第四节　成体干细胞

成体干细胞（adult stem cell，ASC）是存在于胎儿和成体不同组织内的多潜能干细胞，这些细胞具有自我复制能力，并能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用。一般根据其来源或分化的组织细胞命名，如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、心脏干细胞、骨及软骨干细胞、骨骼肌干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、胃肠干细胞、前列腺干细胞、气管干细胞、角膜干细胞、血管内皮干细胞、牙髓干细胞等。由于ASC一般不存在成瘤和伦理学压力，并且同样具有多潜能性，自体移植不存在免疫排斥，ASC和胚胎干细胞相比，也许在自体细胞替代治疗方面会具有更多的优越性。特别是骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞等间充质干细胞，由于其采集容易，并能在体外大量扩增，而且具有较大的可塑性，将为再生医学治疗提供大量的种子细胞。

一、成体干细胞研究与发展

最早于1960年提出ASC的概念。当时，首次发现骨髓中定居着某些特殊的细胞，在特定的环境条件和其他因素作用下，能够诱导分化并重建所有血液细胞的功能，随后逐渐完成了对造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的鉴定和分离工作。HSC是目前研究得最为清楚、应用最为成熟的ASC，它在移植治疗血液系统及其他系统恶性肿瘤、自身免疫病和遗传性疾病等方面均取得令人瞩目的进展，极大促进了这些疾病的治疗，同时也为其他类型ASC的研究和应用奠定了坚实的基础。此后，人们陆续发现了多种ASC，如间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、毛囊干细胞（hair follicle stem cell，HFSC）、心肌干细胞（cardiomyogenic stem cell，CSC）、肝干细胞（liver stem cell，LSC）等。研究发现，成体细胞的生化特性与其所在组织的类型密切相关，可以通过一些特异表达的细胞表面分子鉴定 ASC。如Ⅵ型中间丝蛋白、CD233和CD24是神经干细胞的特异标志物，体外培养的ACl33+/CD24+细胞可以进一步分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。再如骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD166等分子，在体外培养环境中可以分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等。由于技术手段和研究方法的局限。目前，对ASC表达特异分子的研究还不够深入，还不能采用各胚层和各种ASC的特异标志物完全分离和鉴定不同来源的ASC（图2-19）。

成体干细胞的研究近几年发展很快，已有不少临床应用的报道。从脐带血中分离造血干细胞治疗血液病已取得成功。从脑组织、脊髓组织中分离出的神经干细胞在动物实验中已证实具有促进神经再生能力。从嗅鞘中分离出的嗅鞘细胞能生长出突触，穿过瘢痕组织生长，具有良好的促进中枢神经再生并重新建立传导功能的能力。肌肉干细胞局部注射治疗肌营养不良症、心肌缺血已有临床应用报道。自体骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cell，MSC）通过局部心肌内注射、冠状动脉注射促进心肌再生与血管化已有大量研究及部分临床应用。MSC促进缺血肢体重建血液循环在临床上已获得成功。

无论是组织细胞或干细胞治疗，已经显示了良好的组织再生能力，但要使细胞治疗达到更好的临床效果，或完全再生一个新的组织或器官还有很大困难，主要存在以下问题：①细胞获取后的大量扩增、干细胞的定向诱导分化常需添加外源性物质，其安全性研究还停留在细胞水平。是否会引起基因水平的改变尚未引起足够的重视。②无论是组织细胞或干细胞，不管通过什么途径注入体内，需要与受体组织细胞黏附、融合、发挥功能，但注入细胞与受体组织融合率极低，在心肌大约为7%，而且注入心肌的细胞能否转化为心肌细胞至今尚在争论中，因此，提高细胞治疗的效率是尚待研究的问题；如果采用静脉或动脉途径注射细胞，还需研究其靶向性。③同种异体细胞移植具有来源广泛、获得容易及可以库存备用进行群体化治疗的优点，但必须克服其免疫排斥反应。

