气相色谱测定挥发性脂肪酸的条件优化

张晓清，杨志岩，降升平

（天津科技大学现代分析技术研究中心，天津 300457）

挥发性脂肪酸（VFA）是指小分子有机脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、正丁酸等，具有较强的挥发性。厌氧发酵的产物主要有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等，在厌氧发酵过程中，VFA浓度及各种酸含量变化可以间接反映出厌氧发酵进程^[1]。因此灵敏、快速地测定VFA浓度及各种酸浓度是控制厌氧发酵进程的有效方式。另外，气相色谱快速、灵敏地测定挥发性脂肪酸在畜牧业^[2]及葡萄酒制造^[3]都有重要应用。

目前，测定挥发性脂肪酸的方法主要有纸色谱法、比色法、滴定法、柱色谱法以及气相色谱法等^[4]。其中，气相色谱法能够快速、灵敏的分析挥发性脂肪酸总量且能得到各酸含量，因此有较广泛应用^[5-7]。本研究利用单因素试验结合正交分析试验对气相色谱测定主要影响因素和条件进行优化，并以分离度和峰面积为指标量化评价，分析主要影响因素的影响规律，最终得到快速、准确的气相色谱操作条件，为实际应用提供可行的试验方法。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

仪器：气相色谱仪（GC9560）上海华爱色谱，FFAP毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.5μm），氢火焰离子化检测器（FID）。

试剂：甲酸（分析纯）相对密度1.22，含量88%。

混合酸标准储备液：乙醇（优级纯）3.55g/L、乙酸（分析纯）3.56g/L、丙酸（分析纯）3.72g/L、丁酸（分析纯）3.5g/L、异丁酸（分析纯）3.43g/L、异戊酸（分析纯）3.50g/L。

混合酸标准溶液：取10ml混合酸标准储备液与100ml容量瓶中，加入5ml甲酸，最后用超纯水定容。

1.2　实验方法

1.2.1　评价指标的测定方法

通过文献[8]可知分离度既能反映柱效能，又可以反映柱选择的总分离效能。分离度指相邻两组分色谱峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。根据公式（1）计算：

　　（1)

式中：为第n个峰的保留时间，min；W_n为第n个峰的峰宽，min；R_n为第n个峰的分离度。

R_n值愈大，表明两组分分离的愈完全。通常用R_n≥1.5说明两峰得到完全分离，R_n=1.5时，分离程度可达99.7%，表明相邻两组分已完全分离。研究中，通过预实验发现丙酸和异丁酸两者色谱峰比其他几种酸更难分离。因此，选择丙酸和异丁酸的分离度作为试验的分离度评价指标。

峰面积A用于组分的定量分析，可以直接反映试验的灵敏度，本研究以6种组分峰面积之和作为衡量指标。

1.2.2　单因素试验设计

通过文献[4,9]及预试验确定试验初始条件：分流比（30 : 1）、进样器温度250℃，FID检测器温度230℃、氢气压力60kPa、空气压力50kPa、尾吹气流量（30ml/min）、载气流量70ml/min、柱温190℃、进样量1μl。本研究在初始条件的基础上对柱温、载气流量、进样器温度和进样量依次进行单因素分析。

1.2.3　正交试验设计

在单因素试验确定的最佳色谱条件的基础上，选择单因素试验结果较好的3个条件为正交试验条件，以峰面积和分离度为评价指标，对气相色谱测定挥发性脂肪酸的条件进行优化。

2　结果与分析

2.1　单因素结果分析

2.1.1　柱温试验分析

柱温是气相色谱主要的影响因素，其条件的确定根据所测组分复杂程度及组分的汽化温度决定，使用毛细管柱分析多组分时一般采用程序升温。在多次试验基础上，设置5种柱温条件：（a）恒温190℃；（b）程序升温，初始温度130℃（停留1min），以10℃/min升至190℃（停留1min）；（c）程序升温，初始温度100℃（停留2min），以6℃/min升至190℃；（d）程序升温，初始100℃（停留2min），以10℃/min升至190℃（停留1min）；（e）程序升温，初始温度100℃（停留2min），以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）。考察5种柱温条件对试验结果的影响。绘制相关图表时柱温以a～e表示。试验结果如图1所示。

由图1可知，在条件a（恒温）下分离度及总面积值最低，色谱图中各酸未得到较好的分离且峰形较差；这表明恒温下不适用于毛细管色谱柱测定VFA。条件b与条件d的结果说明，不同的起始温度对分离度及灵敏度有影响。条件d与条件e的结果相比，不同的升温速率在测定VFA时，在分析速度、分离度及灵敏度都有较大的影响。条件e采用分段升温，分离度及总面积达到最大值。因此，条件以e作为单因素试验的最佳条件，并将条件c、d、e进行正交分析试验。

2.1.2　载气流量试验分析

载气流量作为气相色谱的重要参数，它对组分的保留时间（即分析效率）有重要影响。本试验参考所用仪器的常用载气流量，选取了50ml/min、60ml/min、75ml/min及90ml/min作为试验条件，试验结果如图2所示。

根据图2可知，总峰面积及分离度随着载气流量的增加而增加，在载气流量达到75ml/min时达到最大值，已经达到完全分离，灵敏度较高。当继续增加载气流量时，检测效果反而下降。由于载气流量对峰宽影响较大，过低的载气流量使峰宽展宽，造成峰拖尾。过高的载气流量是组分流失，影响测定的灵敏性。根据试验结果，选择75ml/min作为下面单因素试验条件，并选择60ml/min、75ml/min、90ml/min作为正交分析条件。

