第四章 子宫颈癌的初级预防
第一节 子宫颈癌HPV疫苗原理与机制
从19世纪80年代证实人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的致癌活性以来，HPV作为子宫颈癌发生中最关键的因素在全球范围内达成共识，而随着90年代初HPV病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）第一次在体外制备成功，在此后的近十年，以HPV VLP为核心的疫苗研发蓬勃兴起，迄今为止，子宫颈癌预防性和治疗性疫苗的研制已经取得了很多令人振奋的成果。所有疫苗的研制都是基于HPV的结构，因此，本节将重点介绍HPV病毒预防性疫苗的原理机制和现状。
根据疫苗功效的不同，可将其分为三类：一是预防HPV感染的预防性疫苗；二是清除原有感染、治疗相关病变的治疗性疫苗；三是将不同作用的疫苗联合使用或者将不同靶点融合以达到预防治疗功效的联合疫苗。预防性疫苗主要以L1/L2为基础研制，可诱导机体产生特异性抗体，达到预防感染的目的；而治疗性疫苗则主要以HPV早期基因作为靶点，诱导机体产生特异性的细胞免疫反应，从而使原有感染和相关疾病消退；联合疫苗则期望兼具上述两种特点，也是目前研究的热门之一。
（一）预防性疫苗
以HPV L1为靶点的预防性疫苗是最早研制成功的子宫颈癌疫苗，主要是通过将HPV L1诱导生成的HPV VLP装配在酵母菌、杆状病毒、大肠杆菌、痘病毒等不同的载体中，诱导机体产生特异性抗体。酵母菌是一种高效表达外源基因的载体，具有完整的异源蛋白修饰系统，尤其是糖基化系统。酵母菌端粒TEL、GEN和ARS等DNA元件可以克隆扩增片段外源DNA基因，具有安全性好、遗传稳定、表达量高、外源基因不易丢失、发酵工艺成熟等优点，适用于大规模的工业化生产。以酵母菌为载体的HPV6/11/16/18四价疫苗Gardasil（默沙东公司，美国）于2006年通过美国食品药品监督局（FDA）的认证，是最早通过认证的HPV疫苗，该疫苗为灭菌悬液注射剂，使用的佐剂为氢氧化铝，在此基础上，默沙东公司将疫苗覆盖型别扩大到九种，新增了31、33、45、52 和 58 五种，该九价疫苗也在2014年底获美国FDA批准上市。除酵母菌外，杆状病毒也是也可用作疫苗制备的载体，其表达系统有诸多优越性：①安全性好，具有高度种属特异性，不感染脊椎动物；②高容量，病毒基因组较大，具有多个天然启动子；③高表达效率，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50%；④表达产物具有生物活性，能识别并正确进行信号肽的切除和磷酸化、糖基化等反应，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，具有高生物活性。葛兰素史克公司的HPV16/18二价疫苗就是以杆状病毒作为载体，已在2009年通过美国FDA认证。大肠埃希菌是最早成功表达L1和L2的载体，其具有易于培养、表达量大的特点，我国厦门大学成功研发的HPV16/18二价疫苗就是以大肠杆菌为载体，表达HPV16、18型L1蛋白，经过重组和纯化过程获得VLPs，现已完成Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，正在进行Ⅲ期临床试验。这也是继美国两家公司的同类产品后，我国自主研发成功的世界第三个预防性子宫颈癌疫苗。