二、成体干细胞的生物学特性

1.成体干细胞具有组织定向分化能力和特定组织定居能力

ASC具备以下三个重要的生物学特征：①能够自我更新：ASC通过分裂增殖，产生与其完全相同的子代细胞，有效地维持了ASC群体数量和功能的稳定性。②具有谱系定向分化能力：ASC可以进一步分化为专能干细胞，最终成为终末分化细胞。组织中细胞分化的过程实际上是ASC获得特定组织细胞形态、表型以及功能特征的过程。许多ASC具有一定的多向分化特性，能够分化为特定组织中的多种细胞类型。③体内各ASC具有在特定组织定居的能力：ASC可对组织再生的特异刺激和信号分子产生应答，分化为特定类型的组织细胞，替代受损细胞或死亡细胞的功能。

2.成体干细胞的多分化潜能和可塑性

传统的干细胞发育理论认为，组织干细胞是胚胎发育至原肠胚（gastrulation）形成以后出现的，因此，组织干细胞不是分化全能细胞，只具有组织特异的有限的分化能力，只能分化为所在组织的特定细胞类型。但近来的实验研究表明，某些情况下，骨髓间充质干细胞可以跨胚层向肝脏、心脏、胰腺或神经系统的细胞分化，而肌肉、神经干细胞也可以向造血干细胞分化。目前将组织干细胞这种跨谱系甚至跨胚层分化的潜能，称为组织干细胞的可塑性（plasticity）。也就是ASC具有向两个和两个以上胚层细胞分化的能力。目前，人们观察和了解ASC的可塑性主要来自于两方面，一是体外培养，二是在体诱导。如早期发现骨髓单个核细胞在一定条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞等，如果将这些细胞进行传代培养，可仍保持多向分化潜能。在体移植研究以MSC为例，已发现MSC经诱导可分化产生骨骼肌、心肌细胞、肺上皮细胞、皮肤以及神经细胞等，提示MSC这种可塑性具有一定的广泛性和代表性。更令人惊奇的是，Jiang等将从骨髓分离纯化的成体多能前体细胞经体外诱导产生出了具有三个胚层来源特性的功能细胞，由于在体研究也有相似的结果，从而在实验上更进一步证实了ASC的多向分化潜能。但是，不同ASC其可塑性差异很大，而且绝大部分ASC很难在体内诱导出其可塑性（图2-20）。

三、成体干细胞多分化潜能的机制

ASC的多分化潜能机制尚不完全清楚，可能与以下几方面有关。

1.ASC的来源

目前发现，大多数组织中栖息着单向或多向分化潜能的组织干细胞。一般认为，ASC来源于胚胎发育不同时期的干细胞。在个体的器官和组织发生过程中，某些干细胞可能先后离开所在群体的分化、增殖进程，迁移并定居在特定器官或器官雏形中的某个位置，并保留自己的干细胞特性，形成ASC。ASC在微环境的作用下多数时间处于静息状态，一旦所定居的组织需要再生或修复，便在特定微环境下被激活并分化成所需的功能细胞。

2.ASC的转分化和去分化

转分化（transdifferentiation）是指ASC通过活化其他潜在的分化程序改变了ASC的特定谱系分化的进程而转分化为其他谱系。造血干细胞向非造血组织细胞分化，神经干细胞向血液系统细胞分化都是ASC转分化的例子。转分化是一种已分化细胞关闭原有基因活动程序，同时转向另一种分化细胞基因活动程序，而不需要回复到原始的状态。未分化的ASC可能具有足够的可塑性以成为另一谱系细胞，或者ASC为了再决定需要去分化到具有可塑性的某个更原始状态，以后重新分化为其他细胞谱系类型。无论这两个过程的哪一个，其重新选择的过程称为转决定（transdetermination）。在这里，作者更愿意用谱系转化（lineage convertion）来命名这样的预期细胞类型的变化，这个术语不涉及变化过程所可能涉及的机制。去分化（dedifferentiation）是分化成熟细胞首先逆转为相对原始分化的细胞，然后再按新的细胞谱系分化通路进行分化的过程。如两栖类生物蝾螈（Salamander）肢体切除伤口边缘的分化成熟细胞能够逆分化成原始细胞，再形成新生的ASC，最后分化为被切除的肢体组织。但是，正常生理状态下，成年哺乳动物的ASC转分化或去分化的现象较为少见。其机制也还有待进一步研究。

