²²⁶镭衰变产生的放射性惰性气体 ²²²氡,因其放射的特性,氡作为一种天然的水生示踪的应用程序得到广泛应用。所有岩石或土壤中都含有氡,人们时刻都在氡气的包围之中；氡及其副产物损害着人体呼吸道,造血系统,消化道,甚至导致肺癌。由此可见,开展对氡浓度检测具有非常重要的卫生学意义。

目前,对于氡浓度的检测基本上都是针对放射粒子的检测,有关被动的集成式氡探测器主要是有活性炭盒法、α径迹蚀刻法和驻极体探测法。但是由于仪器设备太大,时间周期长,对检测人员有伤害等原因使得氡浓度的现行检测方法的实用性有待提高,研发简便适用的检测新方法刻不容缓。

本课题组选择富G序列游离核酸单链PW17为铅离子识别探针,花青染料OliGreen（OG）为信号反应器,二者作用产生强荧光；当引入氡的子体铅时,Pb ²⁺诱导核酸单链PW17形成G-四联体,抑制PW17与OG的相互作用,导致测定体系荧光强度明显减弱,通过荧光强度的变化,传导测定体系中子体铅的浓度变化,实现对环境中非金属放射性惰性气体氡辐射强度的检测。方法对铅离子的检出限为3.2×10 ^-7g/L,是一种超灵敏非标记荧光传感检测氡的新方法。

氡室（南华大学核工业第六研究所）。F-4500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）。扫描速度1200nm/min,最大激发波长500nm,狭缝5nm,发射波长524nm,狭缝10nm。JASCO-815圆二色谱仪（日本JASCO公司）,扫描速度200nm/min。

有文献报道了铅离子与DNA作用性能。本课题组选择了可与铅离子绑定形成G-四联体的PW17,对照物R是一个与PW17长短相同的随机链,由生工生物工程（上海）股份有限公司合成,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化。序列：PW17（5′-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3′）；R（5′-ATCGAAATTCGCATCGG-3′）。核酸链用超纯水稀释成浓度为100μM,4℃储存；临用前,再用超纯水将其稀释至1μM工作溶液。OG染料（Molecular robes公司）；浓度定义为2000×,储存于-20℃；实验前用超纯水稀释至20×作为工作浓度。游离的OG因为量子收益率低于百分之一,所以几乎没有荧光的,但是当它绑定在单链DNA上时,荧光放大1000倍以上。尽管OG与游离单链适配体具有很强的相互作用,但当适配体结构发生变化时,荧光强度将随之改变。

铅标准溶液（中国计量科学院）,100μg/ml,用超纯水稀释成100μg/L铅离子工作溶液。三羟甲基氨基甲烷（Tris）,纯度≥99.9%,购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸,优级纯,购于国药集团化学试剂有限公司；Tris-HNO ₃缓冲溶液,1M,pH 7.2。Bi（NO ₃） ₃·5H ₂O（五水合硝酸铋）产于广东光华科技股份有限公司,纯度≥99%。

混合纤维素膜（Merck Millipore Ltd.）：0.8um孔径。

所有试剂均用超纯水配制,4℃冰箱保存。

于15ml塑料离心管中加入14ml超纯水,用0.8μm孔径的混合纤维素膜覆盖管口,用胶带固定,暴露于氡实验室采样。氡子体的活度中位空气动力学直径（AMAD）均不超过1μm,马晓等人的研究表明,0.8μm孔径的混合纤维素膜能够阻挡氡实验室空气中已经存在的99.9%以上的氡子体,只允许氡等气体和各种放射性粒子通过进入采样器。样品取回后,密封、室温放置四天后检测子体铅,以利采集的氡气都能经过半衰期,使样品系统更稳定。四天之后,取出2000μl样品溶液,加入4μl浓硝酸,稍后加1MTris缓冲溶液至pH 7.2,存于4℃冰箱待测。

由于本方法是用超纯水采样,采样时用混合纤维素膜覆盖管口,阻止了其他干扰物质进入样液,因此,样品溶液中几乎没有其他干扰因素,可直接测定。

临用前,先将DNA工作溶液置于95℃水浴加热5分钟,使溶液中的DNA都处于展开状态,到时取出,于空气中冷却至室温,备用。

取一系列EP管,向各管加入适量的铅离子溶液,形成0～35μg/L的铅离子浓度梯度。再向各管分别加入1μM PW17工作溶液16μl,pH 7.2的Tris-HNO ₃溶液25μl,加超纯水至180μl,混匀,室温放置30分钟后,加入20×OG染料20μl。

