第三节　HPV感染途径、过程、后果与子宫颈癌

一、HPV感染途径

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤中的发病率位于第二位，仅次于乳腺癌。人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）属于乳头瘤病毒科，是一种无包膜的双链闭合环状DNA病毒，在任何动物中广泛分布，其感染靶位主要为上皮组织，存在高度的宿主特异性，对人体特异部位的上皮具有亲和力，HPV感染是子宫颈癌发生、发展的必要因素。20世纪70年代末，Zur Hansen 成功观察到子宫颈癌组织中存在人乳头状瘤病毒，并提出子宫颈癌可能由HPV感染引起，并因此获得了2008年的诺贝尔生理学或医学奖。随后到20世纪80～90年代，大量的流行病学及病理生理研究证实了HPV感染可导致包括子宫颈癌在内的多种恶性肿瘤。

长期以来，人们已经意识到HPV与许多人类的良性肿瘤和疣有关，如生长在生殖器官附近皮肤黏膜的人类寻常疣、尖锐湿疣及生长在黏膜上的乳头状瘤。但是同时大量的研究发现HPV感染也与多种人类恶性肿瘤发生有关系，如子宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、大肠癌、口腔癌、喉癌、鼻腔鼻窦癌及肺癌等。HPV与人类恶性肿瘤的这种紧密关联已引起学者们的广泛注意，HPV感染与子宫颈癌关系的研究已成为肿瘤病毒病因研究的热门话题。近年来，大量研究调查数据已证实HPV持续感染是导致子宫颈癌的主要病因。凡是能够增加HPV感染的因素和行为皆是子宫颈癌的发病原因，如早年性交、多个性伴侣、多产、多次妊娠、吸烟等都与子宫颈癌的发生密切相关。

HPV感染有直接接触传播、间接接触传播和垂直接触传播三种方式。直接接触传播主要是通过性接触传播，是HPV感染的主要方式。肛门生殖器的HPV感染主要是通过皮肤-皮肤和黏膜-黏膜之间的接触传播。虽然存在其他的传播途径，但是这些传播方式在子宫颈癌发病过程中的作用较小。

最初，人们发现没有性生活的修女很少患子宫颈癌，研究者考虑子宫颈癌可能是性传播引起的。在过去的30多年中，随着人们对子宫颈癌研究的不断深入，初步提出宫颈持续性人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是子宫颈癌发生的主要病因。HPV感染是一种性传播疾病，与性行为因素有关。HPV感染在没有性生活的妇女中非常少见，其感染率与妇女性生活的活跃程度和性伴侣的个数密切相关。单次性行为后感染HPV概率并不是确定的，感染HPV类型上没有太大的区别，但是感染概率显然很高。因为不同型别HPV具有共同的转播途径，所以往往多种HPV同时感染宿主。在一般人群中调查发现HPV混合感染达20%～30%。男性也经常感染几种HPV，单次性行为可以传播几种类型的HPV。

单个病毒颗粒可能通过生殖道黏膜上的裂隙进入生殖道基底膜的储备细胞。由于角质化上皮存在一定的韧性，男性包皮环切术可能降低男性HPV感染和传播的概率。另外，深部性交严格意义上并不是传播HPV的必要条件，因为宫颈上皮HPV感染也可能是通过女性阴道口已经存在的感染播散而来的。世界上大多数女性在其性生活过程中可能至少感染一次HPV。由于HPV DNA存在时间短和血清学检测结果存在不稳定性，女性暴露于HPV总的概率难以估计。因此，有相当一部分HPV DNA阴性或血清学阴性的妇女仍然可能被暴露于HPV。故注意个人卫生的女性，特别是经期卫生和同房前后卫生，可以使HPV感染的概率降低。此外，有固定的性伴侣、提高免疫力、避免多次妊娠或者人工流产和合理服用口服避孕药等均可保证HPV感染率大大降低。

