一、概述

（一）CAR-T细胞治疗技术简介

1.CAR-T细胞治疗技术发展史

针对不同肿瘤抗原靶点的CAR-T免疫治疗已经大规模地进入动物实验阶段，并有大量相关文献报道。CAR-T技术临床操作中，两个技术关键点是T细胞培养体系的建立和T细胞转染效率。有文献报道，使用anti-CD3和CD28共刺激因子可以有效促进T细胞的大规模扩增，这为临床治疗对T细胞数量的要求提供了保障。对200多例患者回输体外培养的CD4和CD8阳性T细胞，均未发生明显的副反应^［2］。

CAR-T疗法的第一个积极临床结果由Baylor医学院的Malcolm K.Brenner研究组于2008年公布，靶向GD2的CAR-T疗法，尽管24h血液中CAR-T细胞含量不足0.1%，仍使得11名神经母细胞瘤患者中的3人完全缓解^［3］。随之而来的一个问题是如何保持CAR-T细胞在体内长期存活。第二代CAR-T引入了共刺激信号CD28和4-1BB，前者通过上调Bcl-X_L延长T细胞的寿命，后者可以增强T细胞的免疫效应^［3，4］。

2007～2009年，Baylor医学院的Michel Sadelain、宾夕法尼亚大学的Carl H.June和NCI研究所的Steven Rosenberg研究组分别报道了anti-CD19 CAR-T的临床前研究结果。2010年，Steven Rosenberg研究组用CD28共刺激信号，将第二代CAR-T技术用于治疗晚期滤泡性淋巴瘤。这项研究由8名患者参与，6名患者治疗后病情得到缓解。5名患者治疗后CAR-T细胞在外周血单核细胞中的含量超过1%，10天后达到峰值，一个月后含量回落到0.01%以下^［5，6］。2011年，Carl H.June教授发表了一例基于4-1BB共刺激信号，靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗CLL的案例。患者完全缓解，但伴随着细胞因子风暴带来的副反应^［7，8］。同年，Michel Sadelain和Renier J.Brentjens教授发表了基于CD28共刺激信号，靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗CLL和ALL的临床试验结果^［9，10］。使用的治疗剂量是10⁷个/kg体重。大部分患者在接受治疗的24h内出现发热等症状，多数是暂时性的，只有1名患者持续发热最终死亡，死亡原因不明，但可能与之前已存在的脓毒症有关。1例CLL患者得到缓解，疗效维持了6个月。1例ALL患者病情缓解。治疗2周后，患者血液中均检测不到CAR-T细胞存在。针对CD19的CAR-T细胞疗法大获成功，更大规模的临床试验已经在其他B细胞相关的恶性肿瘤患者中开展。比如Till等^［11］用电转的方法将anti-CD20 CAR导入CD8⁺ T细胞，用于临床治疗难治滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。招募了7名患者，均接受3次CD20 CAR-T细胞逐量递增输注（分别为10⁸个/m²，10⁹个/m²和3.3×10⁹个/m²）。其中3例患者输注CAR-T细胞后，细胞在体内的存活时间较短。后4例患者进行皮下低剂量IL-2（500000IU/m²）注射，每天2次，持续14天，CAR-T细胞在体内的存活时间明显延长。由于CAR结构中的scFv段来源于小鼠，输注后的3个月和6个月分别有2名患者出现人抗鼠免疫反应，但临床可控。

CAR-T技术使T细胞对肿瘤抗原的识别越过了MHC的递呈机制，使肿瘤细胞不能通过下调MHC的表达躲避T细胞的追杀。但是CAR-T可以识别的抗原仅局限于肿瘤细胞的表面抗原，一般只能占到肿瘤抗原的20%左右。另外，这些肿瘤相关抗原大部分也表达在正常细胞表面，CAR-T细胞容易造成“误伤”，具有脱靶毒性。临床上用CAR-T细胞治疗后也存在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和引发细胞因子风暴的风险。CAR-T疗法的安全问题主要体现在脱靶毒性和细胞因子风暴上。

2.CAR-T细胞基本组成元件

如图1-5所示^［12］， CAR的结构组成包含五部分，分别简介如下：

（1）抗原识别区　CAR-T细胞之所以能特异性地结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于抗原识别结构域（antigen recognition domain，ARD）。ARD从抗体的单链可变区（single-chain variable fragment，scFv），或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体（variable lymphocyte receptors，VLR）衍生而来，到目前为止，ARD最为常见的来源是抗体的scFv段。

（2）铰链区　作用于CAR抗原结合区和跨膜结构域（TM）之间的连接称之为铰链区。这个区域通过给予抗原结合域一定范围的活动，允许CAR识别抗原，并且也可以形成免疫突触。目前使用的铰链区主要来源于IgG1、IgG4的Fc区域、CD84、CD28，IgD和CD7也有少量使用。此外，典型的铰链区还包含一些残基，这些残基参与CAR二聚化，有助于增加抗原的敏感性。

（3）跨膜结构域　跨膜结构域连接着CAR 结构的细胞内和细胞外成分。不同的TM可以影响CAR 的表达和稳定性，但是并不直接参与信号传递，通过相互作用可以提高下游信号传递。CD3是第一代CAR 分子使用的TM，对于后来的CARs，CD28、CD88的TM使用也比较多，其他的TM也来源于CD4、OX40、CD7、Fc70和H-2K^b片段的一部分。

（4）胞内共刺激分子　尽管已经有多个研究组研究了不同的胞内共刺激分子对CAR-T细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影响，但到目前为止，仍然没有一致的结果说明哪个共刺激分子更为优越，因此，共刺激分子的选择通常是一件具有倾向性的事情。由于较好的效应记录， CD28和4-1BB是使用频率最高的，此外，还有一些其他的共刺激分子结构域，比如OX40、ICOS、CD27、NKG2D、DAP10、MyD88/CD40和CD244等。

