6.7 单核细胞增多性李氏杆菌

6.7.1 食品卫生学意义

李氏杆菌属包括7个种：单核细胞增多性李氏杆菌（Listeria monocytongenes）、绵羊李氏杆菌（L.ivanovii）、威尔斯李氏杆菌（L.welshimeri）、赛林格李氏杆菌（L.seeligeri）、无害李氏杆菌（L.innocua）、格氏李氏杆菌（L.grayi）、默氏李氏杆菌（L.murrayi），其中前两种有致病性，但仅有单核细胞增多性李氏杆菌可引起人的疾病。李氏杆菌属的代表种为单核细胞增多性李氏杆菌，该菌是人和动物李氏杆菌病的病原体，是致死性食物源性条件致病菌。怀孕妇女、新生儿、老年人和免疫力低下者易感染此病。人和家畜感染后主要表现为脑膜炎、败血症和流产；家禽和啮齿动物表现为坏死性肝炎和心肌炎。

单核细胞增多性李氏杆菌（以下简称李氏杆菌）广泛分布于自然界，在土壤、健康带菌者、动物的粪便、江河水、污水、蔬菜、青贮饲料及多种食品中分离出该菌，患病动物和带菌动物是本菌的主要传染源，患病动物的粪尿、精液以及眼、鼻、生殖道的分泌液都含有本菌，一旦污染到食品上，当人们接触和食入，即可发生感染。一般认为，李氏杆菌传播给人的主要途径是通过从水源到厨房的食物链中任何一个环节上的食品原料污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰淇淋、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，占85%～90%的病例是由被污染的食品引起的，生鲜蔬菜及乳制品风险更大一些。李氏杆菌在4～6℃低温下繁殖较快，对一般冷藏食品不能保证其安全性。

消毒牛奶污染率为21%，肉制品为30%，国内冰糕、雪糕中检出率为17.39%，家禽15%，水产品为4%～8%。由于本菌能在冰箱冷藏条件下生长繁殖，因此，冷藏对李氏杆菌并不是最好的抑制方法。销售、食品从业人员也可能是传染源，人粪便分离率为0.6%～1.6%，人群中短期带菌者占70%。李氏杆菌虽然食物感染或中毒的事件发生的较少，但其致死率较高，平均达33.3%，是细菌中致死率较高的一种。如2006年法国因食物感染引起67例死亡。

6.7.2 生物学特性

6.7.2.1 形态与染色特征

本菌大小为（0.4～0.5）μm×（0.5～2）μm。革兰氏染色阳性，老龄培养物呈阴性。形态与培养时间有关，37℃培养3～6h，菌体主要呈杆状，随后则以球形为主；3～5d的培养物学形成6 ～20μm的丝状；不产生芽胞。室温（20～25℃）时为4根鞭毛的周毛菌，运动活泼，呈特殊的滚动式；37℃时只有较少的鞭毛或1根鞭毛，运动缓慢。将细菌接种于半固体琼脂培养基，置于室温孵育，由于动力强，细菌自穿刺接种线向四周弥漫性生长，在离琼脂表面数毫米处出现一个倒伞形的“脐”状生长区，是本菌的特征之一（图6-7-1）。

6.7.2.2 培养特性

本菌为需氧和兼性厌氧菌，在22～37℃均能生长良好，生长温度范围是1～45℃，在4℃中亦能生长。根据此特性，可将污染众多杂菌的标本置4℃进行冷增菌，有利于本菌的分离。营养要求不高，普通培养基上均可生长，如加入少许葡萄糖、血液、肝浸出物则生长更好，最适pH为7.0～7.2。

血液琼脂：形成表面光滑、透明圆形的小菌落。绵羊血琼脂平板上菌落周围有狭窄的β溶血环。

肝汤琼脂：形成圆形、光滑、透明的小菌落。

血清肉汤：光滑型均匀混浊，粗糙型颗粒状生长。

在含有0.1%亚碲酸钾培养基上，菌落较小，呈黑色，边缘发绿。

6.7.2.3 生化特性

本菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、海藻糖、杨苷酸，产酸不产气。在3～10d内可发酵乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖、山梨醇和甘油，产酸。不液化明胶；不还原硝酸盐为亚硝酸盐；M.R和V-P试验均为阳性，不产生靛基质和硫化氢。

6.7.2.4 抗原构造与分型

李氏杆菌属具有菌体抗原和鞭毛抗原，菌体抗原以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、…Ⅻ表示之，鞭毛抗原以A、B、C、D表示之。不同的菌体抗原及鞭毛抗原组合成16个血清变种（表6-7-1）。

单核细胞增多性李氏杆菌具有12个血清变种：1/2a、1/2b、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7。其中人和动物感染的李氏杆菌病90%以上是由1/2a、1/2b、4b三种血清型所引起，其他的血清型经常可以从污染的食物中分离到（表6-7-1）。