以HPV L1为靶点的疫苗虽然获得了成功，但由于L1诱导的中和抗体具有型别特异性，不同型别中和抗体间无交叉保护作用，疫苗的保护范围有限，前文也提到，L2在不同型别间高度保守，若以其作为靶点，可扩大疫苗的保护范围。有研究者在健康志愿者中作了HPV L2肽段抗原表位108～120的肽疫苗安全性及免疫原性试验，健康志愿者鼻腔接种了HPV16 L2 108～120肽段疫苗，诱导出了HPV16和HPV52的交叉反应抗体，在人体中具有很好的耐受性和免疫原性。另有研究发现HPV16 L2肽段氨基酸序列18～144有多个中和抗原表位：18～38、56～75和96～115，研究者利用重组杆状病毒表达系统合成HPV16 L2的这3个肽段，对兔进行免疫，获得兔的抗血清，可有效地结合到HPV LI/L2嵌合蛋白，证明其对HPV16、18、31和58具有交叉中和能力，同时研究还发现3种抗体的混合物所产生的交叉中和作用强于单独使用一种抗体。另外，有研究发现到HPV L2 17～36 AA是非常重要的B细胞抗原表位，在不同型别中间具有高度的保守性，HPV16 L2的这段序列与HPV2、HPV5和HPV45具有78%的同源性，与HPV6和HPV11具有80%的同源性，与HPV18具有84%的同源性，研究者制备的针对HPV16 L2 17～36 AA的单克隆抗体RG-1，被证实能够交叉中和HPV5/6/16/18/31/45/52/58等不同型别的假病毒。L2的广谱预防潜能使之用于预防性疫苗制备具有广阔的前景，但其未来应用还需克服其诱导产生的抗体滴度低的缺陷，因此还需要多种型别的预防疫苗。
（二）治疗性疫苗
HPV治疗性疫苗主要针对子宫颈癌前病变，而子宫颈癌发展的以下几个特点使得治疗性疫苗的研制极具价值：①子宫颈癌的进展有一系列明确定义的前期，因而可以在病变各阶段通过非侵入的方法，如常规细胞学、HPV DNA检测等评价免疫治疗的效果；②子宫颈癌筛查为临床试验提供了现成的潜在受试群体，并可确定适用于治疗性疫苗的高危个体；③HPV感染通过要10～20年才会进展为癌症，这就为治疗干预提供了有利时机；④因疫苗的治疗性效果，可避免受试者处于癌症进展的不必要风险中。治疗性疫苗主要以HPV 早期基因（E2/E5/E6/E7）为靶点，以下将从载体疫苗、多肽和蛋白疫苗、DNA疫苗等方面对其进行介绍。
1.活载体疫苗
活载体疫苗主要包含病毒和细菌载体疫苗，通过将编码病毒蛋白的基因组重组到载体DNA中，感染靶细胞诱导其产生体液免疫和细胞免疫。活载体疫苗常用的病毒载体有痘病毒、腺病毒、仙台病毒等。有研究将HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7所融合基因分别整合到痘苗病毒得到重组痘苗病毒TA-HPV，发现TA-HPV感染机体后能在宿主细胞内高效表达HPV16/18E6/E7融合蛋白，诱导较强细胞免疫应答。在一项纳入了29个子宫颈癌早期病例的研究中，受试者接种两次HPV 16/18 E6和E7重组痘疫苗后，有8名患者产生特异性血清学反应，有4名患者产生了特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，未观察到与疫苗相关的不良反应，初步验证了疫苗的有效性和安全性。除了E6/E7，E2也是治疗性疫苗的研究靶点，有研究者用腺病毒载体表达CRPV E2的疫苗（Ad-E2）进行兔免疫实验，发现用Ad-E2疫苗初次免疫后HPV位点形成的数量由17/45减少至4/45；加强免疫后，已接种疫苗的兔未形成新的HPV感染，而对照组增加23例感染，在HPV消退的位点及未形成HPV的位点均未发现CRPV DNA，显示Ad-E2疫苗可清除所有感染位点的CRPV。有研究用MVA E2重组疫苗治疗HPV感染相关CIN 1/2/3共36例，阴道镜检查发现其中34例癌前病变完全消退，另2例由CIN3消退至CIN1；18例没有检测到HPV DNA，18例病毒载量只有原来的10%，所有MVA E2治疗者均产生了抗MVA E2疫苗的抗体和特异性细胞毒反应，表明MVA E2疫苗可以诱导机体免疫应答、治疗癌前病变。