选择激发波长为500nm,524nm发射光处测定各管荧光强度（ F）,绘制标准曲线,建立线性回归方程。

取不同氡暴露时间样品溶液74μl,按照“1.2.2铅离子浓度检测”方法,测定各样品溶液的荧光强度（ F）,建立 F- D曲线。

图1-5表达了基于Pb ²⁺诱导核酸单链PW17转换G-四联体非标记荧光传感超灵敏检测氡的方法原理,图1-6.A中5个实验结果证实了原理分析的正确性。信号反应器染料OG是弱荧光物质,图1-6A中（由上至下）曲线5的荧光强度值接近于0；OG与富G序列游离核酸单链PW17的结合产物具有强荧光（曲线1）。当向“PW17+OG”反应体系加入Pb ²⁺离子时,Pb ²⁺诱导核酸适配体PW17发生构象变化,形成G-四联体,抑制了PW17与OG的相互作用,“PW17+Pb ²⁺+OG”测定体系的荧光强度明显减弱（曲线4）,形成一种单链非标记荧光生物传感器。

氡辐射 α、 β粒子后,衰变成为子体 ²¹⁰Pb：

向“PW17+OG”反应体系加入氡辐射样品溶液,曲线3“PW17+sample+OG”体系的荧光强度也明显降低,曲线形貌与曲线5相同,表明氡样品溶液中存在Pb ²⁺,诱导核酸适配体PW17形成了G-四联体；同时,我们用ICP-MS和原子荧光两种方法检测样品,都检出了氡辐射后的稳定子体铅。

在Pb ²⁺与Bi ³⁺的对比试验中,向“PW17+OG”反应体系加入等量的Bi ³⁺,发现“PW17+OG”和“PW17+Bi ³⁺+OG”的荧光值几乎相同,对应图1-6 A中曲线1与2重叠,表明微量铋离子不能诱导核酸适配体PW17形成G-四联体,对铅的测定无干扰；提示“PW17+Pb ²⁺+OG”体系荧光强度降低,是由铅离子引起的。

用R取代PW17进行对比试验发现,“R+OG”、“R+sample+OG”和“R+Pb ²⁺+OG”三种测定体系具有相同的强荧光,对应图1-6B中的三条曲线近乎重叠,基本上没什么变化,从而进一步证明,Pb ²⁺可以诱导核酸适配体PW17形成了G-四联体,但不能诱导R形成G-四联体；也证明,这类测定体系荧光值的变化,与金属离子有关,也与DNA是否发生结构变化有关,不是因为重金属固有荧光猝灭的特性。

对引入和不引入Pb ²⁺的单链PW17测定溶液分别进行扫描,获得圆二色谱图。由图1-7可见,加入少量铅离子后,曲线1转变成了曲线2；曲线2在310nm出现了一个正峰,这些特点都与Pb ²⁺诱导探针形成反向平行的G-四联体相一致,证明是铅离子诱导探针PW17形成了G-四联体,抑制了PW17与OG的结合,导致荧光强度减弱。圆二色谱特征支持“2.1”的相关分析。

为了体系更加稳定且灵敏,对各个实验条件进行了优化。如图1-8 A是DNA与OG反应的用量比例。按照实验方法加入染料OG,当DNA用量由30nM增加到50nM时,体系相对荧光强度明显增大。这是因为随着DNA浓度的不断增加,铅离子转化形成G-四联体的PW17数量比例逐渐降低,与OG结合呈现荧光的核酸链增加,导致了相对荧光强度增强。随着加入DNA的量继续增加,核酸链与染料结合而逐渐升高的强荧光背景下,铅离子诱导的荧光猝灭作用被慢慢忽视,即相对荧光强度减弱。对于染料（图1-8 B）,少量存在的OG与PW17达到饱和前,加入的OG全部都能结合到游离卷曲的核酸链上,引入铅离子前后荧光值的变化不大,因此相对荧光强度低。而图中染料和核酸链出现最适比例后继续增加OG的量,相对荧光强度反而下降,可能是因为加入过多的OG结合到铅离子诱导的G-四联体上,使背景荧光值增加而变化减少。通过对荧光强度的比较并考虑到实验的稳定性,实验选择了PW17和OG分别处于平台期的终浓度分别为80nM和0.9×。