3.ASC的多样性

特定组织中有可能存在其他谱系来源的ASC，如骨髓或肌肉的细胞可能包括了多种组织干细胞，包括造血干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和肌肉干细胞等。另外，造血干细胞不仅仅定位于骨髓中，它可以随着血液循环被一些组织器官，如肌肉和脾脏等摄取并定居于该区域。一些特定组织中共存的其他组织干细胞能够按照自己的定向需要，分化为与该特定组织不同的其他细胞类型，如造血干细胞、神经干细胞、胰腺干细胞等。

4.ASC的细胞融合

一种细胞可以通过与其他细胞的相互融合而表现出另一种细胞的生物学特性。体外培养条件下，成年哺乳动物细胞存在细胞融合现象，如成肌细胞在破骨细胞作用下，细胞融合后形成多核的骨骼肌纤维；感染HIV的T细胞与靶细胞的融合能够介导病毒进入靶细胞等；体外培养的胚胎干细胞能够自发地与神经干细胞融合，并且还能将供体细胞的分子标志物移至融合细胞中。因此，如果一种组织中含有其他类型的组织干细胞，那么不同的组织干细胞可以通过相互融合而表现出与组织类型不同的细胞特性。但体内细胞自然融合的发生率较低，对其在组织干细胞可塑性的影响还需要深入研究。

目前，对组织干细胞可塑性的认识不够深入，尚需建立组织干细胞的分离、纯化和功能鉴定的成熟技术和体外维持组织干细胞未分化状态的模型，成体干细胞可塑性的机制和生物学意义还有待进一步研究。

四、成体干细胞分化潜能具有一定的局限性

由于ASC的获取及培养体系已经建立，并且成瘤性等潜在风险较低，因此ASC在临床治疗过程中取得了一定的进展，如造血干细胞移植已成为治疗白血病的主要手段。在2008年，Macchiarini等报道利用患者自体干细胞，在胶原骨架上构建成体气管组织，然后移植到患者因肺结核而被破坏的气管患处，成功地再生了这种患者的气管组织，获得了良好的治疗效果。ASC研究不涉及伦理问题，便于临床应用，但也有其自身局限性。一般ASC在体内含量极微，很难分离和纯化，数量随年龄增长而减少，而且至今未能从人体的全部组织中分离出ASC，所以很多组织器官的损伤或功能障碍不能通过移植ASC来解决，而且ASC分化局限性也限制了其临床应用。

五、年龄对成体细胞再生能力的影响

机体通过再生或纤维化修复组织的能力随年龄增长逐渐降低。随着年龄的增长，组织的各种细胞遭受氧化应激压力，细胞内固有的改变和环境损伤导致细胞内自由基和抗氧化系统不平衡性增加。这种不平衡引起细胞、组织系统结构和功能的改变。在哺乳动物，改变发生于各个器官，最容易看到的是皮肤的改变，毛发再生减少，表皮周转率减低，真皮的蛋白聚糖厚度、弹性、水化作用减小，各种良性病变增加，太阳中紫外线的过度照射，又使这些改变加剧。并且，随着年龄增长基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）引起的伤口收缩减少和胶原重塑增加。在大鼠中，随着年龄增长，伤口修复能力减低，这种减低伴随着祖细胞数量减少和对生物活性分子应答的降低。年龄偏大的患者骨髓形成成骨细胞集落的能力降低。损伤后，骨髓中被动员起来的成骨祖细胞减少。