除病毒载体外，细菌也可作为治疗性疫苗的载体，常用的细菌载体有李斯特菌、大肠杆菌、沙门菌、志贺杆菌等。有研究发现HPV16 E7融合蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌疫苗，能使75%的HPV16 E7移植瘤消退。但用这种疫苗对15例晚期浸润性子宫颈癌患者进行的I期临床试验中，所有患者都出现了流感样症状，6例患者（40%）出现了严重（3级）不良反应，注射大剂量疫苗的患者出现了发热和低血压现象。活载体疫苗虽然免疫原性高，但存在不能多次免疫并受既往免疫影响的缺陷，使其应用受到了一定的限制。
2.多肽/蛋白疫苗
多肽和蛋白疫苗在机体内可通过组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ/Ⅰ呈递给CD4+/CD8+ T细胞，诱导机体产生细胞免疫反应。多肽疫苗是小分子物质，其免疫原性比较弱，很难诱导机体产生很强的免疫应答，一般会配合佐剂一起使用。前期动物实验证实E6/E7多肽可诱导鼠和兔产生特异性免疫应答。有研究应用包含HPV16 E6和E7序列的肽疫苗免疫HPV16阳性的子宫颈癌妇女，结果发现，受试者中HPV16特异性CD4+和CD8+ T细胞总数明显增加，这两种细胞在抗肿瘤应答中具有重要作用，提示该疫苗具有治疗子宫颈癌的潜力。多肽疫苗的HLA限制性使其应用受到了限制，为克服这种限制性，有研究者选用涵盖HPV16 E6和E7两个蛋白的全序列长多肽辅以Montanide ISA-51佐剂对晚期子宫颈癌患者进行治疗。这种长多肽的长度为25～35个氨基酸，并且每个长多肽间有10～14个氨基酸的重叠区；9条这样的长多肽就可涵盖HPV16 E6蛋白的全序列，4条可涵盖HPV16E7蛋白的全序列。Ⅰ期临床试验表明，在不同的部位分别免疫注射E6和E7抗原肽要比同时免疫的效果好，E6和E7长多肽在晚期子宫颈癌患者体内能很好耐受并可诱导T细胞应答相关的IFN-1产生。另外，有研究发现HPV E5多肽疫苗可诱导小鼠产生特异性细胞免疫，表明HPV E5也可作为治疗性疫苗的潜在靶点。
与多肽疫苗不同的是，蛋白疫苗具有所有免疫表位，可以克服HLA限制。通常可溶性外源蛋白抗原免疫机体后，在被B细胞摄入后经过内体一溶酶体途径加工成抗原肽并由MHCⅡ类分子提呈到B细胞表面，以活化CD4+ T细胞，活化的CD4+ T细胞又会刺激和辅助B细胞的进一步活化和增殖分泌特异性抗体。所以，免疫可溶性外源蛋白抗原一般只会诱导特异性体液免疫应答，但是特异性CD8+CTL应答才是有效清除肿瘤细胞所必需的。研究发现，有些外源性抗原肽能从内体-溶酶体中逸出进入胞质溶胶启动内源性加工提呈途径而由MHC Ⅰ类分子提呈，供CD8+T细胞识别，诱导特异性CTL应答。有些佐剂也能增强细胞免疫应答。子宫颈癌治疗性蛋白疫苗的设计策略大多也是使免疫外源蛋白后诱导特异性CTL应答，或是添加佐剂增强其免疫原性。有研究采用E7和热休克蛋白（hsp）融合（hsp-E7）制备疫苗，31例CIN3妇女接受了免疫注射，所有受试者在第4个月进行了宫颈锥切，48%完全有效，即未检测到CIN，33%病情稳定，没有发现有进展的妇女，且hsp-E7的免疫效应没有明显的型别限制性。目前该疫苗正在进行更大样本量的Ⅱ期临床试验。
3.DNA疫苗