对大部分性活跃的青少年和妇女来说，开始性生活的前几年是HPV感染的高峰期。有研究报道，在刚开始性生活的大学生中，开始性生活后的12个月内HPV检测阳性率为30%；48个月内为54%；更长期的随访中甚至高于2/3。性生活越早患子宫颈癌的概率越大。HPV感染率主要取决于人群的年龄和性行为习惯。许多研究表明性生活活跃的年轻妇女HPV感染率最高，高峰期在18～28岁，随着年龄的增长而明显下降。在HPV感染的性别方面，一般认为男性HPV感染率与女性类似。也有调查表明女性HPV感染率高于男性，而且在25岁以下女性中HPV感染率最高。过早性生活是指18岁以前已有性生活；早婚指20岁以前结婚。此时女性生殖道还未发育成熟，对致癌因素的刺激比较敏感，一旦感染某些细菌和病毒后，又在与多个男子性关系的刺激下而导致子宫颈癌发生。据调查，未婚或未产妇中，子宫颈癌的发病率明显下将。性接触部位的小创面可促进感染，三种鳞状上皮（皮肤、黏膜、化生）对HPV感染都很敏感。每一型的HPV与特殊的临床损害相关，且对皮肤或黏膜鳞状上皮各有其好发部位。当含有大量病毒颗粒的脱落的表层细胞或角蛋白碎片进入易感上皮的裂缝中时，感染就可能发生。

值得一提的是，生殖器-生殖器性交并不是HPV感染的必要条件。口-生殖器和手-生殖器性交也可能导致HPV感染的传播，但是传播率较低。在一项针对美国西雅图大学生的研究中，性活跃人群中两年内HPV感染率为38.8%；没有生殖器-生殖器性交的人群中 为9.7%；完全没有性交的人群中为1.3%。

流行病学研究表明，HPV感染的主要危险因素包括：①多个性伴侣；②性生活开始的时间；③其性伴侣为HPV携带者。循证医学研究表明可根据妇女自身及其丈夫（或性伴侣）性活动的模式判断其今后患子宫颈癌的可能性。妇女成为HPV携带者及其今后发生子宫颈癌的概率与其丈夫（或性伴侣）阴茎或阴道内HPV DNA的存在有关，提示男性在子宫颈癌的流行过程中亦扮演着重要角色。

间接接触传播主要包括接触物品传播和医源性传播，如HPV感染者用过的毛巾、内衣裤、盆、床单、坐便器等生活用品。垂直接触传播，即母婴传播途径，多是一过性HPV感染。这些传播途径很少引起子宫颈癌，而多是引起尖锐湿疣等良性病变。

1.HPV与子宫颈癌病因关系的流行病学证据

据国际癌症研究中心（IARC）统计，最常见的HPV型别按感染率由多至少依次为HPV16、18、45、31、33、58；子宫颈癌标本中，HPV16、18、31、48型感染约占75%，其中HPV型占51.0%。用敏感的PCR技术可以在99.17%的子宫颈癌标本中检测出高危型HPV DNA（包括鳞癌和腺癌）。大样本的研究表明，几乎所有的子宫颈癌及大多数宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级都存在HPV感染，生殖道感染高危型HPV是妇女子宫颈癌和CIN高发的主要危险因素。最近国外调查研究发现，99%的子宫颈癌是由于HPV的持续性感染所致。有许多子宫颈癌的前瞻性研究表明HPV-DNA阳性的患者发展为CIN Ⅲ级和浸润型子宫颈癌的危险性要高于HPV DNA阴性的患者。很少有研究评估感染哪种型别的HPV发展为CINⅡ/Ⅲ级的危险性较高，但大量的研究表明感染HPV16可以增加CINⅡ～Ⅲ级进展为子宫颈癌的危险性。研究报道在2年之内CINⅡ～Ⅲ级的进展可以通过检测HPV DNA得知，因此，与HPV持续感染是进展为CINⅡ～Ⅲ级的必要因素这种理论相反，这些癌前病变可能是HPV感染的早期表现，至少在年轻妇女中是如此。另外，国内研究者进行流行病学调查研究发现：Logistic 多因素回归分析后，HPV感染是导致子宫颈癌发生的首要因素。

2.人乳头状瘤病毒感染与子宫颈癌的关系

1977年Laverty在电镜中观察到宫颈活检组织中存在人乳头状瘤病毒颗粒，Zur Hausen提出HPV与子宫颈癌发病可能有关。此后，国内外学者就两者关系进行了大量研究，并获取诸多证据。大量研究结果表明90%以上的子宫颈癌中可以检测到HPV DNA；实验动物胡组织标本研究还表明，HPV DNA检测的含量与宫颈病变程度成正相关，并且HPV感染与子宫颈癌发生呈时序性关系，符合生物学致病机制。流行病学资料和实验室证据都支持HPV感染与子宫颈癌发生之间的因果关系，表明HPV感染是子宫颈癌发生的主要危险因素，也使子宫颈癌成为目前人类所有癌症中唯一一个有较明确病因的癌症。