一个很明显的问题是再生能力的下降是否由于具有再生能力的细胞减少所导致，或者是随着环境的恶化，细胞本身应答再生需求的能力在减少，或者这些原因综合起来所导致。这个问题的答案对基于使用成人有再生能力细胞的再生医学策略很关键。如果再生能力的下降是由于细胞数量减少和细胞本身再生能力下降引起，它们潜在的治疗价值，随着年龄的增长会逐渐减小。相反，如果细胞数量和细胞本身再生能力不随年龄而改变，那么将可以向年长个体提供年轻的因子来维持其再生效率。目前，正在小鼠中用异种联体技术研究年龄对再生系统的影响（图2-21），证据表明环境恶化是再生能力下降的最主要原因。

1.肝实质细胞

年长大鼠部分肝损伤后再生能力减低，细胞数量减少，重新进入细胞周期发生延迟。年轻大鼠中，肝细胞转录因子C/EBPα与pRb、E2F及染色体重塑蛋白Brm形成复合物，抑制cyclin依赖性激酶，以此抑制肝细胞分裂。肝脏部分损伤后，C/EBPα水平减低，复合物解体并起始DNA合成。年长大鼠中肝脏部分损伤后，C/EBPα水平不减低，抑制性复合物继续抑制DNA合成，肝细胞的再生能力减低。年长大鼠肝脏再生能力的减低可以通过与年轻大鼠异种联体而逆转（图2-22）。肝脏未受损伤异种联体模型中，年长大鼠肝细胞的再生翻倍，接近年轻大鼠模型，而年轻大鼠肝细胞的再生减少将近1/3。这种升高和减低不是由于两只配对动物的细胞循环，因为在向其中一只动物细胞中转染GFP，GFP表达的细胞几乎不存在于另一只细胞中。并且抑制性蛋白复合物在年长大鼠肝脏中减少而在年轻动物肝脏中增加。

2.骨骼肌卫星细胞

大鼠和小鼠肌肉再生均随年龄增大而减低。SC数量不会随着年龄增加而减少，但其增殖能力由于肌肉中只有25%SC活化而严重降低。这种减低是由于Notch配体Delta不充分上调而导致的Notch活化减低引起，年轻大鼠中Notch受到抑制时再生能力也受到显著抑制。

用Notch抗体作用于其细胞外结构域，激活Notch将衰老骨骼肌的再生能力恢复到年轻小鼠。并且在联体模型中年长小鼠活化的SC和肌肉再生恢复到年轻小鼠的水平，而年轻小鼠活化的SC和肌肉再生只有轻微下降。

这些研究再次证实随着年龄增长，特定系统因子的丧失导致肌肉再生能力下降。与这种假设相吻合，将年长小鼠肌肉来源的SC体外暴露在年轻小鼠血清中，结果发现Delta表达增加，Notch活化增强，增殖能力增强。而且，有报道年长大鼠和人类分泌机械生长因子（MGH，IGF-Ⅰ的一种剪接异构体）缺乏。力量训练延迟人类力量减少症，与生长激素部分结合以增加MGF分泌，再次表明环境因子对年长小鼠肌肉产生重大影响，可使其保持再生潜能。

3.造血干细胞

随着年龄增长，HSC发育成髓系和淋巴系祖细胞的能力降低。在动物中，长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cell，LT-HSC）的自我更新能力不随年龄降低，但压力刺激下扩增能力下降，主要是DNA修复机制缺陷所致。联体实验表明造血能力下降伴随着周围微环境的改变。年长骨髓中成骨细胞数量高于年轻骨髓。年轻HSC在年轻成骨细胞刺激下能形成祖细胞，但在年长成骨细胞或血清刺激下这种能力降低，反之也成立。血清中哪些因子随着年龄增长而改变还不清楚，但其中包括信号分子，因为年长成骨细胞培养时加入IGF-1能使HSC恢复祖细胞的形成，反之亦然。

4.心脏干细胞和祖细胞

循环内皮细胞祖细胞的作用被认为是持续修复血管壁，阻止血小板凝集和动脉粥样硬化。而人类循环内皮干细胞随年龄增大而减少。循环EnSC数量与心血管疾病的发生呈负相关。这种相关性可以作为心血管疾病的预测因子而不仅仅是危险因素。随年龄增大，EnSC减少增加了ApoE引发的动脉粥样硬化风险。50名冠状动脉旁路移植术患者的研究发现，EnSC数量与VEGF、IL-6、IL-8、IL-10表达水平在手术后6小时显著升高。年龄﹥69岁的患者术前EnSC、VEGF水平与年龄呈负相关，并持续保持低水平。

