生成量。

二甲基亚砜（DMSO）是一种常见的有机溶剂，近年来国内外均有报道利用DMSO捕集羟基自由基，定量测定•OH的产率。其测定原理是通过DMSO与•OH反应生成甲基亚磺酸（CH ₃SO ₂H）和甲基自由基，然后再利用两者的反应生成能够被HPLC分离检测的物质，如甲基亚磺酸与坚牢黄GC盐（fast yellow GC salt）反应生成重氮化合物邻-氯苯重氮甲基砜，甲基自由基与荧光胺衍生硝基氧反应生成稳定的O-甲基羟基胺。

除此以外，还有以酚、苯丙氨酸、α-蒎烯等作•OH捕获剂，用HPLC对其羟基化产物进行分离检测，也都取得了较为满意的结果。

在有氧条件下，黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的 可与化学发光剂鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol）反应，使其产物激发，当后者返回基态时，就向外发光，即产生化学发光。SOD能清除 ，故可抑制鲁米诺发光。Yao等用DMSO和氯化四丁基铵（DMSO-TBAC）溶液提取鼠不同组织中的超氧自由基，用鲁米诺加强化学发光反应检测。由于其他的氧物质反应引起的背景干扰被降到最小，实验达到最佳检测条件。

Choi等人用FI-CLA（flowinjection-chemiluminescenceassay流动注射化学发光分析）测试了黄嘌呤-XOD产生的超氧自由基及SOD活性。流动相pH7.4，其中含光泽精（5μmol/L）和黄嘌呤（0.3mmol/L）。在最佳的条件下，牛血清蛋白浓度1～1000μmol/L时，不影响化学发光。在30s时间内分析一个样品，相对标准偏差为±3.1%。实验报道FI-CLA法是分析SOD活性最快、最有用的工具之一。但是光泽精作为检测探针的正确性受到质疑。另外，Teranishi等利用化学发光技术研制了一种绿色化学发光探针，以此来检测 ，具有高效、高灵敏度、专一性等特点。

与电子自旋共振和高效液相色谱两种方法相比，发光法操作简便、不需要昂贵设备和测定快速。此方法建立对于研究自由基的产生、筛选清除自由基的药物及防治与自由基有关的疾病具有一定的应用价值。

电解水溶液时，铂阴电极表面上产生 ，但 继续接受电子并与H ⁺结合成为H ₂O ₂，因而该法虽可产生 ，但无实际意义。Rigo等采用滴汞电极代替铂阴电极，并在pH9.9、0.025mol/L硼酸盐缓冲溶液中加入氧化三苯膦（2，4，6-trimethyl benzoyl diphenyl phosphine oxide，TPO）。TPO为疏水性表面活化剂，它附在汞滴表面成为单分子层，可阻止H ₃O ⁺或H ⁺到达滴汞电极表面与 反应，从而可阻止 进一步还原，使 可扩散至溶液中。在TPO存在下，O ₂电极反应为O ₂+e→ ，极限电流受到扩散到电极表面的O ₂影响，与溶液中O ₂浓度成比例。在SOD存在下， 可迅速歧化为O ₂与H ₂O ₂，从而使电极表面附近O ₂浓度增加，导致极限电流也增加。根据极谱仪记录的极谱可以计算出SOD存在下与不存在时的平均极限电流，据此可以计算出样品液中SOD活性。Rigo极谱法类似脉冲辐解法，专一性强、精确度高，可以用于动力学研究。

Marshall等建立了极谱氧电极法测定SOD活性。其理论依据是利用在密闭酶反应室中， 产生系统邻苯三酚，在pH8.4溶液中发生自氧化，这一过程的耗氧量可用极谱氧电极仪测出。加入一定量SOD会使 歧化为H ₂O ₂与O ₂，从而使邻苯三酚自氧化耗氧量减少。据此可以计算出SOD催化 歧化反应中O ₂产量，由于后者多寡与SOD量相关，可以测出样品中SOD活性。同样，李文杰等利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化作为产生超氧自由基的源泉，当反应体系中加入定量的超氧化物歧化酶后即有氧气放出，用极谱氧电极检测超氧自由基经酶歧化前后氧量的变化，测定了超氧化物歧化酶的活力。此法较为简便，在1～2分钟内即可完成，效率高，结果直观，可自动记录。同时，此方法也适用于肾上腺素自氧化。张继全等改进方法:①室温下进行；②酶的活性用标准SOD标定；③反应在磷酸缓冲溶液中进行；④增大邻苯三酚的用量。改进后的体系克服电极薄膜表面产生气泡问题，实验的灵敏度增大，线性范围增大。