值得注意的是，并非所有HPV感染者都会发生子宫颈癌。大部分妇女感染HPV后可通过自身免疫力把病毒清除，这个过程一般需要9～16个月。部分妇女在感染HPV病毒后，因为某种原因，只抑制了病毒的复制生长但不能完全把病毒清除掉，这样体内仍存在少量病毒，即潜伏感染。潜伏感染则不存在细胞学改变，不属于子宫颈癌的高危人群；有5%～10%感染HPV的妇女因为自身免疫因素或其他因素不能排除病毒，并维持高水平病毒载量，成为持续感染。这种HPV持续感染者就是子宫颈癌的高风险人群，其中约有30%会发展为CINⅠ，10%发展为CINⅡ，10%发展为CINⅢ。如果不治疗，约1%最后发展成子宫颈癌。从HPV感染到子宫颈癌发生一般需要5～25年的时间。

宫颈HPV感染是否发生宫颈上皮内高度病变乃至子宫颈癌，主要取决于病毒、宿主和环境三方面因素的相互制约平衡。

二、HPV持续性感染

1.HPV感染的持续与清除

多数HPV感染可以被清除，这些感染是“一过性的”，并不引发宫颈病变，只有少数持续性感染才会引发宫颈病变。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于检测持续性HPV感染可以比杂交捕获法提供更精准的信息，持续性感染是基于用同一种PCR去检测HPV同一型别的脱氧核糖核酸（desoxyribose nucleic acid，DNA）负荷量，但可能出现由于检测病毒载量的波动低于某个阈值时，导致假阴性结果，造成持续性感染误以为是一过性携带者。目前由于很多未知HPV感染相关因素的存在，使两次检测的时间间隔很难确定，病毒有可能低水平潜伏而未能检出，使HPV检测阴性结果的意义变得十分模糊。高危HPV的感染过程更容易呈持续性，HPV16是一种最易产生持续性感染的高危型HPV，40%～60%的子宫颈癌患者体内可以检测到HPV16感染。HPV16感染后病毒清除率较低，致CINⅡ/Ⅲ的危险性高，且治疗后病灶残留率和复发率高。因此有HPV16感染的妇女应密切随访，一般建议每6个月1次，随访时不仅行细胞学检查，还应行病毒检测。然而不同类型HPV的多重感染是造成感染持续状态的另一个危险因素，有研究发现同时感染2种或以上HPV的低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）患者，仅有不到86%病变可以恢复正常。由于妇女子宫颈癌的发病率和死亡率远较其他HPV相关恶性肿瘤高，因此HPV人群感染率的研究都是在女性中进行的。结果显示，性活跃期妇女HPV感染率最高，占50%～80%，其中50%为高危型HPV感染。HPV感染无任何临床症状，而且50%～90%的感染可在感染后数月至2年内被免疫系统清除，感染的平均持续时间为8～12个月，Plummer等调查了4504名因HPV感染引起的鳞状上皮非典型增生和低度鳞状上皮损伤病人，发现99%在2年内得以清除，感染持续超过6个月易发生癌变。另有研究者对细胞学正常与轻度核异常的44 102名高危HPV感染妇女的病毒清除情况进行调查，发现6个月后清除率分别为43%和29%，8个月清除率分别为65%和41%。未得以清除的高危病毒感染者显示出更高的CINⅢ及子宫颈癌发生率。

Dalstein等进行的一项前瞻性研究表明，反复HPV感染的女性，发展到CINⅡ/Ⅲ级的危险性增高，持续HPV阴性或一过性HPV感染的女性，在随访过程中均未发展为CINⅡ/Ⅲ级。与高危型HPV阴性者相比，HPV短暂感染和持续感染者发生不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of unde-termined significance，ASCUS）和鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesions，SIL）的可能性大，其相对危险度（relative risk，RR）分别为2.38和9.31。所以该作者认为，持续性高危型HPV感染是发生CINⅡ/Ⅲ 的重要高危因素。

Schlecht等报道一项前瞻性HPV持续性感染的研究，结果显示，与HPV阴性的患者相比，高危型HPV持续感染的患者发生SIL相对危险度为10.19（95% CI=5.9～17.6），HPV16或18持续感染的患者发生SIL相对危险度更高，达11.60（95% CI=4.1～13.3），而在非持续感染者中为8.68（95% CI=2.3～5.1）。只有慢性持续性高危型HPV感染，才能最终演变为子宫颈癌。