2.1.3　进样器温度试验分析

进样器温度设置依据待测组分的挥发性、沸点及稳定性，能够保证待测组分完全汽化而又不发生分解。进样器温度一般高于待测组分的沸点。VFA中最高沸点在180～190℃，因此，本试验中选定200℃、220℃、230℃和250℃作为单因素试验条件，试验结果如图3所示。

由图3可知，各温度的峰面积基本没有变化，峰面积相对标准偏差2.5%。因此进样口温度对峰面积影响较小，可以不予考虑。分离度呈现先减小后增大的趋势，在200℃和220℃时分离度R_n>1.5表明可以完全分离，因此选择200℃作为单因素试验的最佳条件。选择200℃、220℃及250℃作为正交分析的实验条件。

2.1.4　进样量试验分析

进样量的多少直接影响到检测的灵敏性，进样量过大容易色谱柱超载。液体进样在 0.5μl～2μl^[10]。试验选取0.5、1、1.5及2μl作为单因素试验条件，试验结果如图4所示。

从图4可以看出，进样量大于1.5μl时，峰面积的增长趋势缓；小于1.5μl时，随着进样量的增加，峰面积的增长趋势基本一致；分离度随着进样量的增加呈下降趋势。在进样量为1.5μl和2μl时，乙醇的色谱峰产生拖尾。因此，综合考虑选择1μl为单因素分析的最佳条件，并选择0.5μl、1μl及1.5μl作为正交试验条件。

2.2　正交试验结果及分析

以单因素试验确定的正交条件设计4因素3水平正交试验，正交水平如表1所示：

利用极差分析法对正交试验结果进行分析，正交试验结果及极差分析如表2所示。在分离度检测结果方面，VFA气相色谱检测的最优化条件是A3B3C2D2，即进样量1.5μl、柱温条件d、载气流量75ml/min和进样口温度220℃。比较4个因素得到的R值可知，进样口温度和柱温对分离度的影响较大，其他两个因素对结果影响较小。

在峰面积上，4个因素对VFA检测结果影响的主次顺序为：进样量>进样口温度>柱温>载气流量。最佳的优化条件为：进样量1.5μl、柱温条件e、载气流量为70ml/min、进样口温度250℃。

比较分离度及峰面积的最佳试验条件：在进样量为1.5μl下，其分离度为2.60>1.5，所以VFA的色谱峰可以完全分离。对于柱温条件，条件d和条件e下分离度为2.57、3.53，在两个条件下均可以完全分离，而两个条件下峰面积相差较大，所以综合考虑采用柱温条件e作为最佳试验条件。载气流量在70ml/min和75ml/min，从表2可知，各影响条件下，分离度都可达到完全分离，峰面积相差较小。而在70ml/min下，色谱峰峰形发生拖尾且保留时间延长，因此选用载气流量为75ml/min作为最佳载气流量条件。综合考虑各因素，确定气相色谱测定挥发性脂肪酸的最佳条件为：进样量1.5μl、载气流量75ml/min、柱温条件为程序升温：初始温度100℃（停留2min）以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）、进样口温度220℃。

2.3　优化条件的验证试验

在正交优化试验中得到的最佳气相色谱条件下，对VFA进行测定以验证条件的可行性。气相色谱图如图5所示。从图5可以看出，6种物质的峰形对称性较好，能够完全分离；乙醇的色谱峰没有产生严重拖尾。分析时间在10min之内，比已有报道^[11,12]的分析时间大大缩短。

2.4　精密度试验及标准曲线

利用正交试验优化得到的条件进行精密度试验，对同一VFA样品测定7次，分析结果如表3所示。在7次重复试验测定中VFA中各酸相对标准偏差<5%。在正交试验选定的气相色谱条件下各物质能够较好地分离，测定结果的重复性好，精密度高。

在优化最佳条件下，对不同浓度下的VFA样品进行测定，并绘制VFA标准曲线。取标准混合液0.5ml、1ml、3ml、5ml、7ml和10ml，加入5ml甲酸酸化后用超纯水稀释到100ml后进行测定，每个标样测定3次取平均值做VFA标准曲线。根据标准曲线得到的回归方程及相关系数如表4所示；标准曲线如图6所示。

从表4及图6中可以看出测定VFA时，各曲线的相关系数都大于0.99，曲线的拟合度较高，测定结果精确。在试验质量浓度范围内，VFA中各酸的浓度与峰面积呈现出良好的线性关系。

3　结论

本试验建立了利用FFAP毛细管柱气相色谱检测VFA定性及定量的方法。采用了单因素分析结合正交试验研究了柱温、载气流量、进样口温度及进样量对气相色谱测定挥发性脂肪酸检测结果的影响。试验以各酸测定的总面积及丙酸和异丁酸之间的分离度作为分析评价指标，在单因素确定的最佳条件的基础上进行正交试验。通过极差分析得到了气相色谱测定挥发性脂肪酸的最佳条件为：进样量1.5μl；载气流量75ml/min；柱温条件：程序升温［初始温度100℃（停留2min）以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）］；进样口温度220℃。最终检验结果证明，挥发性脂肪酸中各组分能够完全分离且峰形基本对称。本研究所得到的试验条件可以用于气相色谱测定挥发性脂肪酸。该方法的确立为实际厌氧发酵等行业的应用提供了参考依据。

参考文献

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作者简介：张晓清, 女, 高级实验师, Tel : 022-60912327, E-mail：zhangxiaoqing@tust.edu.cn