极谱氧电极法原理是依据氧张力变化进行测定，因而与被测物所处的物理状态，如黏度、颜色等无关，故适用范围广。而且取样量少、灵敏度高、速度快，可用于道氏综合征等诊断。此方法既是快速测定SOD活力的新方法，也可以用以测定反应体系中的超氧自由基的量。

Argese等应用一个短滴汞期汞电极（SDTME），存在表面活性剂TPO产生超氧自由基，测定SOD活性。1974年，Tyler根据SOD抑制亚硫酸盐被超氧阴离子自由基氧化（由XOD引起），测试SOD活性，用此方法测定鼠肝脏中SOD细胞内分布，并对氰化物敏感的Cu、Zn-SOD（总活性92%）和对氰化物不敏感的Mn-SOD（总活性8%）均进行测试，与用极谱法测定细胞色素c得到类似结果。

Daniele用稳态伏安法在半球性汞微电极上测定牛Cu、Zn-SOD活性。实验在充气的含TPO饱和溶液中进行测试，在pH 7.5～12.3范围内，研究pH对氧气还原过程的影响（存在或不存在SOD时），得到很好的稳态伏安波，波高重现性在2%以内。并且，利用该实验得出关于SOD催化超氧阴离子自由基反应动力学常数计算的理论公式，用此方法得到的结果与用短滴汞期的滴汞电极得到的结果一致。Qian等用循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）和常规脉冲极谱法（normal pulse polarography，NPP）在悬/滴汞电极上研究牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶（BESOD）电化学行为。实验结果证明没有助催化剂和介质时，用汞电极研究BESOD是可行的。

除此以外，还有Nation-甲基紫精（methylviologen，MV）修饰电极、细胞色素c修饰电极、过氧化物感应器等电化学方法检测 ，与其他电化学方法互补，提高 检测的稳定性和可靠性。尤其是细胞色素c修饰电极，排除惰性蛋白质影响，可应用于血SOD活性测试。

袁倬斌等利用脱氧核糖与Fenton反应产生的羟基自由基作用，在酸性条件下经过降解生成丙二醛，丙二醛再与甲醛、氨相互作用，生成具有电化学活性的产物3，5-二甲酰-1，4-二氢吡啶。通过用电化学分析法检测3，5-二甲酰-1，4-二氢吡啶的形成和变化，可得到丙二醛的产生和变化，进而推断出羟基自由基的量及变化。方法灵敏度高，稳定性好。

在生物体新陈代谢过程中产生各种活性氧自由基其产生最早的为 ，可以说它是导致自由基连锁反应的初始物质，是体内其他活性氧自由基的主要来源。

超氧自由基在水中是一种碱，它可以接受一个H ⁺形成质子化的超氧自由基HOO•（超氧自由基的共轭酸）。另外超氧自由基在水溶液存活时间约1秒钟，在脂溶性介质存活时间约为1小时，和其他活性氧自由基相比寿命较长，可以扩散到很远距离而达到靶位置，进而损害DNA、蛋白质及磷脂膜等生物分子。近年来研究表明 与人体许多疾病密切相关，如炎症、心血管疾病、肿瘤、衰老等。因此，实现对 定量检测具有非常重要的科学意义。荧光法相比较而言更加具有吸引力，不仅简单易行、便于操作、具有高灵敏度和高选择性特点，而且可以实现活细胞内超氧阴离子自由基的“原位可视化”，从而对它们在生命体内进行“实时在线”观测。

检测超氧阴离子自由基的荧光探针有氢化溴乙非啶、1，3-二苯基异苯并呋喃、2 _-（2-吡啶基）苯并噻唑啉、二（2，4-二硝基苯磺酸酯基）二氟荧光素、双（二苯基次膦酰基）荧光素、2-氯-1，3-二苯并噻唑啉环己烷荧光探针、香草醛缩苯胺荧光探针等。

羟基自由基•OH常与许多有机化合物尤其是芳香族化合物发生羟化反应生成具有荧光发射的物质。Tang等用流动注射荧光分光光度法:CO ²⁺催化H ₂O ₂（类似于Fenton反应）产生羟基自由基，用对苯二酸钠捕获羟基自由基，通过羟基化反应得到2-羟基邻苯二酸钠，荧光强度增大，相对荧光强度与羟基自由基的浓度成正比，从荧光强度的增大，可以间接测定羟基自由基。实验11次测定的相对标准偏差0.57%，可以用于筛分抗氧化药物，在研究羟基自由基损伤生物学上有理论和实际指导意义。