2.HPV的整合与持续感染

HPV以游离状态引起细胞感染，首先潜伏于基底细胞层，其DNA作为独立的外源染色体游离于细胞核内，病毒复制受到限制，但病毒的核酸却整合到宿主细胞核内，细胞核染色体双倍，核大深染，成为不典型增生细胞，细胞基因由于病毒整合而发生突变，细胞异形性显著，进一步发展为癌。早期基因的表达激活细胞的增殖，病毒基因组与宿主染色体发生整合，E1、E2基因被破坏，从而导致E1、E2基因的表达失去控制。早期整合位点的确定主要是通过DNA印记杂交的方法确定，这一方法也被认为是最为准确的一种，然而由于该方法运用了传统杂交的手法，在平均病毒载量较低的情况下，很难检测出整合事件。近年来，基于酶联反应的HPV整合检测PCR（DNA-based detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR assay，DIPS-PCR）以及HPV癌基因扩增转录检测（the amplification of papillomavirus oncogene transcript test，APOT）经常被采用。由于收集到的整合位点均来自子宫颈癌细胞，还没有报道表明肿瘤进展与不进展时，HPV整合位点的区别。值得说明的是，近年来，由于实时荧光PCR的应用，更多的学者采用比较E2以及E6在样品中拷贝数的方法确定HPV的整合情况。然而在没有宫颈疾病的患者样品中也可以发现HPV的整合，虽然这种情况较为罕见，足见以HPV的整合作为CIN或子宫颈癌的预测指标不能够完全成立。此外已有报道表明在具有整合型Ⅲ的CINⅢ者样品中，仅有较小比例的样品中可以检测到由于整合激活的转录产物。因而，基于致癌基因转录的检测方法只有有限的预后用途，而无法对于每一个体提供准确的疾病进展预测。

从病毒学的一般原理上，HPV整合应该是一种比较理想的持续感染方式：HPV在宿主染色体发生整合后，整合的HPV病毒基因组难以从染色体上脱离，这样就造成HPV病毒基因组编码的致癌基因可以稳定地留存于宿主基因组（人染色体）中，进而致癌基因的表达蛋白可以持续性地刺激宿主细胞，导致细胞转化（肿瘤形成）。以上说明，HPV的整合机制可能更容易形成其持续性感染。因而，聚焦HPV整合事件，研究HPV持续感染，可以为研究HPV感染机制的细节作出更多的支持。

有关整合的作用上，现在依然有多数学者支持整合与否与疾病进展相关，这主要是因为，从分子机制上讲，整合型的HPV可以比较容易地逃逸免疫系统的自我清除的机制，因而是提供持续感染的最有效手段。

3.持续性感染与免疫逃逸

研究表明，在一部分子宫颈癌患者尽管局部损害呈HPV阳性，但是没有启动对HPV的免疫反应，提示在HPV持续性感染及HPV引起的部分子宫颈癌患者中存在免疫逃逸。宿主的免疫反应对HPV感染转归起决定性作用，直接影响到HPV感染是否被清除或转化为持续性感染。一方面，细胞毒性T淋巴细胞可以清除已经存在的HPV相关损害，另一方面，中和性抗体可以清除复制病毒的再次感染，而免疫细胞、干扰素及细胞因子、某些病毒蛋白及HLA多态性与病毒的免疫逃逸及持续性感染有关。

近年，许多研究证实，某些HLA等位基因与HPV感染存在一定相关性。更显著的是，携带DRB*1301-DQB1*0603单型对HPV感染有持续的保护作用，B7/DQB1*0302和子宫颈癌也有正相关作用。在HPV持续感染的人群中，携带DQB1*0602和DRB*1501等位基因出现的频率明显高于对照组，DRB1*0301-DQB1*0201单型可使暂时和持续的HPV感染风险下降，DRB1*1102-DQB1*0301对HPV持续性感染有一定的低风险影响，而DRB1*1601-DQB1*0502和DRB1*0807-DQB1*0402可使HPV持续性感染的风险性分别增加7倍和3倍。另外还有学者报道，DRB1*1501-DQB1*0602型、DQA1*0102-DQB1*0602单型及DRB1*0701等位基因的存在增加与HPV16相关的子宫颈癌的风险，HLAⅠ类等位基因与子宫颈癌相关并被认为参与某些HPV16逃避免疫监视的过程，同时存在肿瘤 坏 死 因 子等 位 基 因和DQB1*0601与HPV16阳性患者发展与CINⅡ/Ⅲ相关。由上述可见，HLA多态性与HPV感染的清除和持续性感染有关，其原因可能是不同个体在提呈抗原表位给T细胞的能力不同，某些HLA等位基因的携带者提呈病毒抗原给免疫系统的效率较低，而引起病毒持续性感染。