6.7.2.5 致病性

（1）致病作用 李氏杆菌所引起疾病可分为中毒型和侵袭型两种，腹泻型主要表现为腹泻、腹痛及发热；侵袭型可引起脑膜炎、大脑炎、败血症，心内膜炎、流产、脓肿或局部性损伤等，且许多病症已证实是致死性的。免疫系统有缺陷、婴儿等易出现败血症、脑膜炎。孕妇可流产、死胎或婴儿健康不良，幸存的婴儿也易患脑膜炎，导致智力缺陷或死亡。少数病人仅表现流感样表现。病死率高达20%～50%，平均30%左右。李氏杆菌是典型的细胞内寄生菌，它能感染并能够侵入单核细胞和巨噬细胞内，也能够侵入许多非吞噬性哺乳动物细胞内。侵入宿主细胞以后，在细菌与细胞之间扩散（图6-7-2）。李氏杆菌的这种致病方式是由基因组编码的毒力因子所决定的，这些毒力因子包括李氏杆菌溶血素、磷脂酶C、内化素、触酶、SOD等。

（2）致病机制 单核细胞增多性李氏杆菌的致病因子现在已经了解很多，但还不是很全面，L.innocua（无害李氏杆菌）和单核细胞增多性李氏杆菌的基因组序列完成测序，不久的将来，李氏杆菌的分子致病机理将有明显的进展。李氏杆菌的感染模式：主要通过肠道感染，从肠道进入后第一侵害的靶器官-肝。在肝中李氏杆菌能大量繁殖，直到细胞免疫反应强烈后才停止。最常见的传播媒介是食品，作为经常刺激的抗原，身体中经常有抗李氏杆菌的记忆细胞，而对于免疫能力低下的患者，李氏杆菌长期在肝中，造成菌血症，导致侵入第二个靶器官——脑和怀孕的生殖道，直到引起临床疾病。单核细胞增多性李氏杆菌和绵羊李氏杆菌（L.ivonovii）是专性巨噬细胞内寄生，并可侵袭各种吞噬细胞，如上皮细胞，直接扩散到临近细胞，完成一个侵袭过程。这个过程包括：从吞噬泡中逃逸——快速在胞浆内繁殖——诱导肌动蛋白运动——直接扩散到临近细胞。然后再启动另一个循环。

在动物体内和体外几个实验中观察到单增李氏杆菌毒性粒子的异源性，但多数情况并不存在极大差别。从统计学观察，食品源性菌株与临床来源菌株的毒性粒子之间有明显差异，临床源性菌株有较低的致死剂量。另一方面，有大量证据表明李氏杆菌的抗原成分和致病性之间有相互联系。最明显的例子是L.ivanovii血清5能在所有反刍兽中见到，尤其是羊。在这些动物中，血清型5菌株引起产期感染，而不是脑炎，最典型例子是羊的李氏杆菌感染表现。进一步证据是人和动物超过90%的病例是由1/2a、1/2b、4b、4b型引起的，但菌株1/2（1/2a、1/2b、1/2c）主要见于污染的食品中。

许多观察提出了李氏杆菌菌株之间的致病趋向性的差别。在人的病例中，血清型4b常发生于胎儿，但与怀孕没有任何关系，在绵羊情况中，单增李氏杆菌感染具有两种临床表现形式：脑膜脑炎和流产，没有倾向于同时发生。从分子流行病学角度看和血清学分组情况看可大致分成三个组：

第一组（血清型1/2b、4b）包含所有食源性分离株，人和动物流行株；

第二组（血清型1/2a、1/2c、3a）包含从人和动物分离株，但不包含食源性分离株；

第三组（血清型4a）从动物分离株。

在第一组中有一个特殊的核型，所有血清型4b菌株都与食源性疾病流行有关，很少从反刍兽中分离出，从中可看出这种菌趋向于对人的致病性。在苏格兰的病例分析中也能证实这种趋势。

宿主的易感性在李氏杆菌病中起到重要作用，许多病例中都存在T-细胞介导的免疫学生理或病理缺陷。从这可以判断李氏杆菌属条件致病菌之类。最危险人群是怀孕妇女和新生儿、老弱（55～60岁或更老）、免疫缺陷患病衰弱者。在成年非怀孕者中，绝大多数病例（>75%）有如下情况：恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤或肉瘤），抗肿瘤化疗，免疫抑制治疗，慢性肝病（肝硬化，酒精中毒），肾病，糖尿病，胶原病（肺），艾滋病等最易感染李氏杆菌。在非怀孕成年艾滋病患者AIDS中有5%～20%有感染李氏杆菌记录，比普通人群患李氏杆菌病几率高300～1000倍。但总体来说艾滋病还是较少感染，可能的原因是艾滋病患者预防性饮食措施得力，抗生素性治疗等。