不同于多肽和蛋白疫苗，DNA疫苗可通过宿主细胞的复制，持久的表达抗原，但裸DNA疫苗的抗原性较弱，需要各种辅助手段来增强其免疫反应。从免疫学角度来看，树突状细胞（DC）是介导DNA免疫的重要环节，但其生存期较短，所以用延长DC体内存活时间的手段来加强免疫是不错的方式，但这种方法存在潜在安全隐患，还有待进一步研究。另外，还有通过不同物质包装相应的DNA疫苗，以增强其免疫原性。有研究者用可被生物降解的颗粒（ZYC101a）包装含有HPV16/18 E6/E7的DNA质粒作为疫苗，对161例CIN1/2受试者进行了随机、双盲、对照和多中心的临床试验，在0、3、6个月分别给予不同剂量的免疫制剂和安慰剂进行干预，结果发现在低年龄组中疫苗组和安慰剂组CIN消退差异显著，未见明显毒副作用产生，这项研究证实了HPV16/18 E6/E7 DNA疫苗的有效性。还有研究者根据HPV 16 E7 DNA序列合成的“错构”的E7SH DNA，无HLA限制性，通过体外实验证实其可刺激DC产生特异性CTL，软琼脂实验证实其无明显转化活性。这些都为疫苗研制提供了新的思路。
4.细胞疫苗
DC是功能最强的抗原提呈细胞，是连接特异性免疫反应和非特异免疫反应的重要环节，对DC的分离、纯化，体外培养和抗原负载是目前研究的热点。DC疫苗的制备一般是从患者体内分离出DC，在抗原刺激下体外培养，得到成熟的DC后，再将成熟的DC和特异性外源性抗原一起注射回患者体内，达到治疗疾病的目的。子宫颈癌DC疫苗主要采用靶抗原刺激DC成熟，或用相应的抗原蛋白/肽/肿瘤细胞裂解物或是将编码相关抗原的DNA或RNA转染DC对其进行活化。有研究采用重组HPV 16/18 E7蛋白刺激自体单核细胞分离出DC，治疗15例四期子宫颈癌患者，结果显示有4例患者产生显著的特异性细胞免疫，并伴有肿瘤标志物的降低。还有研究采用自体DC和重组HPV16或HPV18 E7蛋白配合使用重组人IL-2对复发性子宫颈癌患者进行治疗，2/4的患者有E7特异性CD4+T细胞免疫应答，全部4例患者都观察到E7特异性CD8+T细胞免疫应答。
除DC外，肿瘤细胞也可用于制备子宫颈癌疫苗，采用共刺激分子或细胞因子的基因转染肿瘤细胞，可增强其免疫原性，加强T细胞功能，从而产生抗肿瘤效应。如用白细胞介素-12（IL-12）和IL-2，或激活刺激因子转染HPV阳性肿瘤细胞，可在小鼠体内产生很强的体液免疫。但这种方法由于疫苗的免疫原性强，故存在安全隐患，不适于早期癌症和癌前期病变患者，可以考虑作为癌症晚期患者的自体免疫疗法，其应用范围具有一定局限性。
（三）联合疫苗
联合疫苗有两种策略：①将不同种类的疫苗联合使用，寻找最佳组合，克服各自缺憾达到最完美效果。有学者提出用DNA疫苗启动免疫，随后用重组的病毒载体疫苗增强免疫，可有望获得最佳的效应，其临床应用还需进一步评估。②制备兼具预防和治疗功效的疫苗。如HPV VLP能激活DC，HPV 16/18 VLP-E7嵌合疫苗能够刺激机体产生E7特异性T细胞及抗病毒衣壳蛋白抗体，从而达到在清除HPV感染的同时，治疗局部相关病变的目的。但由于病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫逃逸作用以及机体内可能存在的免疫抑制等，这些疫苗在体内可能达不到预期效应，因此，增加机体特异性和非特异性免疫效应，延长免疫时间及在病毒感染早期就对其进行有效干预都将是疫苗研制需要面对的问题。
综上，HPV预防性疫苗的问世为子宫颈癌预防带来了新的契机，但如前述，预防性疫苗无法涵盖所有高危型别，且对已感染的妇女没有治疗作用，因此，研制可覆盖多种型别的第二代预防性疫苗和治疗性、联合疫苗是近年来HPV相关疾病研究领域的热点。国内外已经开展了HPV治疗性、联合疫苗的研制工作，多种已进入临床研究，具有广阔的应用前景。当然在此过程中我们还需要解决疫苗安全性和免疫原性有限等问题。尽管如此，我们相信随着对HPV分子生物学和免疫学性质研究的深入，HPV疫苗将会日益完善，造福于人类。
（于露露 乔友林）