4.HPV致子宫颈癌的机制

自1974年学者发现在子宫颈癌细胞涂片中出现“挖空”细胞（koilocytes），是HPV感染一起的重要病理改变之时起，HPV在子宫颈癌中的作用就开始受到关注。随后，在生殖道肿瘤中陆续检出各种基因型的HPV。1983～1984年，HPV16型和18型先后首次在子宫颈癌标本中分离出来，从而引发了HPV研究领域的飞速发展。随后，接踵而至的大量实验室研究，在细胞生物学与分子生物学水平逐步阐明HPV在子宫颈癌病因中的作用，如病毒癌基因E6和E7可影响细胞周期的调控，在细胞的恶性转化中起着关键作用；病毒环状DNA分子可以通过E2特定部位的断裂开环而整合到人的宿主基因组，干扰宿主细胞基因组稳定性，进行自我复制等。

HPV是一种嗜上皮病毒，它在皮肤或黏膜的上皮细胞受轻微损伤暴露基底细胞时，侵入上皮，在基底细胞中低水平复制DNA。随着基底细胞的分化成熟向表皮移动，细胞内病毒衣壳蛋白表达并包装病毒DNA形成完整的病毒颗粒，释放到上皮表面，经密切接触可传予他人或脱落播散到周围的环境中。病毒的基因组的复制和感染限于基底层细胞，而病毒晚期基因表达及病毒颗粒的装配，限于上层高度分化的上皮细胞内（图2-2）。病毒组装发生在细胞核并一直存在于细胞核，直到细胞脱落下来。病毒感染和持续时间与HPV感染类型及机体因素有关。目前，关于HPV具体如何进入上皮细胞尚无明确定论。Roberts等（1998）发现HPV16 E1/E4可破坏培养细胞中的角蛋白网络，认为它可能参与病毒感染的扩散。HPV DNA整合到宿主细胞的DNA上宫颈HPV感染是否发生宫颈上皮内高度病变乃至子宫颈癌，主要取决于病毒、宿主和环境三方面因素的相互制约平衡。

（1）HPV DNA整合到宿主细胞DNA上：

HPV作为一种肿瘤相关病毒的观点已广泛为人们所接受，其致癌作用与HPV DNA的整合入宿主DNA有关。Ziegert等发现HPV DNA在宿主细胞中以两种方式存在：一种是整合状态，一种是染色体外的附加体形式。HPV感染宿主细胞后，其DNA作为独立的外源染色体游离于细胞核内，亦可整合到宿主细胞内，破坏原有的细胞增殖调控路径，导致细胞增殖失控，发展至癌。在癌前病变中，HPV DNA主要位于染色体外，而在鳞状上皮癌中，病毒DNA则主要以单拷贝或多拷贝串联方式整合于宿主细胞DNA中。在HPV整合的过程中，许多基因被破坏或缺失，其中E2基因的破坏尤为重要，它的中断使HPV DNA从环状变成线状从而能整合入宿主基因。因HPV E2基因的作用是抑制HPV E6、E7基因启动，E2基因编码的E2蛋白的失活会引起E6、E7基因过表达，而HPV E6、E7基因表达异常，可导致细胞生长失控，这对于子宫颈癌的发生发展起着十分重要的作用。另外，E2蛋白还是一种凋亡前体蛋白，可通过抑制病毒爱半百的复制和诱导凋亡而表现为较强的细胞增殖抑制作用。

另外，HPV在宿主细胞染色体中整合似乎是随机的。高危型HPV DNA与宿主细胞基因整合位点常常在细胞癌基因附近，从而导致癌基因的激活和表达，病毒和细胞基因之间的复杂关系对细胞周期控制的难以调节和子宫颈癌易感性的发生及发展是必然的。癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础，与子宫颈癌相关的癌基因有C-erbB-2、c-myc、c-fos、Bel，抑癌基因有p53、Rb、p16、FHIT等，这些原癌基因的激活和抑癌基因的失活，引起细胞的恶性转化。