患者的健康状况影响李氏杆菌病的结果。免疫力好的病人可战胜李氏杆菌病，而衰弱的病人则容易感染。有时也与李氏杆菌病人中菌株存在的位置或李氏杆菌毒性强度有关。

李氏杆菌可以通过肠上皮细胞侵袭人体。也有口服10⁸～10⁹个菌体，并不侵袭上皮细胞。李氏杆菌从M-肠上皮细胞作为进入口，直接证据是镜下见有李氏杆菌通过M-细胞穿过肠壁。但是李氏杆菌这种穿过作用并不明显，仅有较少的菌体穿过。

李氏杆菌通过肠道屏蔽，通过淋巴、血液到肠系膜淋巴结、脾、肝。如上所述，初期李氏杆菌在宿主组织中的居化作用快，口服后，由于此过程至发病时具有较长时间的潜伏期。对鼠试验性静脉感染，李氏杆菌被肝、脾中的巨噬细胞快速地从血流中清除掉，大约90%的菌体聚集在肝中，主要是被窦状隙中Kupffer细胞捕获，大多数菌体被这些细胞杀死，并不是所有的李氏杆菌都能被破坏，也有的在体内器官中生长、繁殖。

在肝中细菌主要增殖的地点是肝细胞，这种观点否定了长期以来一直认为李氏杆菌增殖地点是巨噬细胞的观点。经过肠道屏蔽异位运动后，经肝门或动脉血流接近肝脏实质的最可能的途径是Kupffer细胞——细胞到细胞途径。

经窦状隙以后，经狄氏腔隙直接侵入肝细胞。在体外试验中证实李氏杆菌有效的侵入肝脏。电镜观察肝组织可看到：在肝细胞中李氏杆菌完成细胞内感染循环，包括肌动蛋白菌体尾部聚集及胞内运动扩散。从肝细胞到肝细胞直接胞内感染方式导致感染病灶的形成。李氏杆菌扩散进肝实质未经过免疫系统的体液效应，这就能解释了在李氏杆菌免疫中抗体并不起主要作用。

（3）毒性因子

① 溶血素（hemolysin）李氏杆菌溶血素（LLO）是一种多功能毒性粒子，在宿主寄生物的反应中比吞噬泡破裂具有更加重要的作用。外源性和内源性接触LLO能诱导宿主细胞的许多反应，如细胞增殖，转染纤维细胞中心形成作用，肠细胞中黏膜细胞外渗作用，经钙信号的内化作用调节，在巨噬细胞中细胞因子的表达，树突细胞中的凋亡，磷脂代谢等作用。在对李氏杆菌感染的保护性免疫反应中LLO起到一个关键作用，方式有两种：一种是LLO介导细菌向泡液中释放和随后的胞内增长，对于主要的组织相容复合物（MHC）第Ⅰ型——限制李氏杆菌抗原的存在，并能诱导特异性保护性细胞毒CD8+T细胞产生；第二种是LLO本身就是CD8+李氏杆菌特异性识别的保护性抗原。

② 磷脂酶（PLc）李氏杆菌具有三种主要的磷脂酶即PLcA、PLcB、SMcl。无溶血素（Hly）的李氏杆菌能逃逸吞噬泡进入胞浆，并在人一定的上皮细胞内生长，说明李氏杆菌膜活性能产生破坏吞噬泡更强的活性，它能用磷脂酶将吞噬泡膜破坏。Hly能有效破坏第一次的吞噬泡膜。PLcB也可以介导细胞中吞噬泡中李氏杆菌的逃逸，它能将第二个空泡膜溶解，从而对李氏杆菌细胞-细胞之间的传播起到关键的作用。从巨噬细胞扩散到不同哺乳动物细胞的胞内扩散，PLcB是必需的，包括微血管内皮细胞。PLcB毒性作用相对较小，仅在从吞噬泡中逃逸时起到一定作用。SMcL介导第一次空泡破裂和将菌体释放到胞浆中。PLc对李氏杆菌选择适应宿主细胞、菌体胞内生长时的组织炎性反应和宿主组织居住化等过程中具有重要作用。PLc能破坏宿主细胞信号通道。

③ 肌动蛋白调节因子（ActA）在宿主细胞内李氏杆菌利用ActA将细胞内的肌动蛋白汇聚于自己菌体尾部，变成菌体的前进动力，使菌体向前运动，并顶着宿主细胞膜镶嵌入另一个细胞内，从而使下一个细胞形成吞噬泡，菌体进入下一个细胞内。因此，ActA是细胞内寄生菌必不可少的侵袭性元素之一。