羧酸（7-OHCCA）是一种能发荧光且稳定、特异性强的羟基化产物，通过检测羧酸能够检测木头降解真菌生长体系中产生的羟基自由基。徐向荣等用Ce ³⁺被羟基自由基氧化，Ce ³⁺荧光强度发生变化，从而测定羟自由基。Ce ³⁺在稀硫酸中能产生特征荧光，最大激发波长和发射波长分别为280nm和360nm。此方法操作简单、快速，可作为一种简单有效的筛选抗氧化剂的方法。张江峰等用水杨基荧光酮（SAF）-Fe（Ⅱ）-H ₂O ₂荧光法测定Fenton反应所产生的羟自由基。SAF本身就能产生荧光，Fenton试剂产生的羟自由基能使SAF氧化，生成另一种物质，从而发生荧光的变化，利用仪器所测到的荧光强度变化来间接测定反应产生的羟自由基。

Tang研究一种新的荧光探针--H.Py.Bzt［2-（2-Pyridil）-bellzotlliazoline］流动注射荧光光度法检测SOD活性:在室内合成荧光探针，用元素分析、红外及核磁共振谱表征。此探针识别和捕获超氧自由基，被超氧自由基氧化形成一个强的荧光产物。以此反应为基础，提出流动注射荧光光度法，并成功用于测定SOD活性。测定活性氧时，此法选择性高，因为这个探针只被超氧自由基而不被H ₂O ₂氧化。相同数量的羟基自由基对超氧自由基的产生无影响，因为它不能使所测波长处反应体系的荧光强度发生变化。此方法已经用于测定大葱、蒜、洋葱SOD活性。

Pastor等用高灵敏度荧光生物感应器定量检测超氧自由基。超氧阴离子自由基由黄嘌呤-XOD体系生成，SOD催化超氧自由基生成H ₂O ₂。存在过氧化物酶时，H ₂O ₂参加反应产生发红色荧光氧化产物试卤灵。SOD-过氧化物酶系统被固定在简单的凝胶玻璃上。被包埋SOD-过氧化物酶体系的活性与其中溶解酶的活性几乎一样，这表明溶胶包裹保护酶的活性，包埋系统的特异性和重复使用性可达四个循环。实验中，荧光生物感应器检测到在由饱和或不饱和磷脂组成的磷脂模型膜中的超氧自由基浓度可达到20nmol/L。实验也研究在不同的温度和脂质浓度中对超氧阴离子自由基的检测，这些事实表明此感应器可用于生物及食品体系中超氧阴离子自由基测定，方法简单、可靠且灵敏度较高。

活性氧自由基由于其活泼的化学反应活性及极强的导致癌症、炎症、心血管疾病以及加快机体衰老等作用而引起广泛关注，寻求有效的活性氧自由基清除剂和抗氧化剂也成为研究目标。

酶既是自由基攻击的靶分子，又是自由基的天然清除剂。生物体内存在着多种能够分解活性氧自由基的酶系，如超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）等。SOD是人体防御内、外环境中超氧离子对人体侵害的重要的酶，广泛存在于各种组织中，其半衰期极短。胞液中含有以Cu ²⁺、Zn ²⁺为辅基的SOD，线粒体中则存在含Mn ²⁺的SOD，二者均能催化超氧离子的氧化与还原，生成H ₂O ₂与分子氧。

维生素C（Vc）和维生素E是重要的非酶促系统的抗氧化剂。维生素C是水溶性维生素，具有多羟基五元环，每一个羟基都有接受活性氧能力。其抗氧化机制是维生素C能与细胞中的过氧化物超氧自由基及羟基自由基反应，使氧化连锁反应终止进而保护细胞的完整性。维生素E是6-OH-苯并二氢呋喃衍生物，C-6上的羟基比较活泼，在活性氧的作用下α-TOH会转变为α-TO•，维生素C等活性物质又能使其还原为α-TOH，从而可被重复利用。

采用X-XOD-Luminol的 产生模型和Vc-Cu ²⁺-H ₂O ₂-酵母多糖的•OH产生体系，以还原型谷胱甘肽作为参照，用化学发光法研究19种氨基酸对活性氧自由基的清除能力，证实氨基酸普遍具有生物抗氧化活性。化学发光法和电子自旋共振法对赖氨酸和羟化赖氨酸清除超氧阴离子自由基的能力比较分子，结果表明赖氨酸在6位羟化以后，抗活性氧自由基能力显著提高。

随着分子生物学和医学的深入发展，研究证明适当补充外源性抗氧化剂或给予能使机体内源性抗氧化剂恢复到一定的药物水平都可使自由基引起的机体损伤与病变有所改善。然而，一些人工合成的抗氧化剂往往具有毒副作用，其临床应用有一定的局限性。近年来，从天然动植物中提取和分离一些活性成分、筛选有效、无毒的自由基清除剂已成为研究热点。