整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6和E7。E6和E7可以调控许多基因的表达，在长期的细胞感染过程中，这两种病毒基因可通过复杂的机制，导致组织发生高度病变和癌症。在HPV的整合过程中，E6和E7的ORFs完整存在于整合的病毒DNA中，位于整合位点的上游，可持续表达E6和E7。E6和E7蛋白是多功能的蛋白，它们的各自表达产物在细胞的恶性转化中起着重要的作用，可使细胞永生化，如果两者产物共同作用，则可产生协同效应。E6蛋白与抑癌基因p53结合并抑制其功能，可使凋亡蛋白BAK下调表达，使异常细胞对抗凋亡并增加染色体的不稳定性。另外，E6蛋白还能激活端粒酶并抑制SRC家族酶的降解，促进HPV的转化。

E7蛋白则可通过与Rb肿瘤抑制蛋白家族、组氨酸酰化酶（HDAC）、细胞周期素、细胞周期素依赖激酶及其抑制物等相互作用，参与诱导细胞增殖、永生化和转化等过程。E7蛋白与pRb有高亲和性，使E2F和（或）pRb复合物解离，E2F功能恢复，G1期进入S期所需基因得以转录，细胞周期失控而发生永生化。E7原癌蛋白亦可结合p107，使细胞周期素A和（或）CDK2复合物丧失关闭E2F转录激活功能，防止E2F在S期中灭活，使细胞逃避正常控制，导致细胞DNA无限复制。另外，E7蛋白可刺激细胞周期中S期基因-细胞周期素A和细胞周期素E的表达，并抑制细胞周期依赖性蛋白激酶抑制子p21和p27的功能，从而干扰了正常细胞周期调控机制。E7蛋白可以通过中心粒的扩增而使表达E7的细胞染色体形成非整倍染色体，有利于肿瘤的形成。

HPV以游离状态引起细胞感染，首先潜伏于基底细胞层，其DNA作为独立的外源游离于细胞核内，病毒DNA的复制受到限制，但病毒的核酸却整合到宿主细胞核内，细胞核染色体双倍，核大深染，成为不典型增生细胞，细胞基因由于病毒整合而发生突变，细胞异形性显著，进一步发展为癌。但是，恶变并不一定需要病毒整合，一些与HPV有关的子宫颈癌只含有游离状态的HPV，而另外一些则含有游离和整合状态的混合。文献报道，子宫颈癌细胞中HPV16、18的DNA绝大多数呈整合形式，在浸润型子宫颈癌中则以游离和整合形式共存。

（2）E6、E7蛋白的表达失控：

E6、E7蛋白的过量表达在宫颈细胞癌变中起关键作用。E6、E7蛋白的促转化作用受E2蛋白的调控，E2蛋白和长控制区（LCR）内的强化因子结合，反馈性调节基因转录，HPV DNA的整合往往引起病毒E2片段的缺失，导致E6、E7基因表达失控，引起细胞的转化或癌变。

（3）E6、E7蛋白的致癌作用：

在病毒复制过程中起关键作用的是病毒的E6和E7蛋白，这两种蛋白可以与许多分子蛋白相互作用。Ziegent等（2003年）研究已证实HPV E6、E7基因具有细胞转化功能，是潜在的癌基因，编码HPV E6、E7蛋白为癌蛋白，在体外能转化小鼠上皮细胞，也能使人类上皮细胞发生永生化，而且HPV E6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。高危型HPV的E6、E7基因可以诱导裸鼠发生肿瘤。Seung等报道将HPV16型的E6、E7基因转入小鼠皮肤基底细胞，结果诱发皮肤肿瘤。HPV DNA人上皮细胞转化试验表明高危型HPV DNA的转化能力大大高于低危型HPV。体外培养发现，HPV16型的E6、E7基因能转化人成肌细胞，降低成肌细胞对细胞因子依赖水平，延长体外培养时间。人乳房上皮细胞株184A1也能被高危型HPV E6、E7基因完全永生化，而不再依赖于肿瘤生长因子。以上研究证明HPV E6、E7可以引起细胞的无限增殖和恶性转化。