（5）胞内T细胞活化分子　胞内信号分子主要来源于CD3，此外，在早期FcR-γ也比较多。

3.CAR-T细胞结构演变

如图1-6所示^［34］，根据CAR结构元件组成的不同，目前CAR-T细胞结构分为四代。第一代CAR主要由引导肽（linker）、抗原识别区（scFv片段）、铰链区（hinge）、跨膜结构域和胞内T细胞活化分子（CD3ζ）四部分组成（见本章第三节）。第二代CAR在第一代CAR的基础上，增加了一个胞内共刺激因子CD28或者CD137（见本章第四节）。在第二代CAR的基础上，将两个或两个以上的胞内共刺激分子串联起来，组成第三代CAR（见本章第五节）。第四代CAR是在第二代或者第三代CAR的基础上，串联细胞因子IL-12、可调控的CAR基因等组成的（见本章第五节）。

（二）TCR-T细胞治疗技术

TCR是一个多亚基的转膜复合物，能调节抗原特异性的T细胞激活。TCR是由两个不同的多肽链组成的，即TCR的α链和β链。这些多肽链都有一个N-末端的可变区域和一个恒定区。它们通过一个二硫键连接，每一个受体都提供一个单一的抗原结合位点。TCR通过识别抗原配体组成一个短的邻近的氨基酸序列。蛋白质通过主要组织相容性复合物分子（MHC）进行递呈。在大部分情况下，对于CD4来说主要是MHC-Ⅱ类分子，对于CD8来说主要是MHC-Ⅰ类分子（图1-7）^［13］。成功构建一种肿瘤特异性的TCR，需要确定一个适当的靶点序列。一种方法是用免疫转基因鼠表达人类HLA蛋白与人类肿瘤蛋白，诱导含有特异性TCR（可特异性地结合人类相应抗原）的T细胞产生^［14］。另一种可选择的方法是同种异体移植TCR基因，并可通过一些体外技术提高其肿瘤杀伤活性^［15］。关于TCR-T技术见本书第五章。

（三） CAR-T与TCR-T比较

CAR-T细胞的使用比TCR 转基因的方法有一些优势^［16］（如图1-8所示）。此外，CAR-T细胞识别技术独立于MHC的表达可以克服肿瘤免疫逃避的现象。比如CAR-T细胞技术包含有细胞外信号结构域能补充下游的癌症共刺激信号分子。此外，CAR不仅能靶向蛋白抗原，也可以靶向糖类和脂质抗原以及其他任何可以被抗体识别的抗原。

（1）两种方法的共同之处　基因工程修饰的T细胞；修饰的T细胞通过ACT（adoptive cell transfer therapy，过继细胞治疗）发挥杀伤作用；需要特异性的TAA靶点；都可以与CD3ζ相互作用刺激T细胞的应答。

（2）CAR-T细胞治疗的特点　HLA非依赖性；较高的结合亲和力；直接识别和杀伤肿瘤细胞；在体外能大量扩增和增殖的T细胞；在体内也有少量的扩增；不能识别细胞内的肿瘤抗原。

（3）TCR-T细胞治疗的特点　HLA限制性；较低的结合亲和力；TCR介导的抗原识别；能靶向细胞内的肿瘤抗原；具有MHC1。关于TCR-T细胞治疗见本书第五章。

（四）过继T细胞治疗技术流程

目前临床常使用三种过继T细胞治疗（adoptive T cell transfer，ACT）^［17］方法，分别是TILs（tumor-infiltrating lymphocytes）、TCR-T（T cell receptor，TCR） 细胞、CAR-T 细胞。ACT制备流程如图1-9所示。

从人体肿瘤组织中分离获得TIL，并进行体外扩增，鉴定后回输到患者体内，用于化疗和放射治疗后的患者免疫治疗。从患者体内分离T细胞，经基因修饰后在体外扩增培养成为TCR-T细胞或者CAR-T细胞，TCR-T细胞是为T细胞增加一个靶向肿瘤抗原的T细胞受体，TCR通过与CD3形成复合物传递激活信号，进一步通过MHC识别肿瘤抗原从而攻击肿瘤细胞。对于CAR而言，通过增加一个嵌合抗原受体来识别特异性的肿瘤抗原，CAR分子与肿瘤抗原识别，通过自身携带的共刺激信号增加T细胞的应答，再回输到患者体内^［18］。

目前肿瘤免疫治疗中使用肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）已经显示了初步的疗效。客观应答率（objective response rate，ORR）在转移性黑色素瘤中大约为50%，完全应答率（complete response，CR）范围在10%～20%，包括持续3年以上的CR^{［19，20］}。虽然TIL治疗具有一定疗效，但大部分患者并不适合使用TIL治疗，因为并不是所有的患者都存在有肿瘤浸润的T细胞，并且在许多癌症中，鉴定和获得肿瘤浸润T细胞是非常困难的。因此，为了克服这些不足，基因工程介导的CAR和TCR修饰的T细胞，成为可供选择的方法。在靶向CD19的CAR修饰T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）取得了明显的疗效，最高的CR可达90%。在应用基因修饰的TCR-T细胞进行的临床试验也已经取得了一定的疗效，但是应答率不尽相同。一个靶向NY-ESO1/HLA-A2的TCR-T细胞治疗转移性黑色素瘤的客观应答率为50%，而在转移性滑液细胞肉瘤中的应答率则高达70%，并且没有检测到明显的毒性^［21］。一些TCR-T细胞治疗临床试验也显示了一定的抗肿瘤应答，但是在一定情形下会对某些组织产生细胞毒性，若这些组织表达与导入的TCR靶抗原相同或者具有高度类似的抗原。