随年龄增长，心脏干细胞（cardiac stem cells，CSC）数量减少及分化能力减低与心脏功能降低相关。心肌细胞被认为由CSC代替（或代偿性增生），随着年龄增长，细胞凋亡引起CSC数量减少，直到心肌细胞减少的数量超过新产生的心肌细胞数量，最终损害心脏功能。野生型小鼠随年龄增大，生长停滞和凋亡的基因表达增加，端粒酶活性减低。转染IGF-1的小鼠在相同年龄时未见凋亡基因表达增加，IGF-1激活P13K-Akt信号通路。Akt总蛋白在两组动物中没有显著差异，Akt磷酸化增加与端粒酶活性提高相关。野生型心肌细胞用逆转录病毒转染Akt后端粒酶活性显著提高。

5.中枢神经系统干细胞

基因芯片分析结果显示，40岁以后人类额皮质细胞中与突触可塑性、血管运输、线粒体功能、应激反应、抗氧化能力、DNA修复等功能有关的一系列基因表达均下调，这种下调与这一系列基因DNA启动子破坏有关。大鼠和小鼠新神经元通常是由脑内室管膜下区外侧室与海马区这两个部位NSC分化产生，随年龄增大新生神经元减少。在海马区的齿状回，年龄增大伴随着神经性炎症增加，新生神经元数量持续减少，突触可塑性降低。NSC在经过几个分裂周期后分化成有丝分裂期后神经胶质细胞，因此数量逐渐减少，所以新神经元的产生逐渐减少。这种“一次性NSC”机制可能也适用于其他ASC随着年龄增长逐渐减少。

异种联体模型结果显示，系统性因子表达水平改变是导致随年龄增大海马功能损坏的原因。在异种联体模型中，年长者神经形成能力增强，年幼者减弱。将年长者细胞注射到年幼动物中，海马依赖性学习和记忆功能减退。血清66种趋化因子的蛋白质组学分析表明，其中6种趋化因子年长者比年幼者表达量高。

CCL11为一种参与过敏反应的趋化因子，其也表现出随年龄增大表达水平升高的趋势。之前并未发现其与年龄、神经形成、认知能力有关。向年幼小鼠腹腔内或定向齿状回注射CCL11后其神经形成能力减低。年幼NSC暴露于年长者血清中其形成神经球的能力减低，但向其齿状回注射CCL11抗体后神经形成能力恢复。这些数据表明，这些实验方法可用于确定年龄依赖性神经形成能力减低有关的其他蛋白，以及维持神经形成或逆转这种作用的相关蛋白。

6.干细胞老化过程中的p16INK4a

周期依赖性激酶抑制因子p16INK4a细胞内表达水平随年龄增大而增加，被认为参与衰老过程。此位点ARF基因活化与肌纤维不可逆分化及细胞失去去分化能力有关。与这种观点一致的是小鼠HSC敲除p16INK4a基因后保持其再生能力，与相同年纪对照组相比凋亡细胞数少。并且胰岛细胞再生能力在p16INK4a敲除小鼠中增强，在p16INK4a过表达小鼠中减弱。