1）E6、E7原癌蛋白致癌的p53和pRb依赖性途径：

p53是重要的基因转录激活物，参与G1相抑制、凋亡及DNA修复，p53的丢失或失活，会降低有丝分裂的准确性，增加基因组重排的频率，在细胞生长周期中起负调控作用。p53因半衰期短，生理情况下其水平较低；当细胞DNA损伤后，p53基因表达显著上调，通过结合DNA转录激活物下游的靶基因p21、mdm-2、bax的表达而发挥抗增殖作用。HPV16 E6编码的E6原癌蛋白通过E6-AP（E6-associated protein）连接介导与细胞蛋白P53结合，通过体内泛素途径（ubiquitin pathway）促进p53降解，从而使细胞周期被启动，细胞凋亡被抑制，使细胞过度增殖而导致肿瘤的发生。由于导致异常增殖和缺陷凋亡，因而有利于肿瘤的发展，而且这也是含有高危型HPV细胞染色体不稳定的一个主要原因，导致HPV阳性细胞的突变。通过促进其下游靶基因p21基因的转录，增加p21的合成，诱导细胞停滞在G1期来发挥其抑制细胞增殖的作用。因此，两者特异性结合并通过依赖蛋白酶系统将其水解，使其对细胞生长负调节功能丧失，从而失去对细胞周期的正常调控而引起细胞无限增生并向恶性转化，作为一种多功能蛋白，它还可以通过激活端粒酶使正常细胞永生化。研究发现E6还与其他蛋白（如靶蛋白1、干扰素调控因子3、p21等）有相互作用，同时还与凋亡有关（图2-3）。

E7蛋白是HPV致癌的关键分子。E7蛋白分为CR1/CR2/CR3和C端结构域。Rb基因定于染色体13q14，p105-Rb磷酸化为节细胞生长分化的主要形式。视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）是另一种重要的生长抑制蛋白，在细胞周期调节中起关键作用，主要通过抑制某些转录因子（如E2F等）活性达到抑制细胞增殖目的。正常情况下，非磷酸化pRb与E2F特异结合，形成pRb-E2F复合物后，抑制E2F对靶基因的转录，抑制细胞增殖。E7CR2含有LXCXE元件，结合pRB蛋白使转录因子E2F被释放，从而发挥其转录因子的作用，促进众多由G1期进入S期所需细胞增殖相关基因的转录，导致细胞周期调节失控，发生永生化。HPV E7蛋白同pRb的结合能力与HPVE7蛋白的转化能力有关，高危型HPV E7蛋白同pRb的结合能力较低危型HPV E7蛋白高5～10倍。同时E7CR1可以识别其他因子并将其聚集在pRB周围导致pRB降解。E7蛋白还可以通过结合RB相关蛋白pRB、p107、p130等，导致这些蛋白通过泛素途径降解。E7可抑制p21CIP-1和p27kip-1，促进CyclinA、E的表达使G1/S节点失控造成突变积累。E7还可以与糖代谢的限速酶之一丙酮酸激酶M2结合而影响HPV感染细胞中的糖代谢功能。E7可以结合组蛋白去乙酰化酶HDAC1和Brgl/Brml促进基因转录，还能够与Mi2β结合参与组蛋白的去乙酰化信号途径，激活转录促进细胞增殖。E7通过结合干扰素调节因子p48而抑制干扰素生成。E7还能够与果蝇抑瘤蛋白Tid56同源的人hTid-1蛋白、ATP酶的S4亚基结合参与肿瘤的生成。

此外，E6、E7还干扰中心体，导致多极有丝分裂，以及有丝分裂时染色体不均分布或改变染色体的稳定性，经过E6、E7发挥作用后，宿主细胞可能失去正常生长特性，转变为永生化细胞，但要演变为癌细胞，只有在其他致癌因素的协同作用下才能成为可能（图2-4）。

2）HPV16 E6、E7原癌蛋白致癌的非p53和pRb依赖性途径（端粒酶激活途径）：

近年来，关于端粒酶机制与细胞老化及肿瘤发生的关系问题越来越引起人们身后的兴趣。目前，研究主要集中在端粒长度调节、端粒酶激活途径方向等方面，旨在探索一种特异性肿瘤标志物，用于肿瘤的临床诊断及鉴别诊断。随着研究的不断深入，寻找端粒酶活性抑制剂并用于临床治疗成为研究者们关注的焦点。在妇科肿瘤领域中，端粒-端粒酶方面的研究也取得了较大进展。