葛化冰、孙正等采用单细胞凝胶电泳法，观察螺旋藻对活性氧自由基诱发的单细胞DNA损伤的保护作用、评价螺旋藻的抗氧化作用，发现螺旋藻对活性氧自由基诱发的单细胞DNA损伤具有保护作用，并呈一定的量效关系。张成桂、何正春等采用体外化学模拟体系研究美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性，经SDS-PAGE分析和采用Folin-酚法测定对抗癌活性成分的组成进行初步分析发现美洲大蠊中抗癌活性成分在清除二苯基苦味肼基自由基（DPPH•）和•OH自由基的效果和总还原能力均表现出不同程度的量效依赖关系；清除DPPH•自由基能力EC ₅₀值为0.309mg/ml；清除•OH自由基EC ₅₀值为8.776mg/ml；抗癌活性成分还原力的EC ₅₀为1.103mg/ml；经过SDS-PAGE分析呈现的抗癌活性成分组成主要由一系列小分子多肽组成的混合物，小分子多肽在抗癌活性成分中的含量为62.7%。实验认为美洲大蠊中抗癌活性成分具有抗氧化活性，其活性弱于维生素C，其活性与浓度呈正相关性，其组成成分中多肽成分占有62.7%。秦民坚、吉文亮等采用生物化学发光法测定射干Belamcanda chinensis中分离的4种异黄酮类成分清除 、•OH和H ₂O ₂自由基的能力。实验发现射干根茎中分离得到的4种异黄酮类成分，野鸢尾苷元（irgenin，I）、鸢尾苷元（tectorigenin，Ⅱ）、鸢尾苷（tectoridin，Ⅲ）、5，6，7，4′-四羟基-8-甲氧基异黄酮（5，6，7，4′-tetrahydroxy-8-menthoxyisoflavone，Ⅳ）均具有清除自由基作用，其中鸢尾苷元对 、•OH和H ₂O ₂氧自由基清除作用能力最强。

综上所述，活性氧清除剂主要包括酶、维生素、天然中草药以及氨基酸类等物质，还有甘露醇也是已知的羟自由基的有效清除剂，一些微量元素如锌、硒等在动物机体内也以不同方式发挥重要的抗氧化作用。随着自由基生物学与医学的不断进步，有关活性氧自由基清除的研究也将不断发展和完善。

活性氧自由基与人体健康的关系是备受关注的新兴领域。虽然氧气及其化学性质早已被人们所熟悉，但对活性氧自由基的形成和消除过程中的动力学和动态学的研究有待深入。在此基础上，对预防及治疗由活性氧自由基引起的细胞破坏和疾病的研究具有重要的学术意义和实际意义。

DNA是生命活动中最为重要的遗传物质，由于结构特殊性而易受各种内源性和外源性理化因素的攻击，出现损伤，造成基因组不稳定，而基因组的不稳定正是肿瘤易感的根本原因。作为活性氧自由基氧化损伤的代表性产物8-OXOG可以引起G∶C→T∶A突变，该突变对于肿瘤发生具有重要作用。 OGGi碱基切除修复基因具有特异性识别和切除DNA双链8-OXOG，恢复正常G∶C配对功能，在维护DNA完整性、预防肿瘤发生上具有举足轻重作用。但是，关于人类 hOGGI基因表达的组织特异性、表达量的多少、酶活性高低与氧化损伤的程度（8-OXOG量）之间的关系等尚存在许多疑问，有待进一步研究。

在活性氧自由基的众多研究方法中活性氧自由基荧光探针未来将成为十分活跃的研究领域。设计合成近红外、区域定位、可逆的超氧阴离子自由基荧光探针，通过将荧光检测技术与激光共聚焦显微成像技术结合，实现对活体细胞内活性氧自由基实时、在线和可视化成像检测，而且可以示踪标记，是活性氧自由基最新研究方法。活性氧自由基荧光探针技术阐述复杂生命体内活性氧自由基的产生部位、作用机制和致病机制，某些离子的代谢、转化和致病原因。对新型药物的开发、实现某些重大疾病的早期诊断和预防有着重要的科学意义。

活性氧自由基生物抗氧化剂研究涉及许多活性氧自由基参与的疾病发展机制和防治。将化学、生物和医学结合，探索疾病发生、发展机制是生命科学的重要问题，也是当前期待深入研究的课题。因此，进行多种生物抗活性氧自由基的协同效应研究，研究生物体内多种抗氧化剂间相互平衡关系已成为抗氧化剂研究领域，也是活性氧自由基治疗学领域的新热点和发展方向，这些研究将为预防和治疗困扰人类癌症、心血管疾病和衰老等慢性疾病做出贡献。