综上所述，随着年龄增长，组织再生的有效性逐渐减低。这在绝大部分例子中不是由于干细胞数量的减少，而是因为细胞周围环境的有害改变。异种联体实验表明年长动物细胞周围环境的改变反映在血清上，年轻的血清能重塑年长动物肝脏、骨骼肌、造血干细胞的再生能力，而年长的血清能降低年轻动物干细胞的再生能力。在一些例子中，干细胞数量随年龄增长而减少。随年龄增长，骨折后产生的骨细胞减少，并伴随着骨折的愈合能力减低。同样，循环EnSC的减少伴随着心血管疾病发生、发展的风险增大。心脏中心肌细胞以一定的速率死亡之后被心脏干细胞所代替，而心脏干细胞的数量随年龄增长而减少，减少到不能全部替代死亡的心肌细胞时，心脏功能将会受到损害。有趣的是，向大鼠中转入IGF-1后心脏干细胞的数量不会逐渐减少，并且IGF-1信号分子还能促进随年龄增长造血细胞的持续再生。年长小鼠和年轻小鼠NSC在体外形成神经球的能力没有区别，而脑室下区和海马区新神经球产生的数量在减少。这种减少可能是由于随年龄增长对突触可塑性、膜泡运输、线粒体功能、应激反应、抗氧化反应、DNA损伤修复、终末分化起关键作用的基因表达下调。在海马区NSC随年龄逐渐减少可能的原因是NSC经过数次不对称分裂后发生终末分化，形成神经胶质细胞。

六、成体干细胞的应用前景

再生医学的细胞移植治疗是基于移植的细胞能够分化成新组织并与周围组织进行整合，或者通过分泌旁分泌因子来促进病变处局部细胞的存活和再生、减少瘢痕，干细胞的这种旁分泌作用的机理和应用研究越来越得到重视，已经成为干细胞特性和应用研究的一个新的领域。一般将培养扩增的ASC作为自体或异体干细胞移植的细胞来源。自体ASC移植深受青睐，因为移植前或移植后都不需要考虑影响细胞存活的免疫抑制问题。然而，获取一些ASC必须以破坏它们存在部位的组织结构为代价，如神经干细胞（neural stem cells，NSC）、心肌干细胞，并且在离体条件下它们很难扩增，这使得在患者身上应用ASC，尤其是自体移植，变得非常困难。

在过去的10年里，大量的研究报告指出，ASC分化潜能远超出人们的想象。当暴露于某种分化信号之下的时候，ASC能够分化成特殊的细胞类型（而不是常规的分化结局）。可见容易搜集、能够体外高度扩增的某种ASC可能为修复任何组织提供足够的移植用细胞来源。来自骨髓、脐带血的干细胞（造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞）以及脂肪干细胞均符合这一标准，并可以实现体外高度扩增。特别是已经有报道骨髓间充质干细胞能够分化成比预期更为广泛的细胞类型。

关于ASC分化潜能的首要热点问题得到证明，就是关于ASC在体条件下的谱系转化，在体条件下的谱系转化频率很低，不足以再生新的组织，试验表明，大多数的谱系转化是在人为的条件下发生的。然而，一些实验表明，一些细胞的重编程在离体调控条件下能够高效获得，通过重编程成年体细胞使其转变成其他类型细胞或者多能细胞是很热门的课题。

已经证明，一些ASC具有分化潜能，也有一些ASC还有待于进一步研究。其中，尚未证明具有分化潜能的细胞包括表皮和肠上皮干细胞、听觉感觉细胞、肾上皮细胞、肝细胞、视网膜干细胞和心肌干细胞。已证明具有分化潜能的干细胞包括神经干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞和肌肉干细胞，来源于长期培养的骨髓和结缔组织的胚胎干细胞样细胞。这些细胞当中，有的是在体条件下验证的，有些是离体条件下验证的，还有一些在两种条件下都得到了验证。

从成人组织（器官）分离培养功能细胞在技术上已经十分成熟，制约临床应用的主要因素是大规模扩增技术，现已基本得到解决。如从患者活检得到的皮肤或从包皮切除术中得到的皮肤分离培养成纤维细胞和表皮细胞，均可达到相当大的扩增量，已经可在体外培养成为单层表皮层用于皮肤的修复。1989年Grande首先用兔的自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损，组织学观察证明有82%的软骨修复。1997年美国FDA批准其用于临床。通过关节镜技术操作，创伤小，并发症少。随访观察发现74%为透明软骨，其组织学显示了接近正常的关节软骨结构，可用于15cm2全层软骨缺损的修复。

（庞希宁）