④ 内化素（internalin）李氏杆菌的内化素有InIA和InIB两种，能够使菌体内化入宿主细胞内。

其他的毒性因子还有IP60、抗氧化因子、铁还原酶应急反应介质、PrfA等。这些因子的致病作用有的已经很清楚。

（4）抵抗力 本菌在青贮饲料、干草、干燥土壤和粪便中能长期存活。对碱和盐耐受性较大，在pH9.6的10%食盐溶液中能生存。在4℃时于20%食盐溶液内可存活8周。对温度和一般消毒药抵抗力不强，85℃经40s，59℃经10min死亡。3%石炭酸，70%酒精及其他常用消毒药的一般浓度均能杀死。对氨苄青霉素、先锋霉素、氯霉素、红霉素等敏感。

6.7.3 细菌学检验

① 镜检 采取检样直接涂片，进行革兰氏染色，镜检如发现散在的、呈V型排列的或并列的革兰氏阳性的小杆菌，可以作出初步诊断。

② 分离培养 取上述检样划线接种于0.5%～1%葡萄糖琼脂或0.05%亚碲酸钾胰蛋白胨琼脂平板上，37℃培养后挑取典型菌落进行鉴定。

③ 免疫学检测 1992年Bessesen等利用淋巴细胞杂交瘤技术，首次制备了一株能稳定分泌抗单核细胞增多性李氏杆菌特异单克隆抗体的细胞株EM-7G1，所针对的蛋白质分子量为60kDa。以此特异性单克隆抗体建立的夹心ELISA方法能于20～24h内检测出8～10个菌体/mL，这在致病性李氏杆菌的检测方面实现了一次重大突破，第一次利用免疫学方法把单核细胞增多性李氏杆菌与非致病性李氏杆菌分开。此后Katharion等于1994年报道3株单核细胞增多性李氏杆菌4b血清型的高度特异的单克隆抗体。经广泛的流行病学调查证实，在引起人畜共患李氏杆菌病的病原中，4b血清型占了约40%，因此，以上三株单克隆抗体的研制为从现场检出单核细胞增多性李氏杆菌无疑有重要的意义。

④ 聚合酶链反应（PCR）和连接酶链反应（LCR）Bessesen等利用已克隆出的溶血素基因片段（606bp），设计出长度为24bp的引物，扩增30个循环。扩增后，PCR产物的量从扩增前的18ng提高至1.8μg。以PCR方法检测95株单核细胞增多性李氏杆菌，全部呈阳性。12株其余种的李氏杆菌和非李氏杆菌的PCR产物经凝胶电泳证实没有606bp的溶血素基因的片段。当样品中单核细胞增多性李氏杆菌的浓度达到10⁵个/mL时，即可成功地进行此基因片段的扩增。随后，Wiedman等利用连接酶链反应（LCR）来检测此菌，单核细胞增多性李氏杆菌的16S rRNA基因与无害李氏杆菌16S rRNA基因十分相似，只有V2区域193位和V9区域1259位碱基不同，但与其余种的李氏杆菌的l6S rRNA基因差别很大。根据V9区域1259位碱基不同，以此位点的上下游序列各符合成两对引物，并分别以³²P ATP标记3'末瑞。为提高检测的敏感性，可先进行PCR扩增16S rDNA，再以扩增产物进行LCR。特异的Taq聚合酶可连接以单核细胞增多性李氏杆菌设计出的两段引物，再经凝胶电泳和放射自显影，可检出连接片段，无害李氏杆菌却没有连接产物检出。他们用LCR检测李氏杆菌属内的不同种，证实LCR对单核细胞增多性李氏杆菌有高度的特异性，且12h内能报告LCR结果。不久以后，他们又改进检测LCR产物的检测系统，以lumi-phose.530和p-npp代替放射性同位素来标记引物，以LCR产物在450nm时不同的光密度来区分单核细胞增多性李氏杆菌和无害李氏杆菌，前者OD值高于后者2倍以上即可判为阳性，改良后的方法3h内可报告LCR的结果。

Fluit建立了一种新的检测系统-磁免疫PCR（MIPA）。以单核细胞增多性李氏杆菌的单抗MAb55包被磁珠，直接从样品中分离以上两种细菌，经裂解，细菌释放出DNA，以溶血素O基因和迟发型变态反应（DTH）基因来设计引物，经30个循环，即可得到单核细胞增多性李氏杆菌的PCR产物，样品中污染了一个菌即可检测出来，十分敏感、特异，且缩短了检测时间。

6.7.4 卫生评价与处理

① 动物头和其他所有患病部分剔除作工业用或销毁，肉尸高温处理后出场。

② 出现李氏杆菌病症状的牲畜，一般不能作为食用，但恢复健康的允许宰杀。

对于生鲜蔬菜特别是有机蔬菜一定要洗净；使用乳制品要注意灭菌是否彻底。