在氡样品溶液的处理过程中,需要加入HNO ₃溶解采集的氡子体铅,而强酸性条件不仅对染料有影响,还可能促使核酸链水解；考虑K ⁺、Na ⁺等也可以诱导富G序列形成G-四联体,因此,我们避免使用NaOH、KOH等常用的强碱调节测定溶液的酸度,选用影响较小的Tris-HNO ₃缓冲溶液调节样液pH。

在碱性条件下,Pb ²⁺水解形成氢氧化铅沉淀,因此,我们选择最佳pH范围为pH=6.5～7.5。图1-9A表明,相对荧光强度随着pH的改变而变化,在pH=7.1～7.3处变化较小。测定体系中Tris的浓度对实验也有影响（图1-9B）,随着Tris的浓度的增加,相对荧光强度逐渐降低,且在其浓度 c=5～15mM处出现了平台。因缓冲溶液的加入量较大,选择加入12.5mM的Tris-HNO ₃溶液至pH=7.2。

Pb ²⁺诱导DNA形成G-四聚体的反应时间、染料结合单链的反应时间对体系荧光测定结果有较的大影响。在图1-9C中,随着反应时间的增加,溶液中游离卷曲的PW17形成G-四联体的量也增加,使得OG结合的单链减少,荧光强度（ F）减弱,相对荧光强度（ F ₀- F）/ F ₀增强。30分钟达到最大值后,可能由于重力作用等使得铅离子与DNA的结合能力减弱,相对荧光强度逐渐降低。

图1-9D反映了染料OG加入时间对相对荧光强度变化的影响。在加入染料后,相对荧光强度随着时间的增加而逐渐减弱。刚加入的染料会立即与卷曲游离的单链结合,荧光值变化非常大。而随着时间的不断增加,OG可能会与G四联体结合使得荧光值变化减小,溶液中的各种物质也会对OG产生影响使得荧光值整体下降,导致相对荧光强度减弱。选择加入样品室温孵育半小时后,与OG混匀并立刻进行检测。

在优化条件下,随着Pb ²⁺浓度增加,测定体系的荧光强度逐渐降低。524nm处测得的荧光值对应Pb ²⁺浓度的标准曲线如图1-10A所示,探针在1.07-10μg/L的低浓度范围内,两者存在良好的线性关系：线性方程为 F=-41.44 c（×10 ^-6g/L）+1703.63,R ²=0.9987,用LOD=3σ/S方法算出检出限为0.32μg/L。分别用Pb ²⁺离子浓度为1.87×10 ^-6、4.29×10 ^-6、8.72×10 ^-6平行测定10次,得到的RDS值依次为1.2%,1.23%,1.5%。

按照采样方法在氡实验室采集氡样,获得暴露量分别为2.23、8.33、18.26、30.69、46.84（×10 ⁴）Bq的样品,按照“1.2.2铅离子浓度检测”方法检测各样品溶液的荧光强度（ F）。

如图1-11所示,随着暴露量的增加,样品中氡子体铅的浓度增加,样品溶液的荧光强度随之下降；随着暴露时间的增加,暴露量增加幅度越来越大,但 F值下降的幅度逐渐减小,荧光强度与氡暴露量之间呈单指数衰减关系：

与放射性物质的指数性衰变相吻合。

汞离子、银离子等可改变适配体的构型,干扰Pb ²⁺的准确测定。为了排除干扰因素的影响,本研究在氡衰变子体Pb的采样装置中,用0.8μm孔径的混合纤维素膜覆盖采集管口,只允许氡辐射进入采样管,阻止了其他干扰物的进入,排除了干扰离子对氡样品测定的影响。表1-1显示加标回收率分别为103.75%、105.00%、97.50%、105.00%、106.25%,表明方法测定干扰小,结果准确可靠。

单链核酸适配体PW17与染料OG反应产生强荧光。Pb ²⁺诱导PW17由游离卷曲的单链转变成为稳定的G-四联体,抑制其与荧光染料结合,体系荧光强度减弱。据此本文研制了Pb ²⁺诱导核酸单链PW17转换G-四联体非标记荧光传感器,可超灵敏检测铅检出限129.69ng/L。

基于氡衰变形成子体铅,Pb ²⁺对核酸单链PW17构型转变的诱导作用,本文建立了氡辐射的高选择性非标记荧光传感检测新方法；开拓了核酸适配体对无机物、惰性气体和放射性物质的生物分析新领域。