端粒是位于染色体末端的有若干重复序列及相关结合蛋白共同组成的复合结构，其主要作用是使染色体在分裂过程中保持稳定，正确定位及准确复制，防治染色体互相融合、重组及一些外切酶、连接灭的作用。端粒酶在染色体端粒复制中发挥重要作用，端粒酶激活是细胞恶性转化的重要事件。1972年James Watson提出关于染色体末端复制问题，即DNA聚合酶不能将线性染色体末端的DNA完全复制，随着细胞有丝分裂的进行，端粒长度逐渐缩短，最终导致细胞退出细胞周期，出现衰老、死亡。因此，Harley等称细胞有丝分裂的“生物钟”。

端粒酶是一种细胞RNA依赖的DNA聚合酶，其功能是维持真核细胞染色体末端端粒的长度，是一种核糖核蛋白复合体。人端粒酶催化中心由人端粒RNA（human telomerase RNA，Htr）亚单位和一个称为人端粒酶逆转录酶的蛋白亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）组成。其中hTERT为端粒酶的催化亚基，对端粒酶活性调节具有重要作用，hTR部分为染色体端粒3-末端延伸提供模板。现已证实正常人的生殖细胞及骨髓造血干细胞等具有端粒酶活性，而正常体细胞中则无端粒酶活性，但在增生活跃的组织中，如胃肠道黏膜上皮细胞，子宫内膜组织等也存在低水平的端粒酶表达。

许多研究结果证实，端粒酶激活在子宫颈癌的发生、发展中有重要作用。有人检测了10例低分化子宫颈癌组织，结果全部病例均检测到激活的端粒酶，7例存在HPV感染（3例HPV16，4例HPV18），提示HPV感染尤其是高危型HPV感染，是宫颈组织端粒酶激活，并最终导致癌变的重要因素。Takakura等的研究表明：hTERT表达严格受转录机制的调节，80%的子宫颈癌组织和细胞株中可检测hTERT mRNA水平上调，而与端粒酶其他两个亚单位TP1和hTR mRNA水平无关，说明hTERT是端粒酶表达上调的决定性亚单位。宫颈病变时端粒酶被激活，CIN时即可检测到端粒酶的表达，子宫颈癌时端粒酶的表达程度更高，端粒酶激活发生于子宫颈癌前病损的事实说明它是子宫颈癌变过程中的早期事件。

在大多数子宫颈癌和癌前病变中存在着不同程度的端粒酶活性表达。Nagai等（1999）分别用酸性磷酸酶（TRAP）法与DNA图像分析系统对100例宫颈活检标本进行端粒酶定性及半量检测，其中61例宫颈CIN和23例子宫颈浸润癌检测到端粒酶高表达。Renaud等引检测25例子宫颈癌和14例正常宫颈组织的端粒酶活性及各亚单位表达水平，发现只有hTERT在子宫颈癌细胞和80%以上子宫颈癌组织中有较高表达，在正常宫颈组织中阴性。由于高危型HPV感染，HPV16、18的E6、E7抑癌基因p53失活，一方面使宫颈上皮细胞凋亡减少，另一方面可以激活端粒酶，使宫颈上皮细胞增殖增加，从而引起CIN和子宫颈癌。因此，端粒酶的激活是高危型HPV感染宫颈组织后由CIN向子宫颈癌转化过程中相当关键的步骤。研究表明用p53腺病毒载体转染子宫颈癌细胞（SiHa）后，发现SiHa中hTERT mRNA表达下降，端粒酶活性被抑制。p53通过与SPl或其他转录因子作用，显著抑制了hTERT转录，从而制了端粒酶活性。子宫颈癌细胞常见染色体3p和10p基因缺失，其中染色体3p含有端粒酶抑制基因，染色体3p缺失使端粒酶表达升高。另外，子宫颈癌细胞中HPV基因组整合造成c-myc基因启动子激活，c-myc基因高表达可通过hTER子的E-box元件激活hTERT的表达。hTERT启动雌激素受体反应元件（ERa），ERa能够直接激活端粒酶高达，在HPV16连接酶链反应（LCR）区域也含有皮质激素反应元件，皮质激素可上调HPV E6、E7基因的表达，端粒酶、皮质激素和HPV可能在子宫颈癌诱发中发挥一定的协同作用。由于非瘤性增生性上皮细胞也有端粒酶活性，端粒酶生理性激活与癌性激活尚需定量检测来加以区别。在子宫颈癌的形成过程中，高危型HPV感染与端粒酶激活的具体途径以及是否存在其他端粒酶活性调控因子还有待进一步研究。

在80%以上的恶性肿瘤组织中端粒酶活性的表达，目前对其激活机制不甚了解，但端粒酶活性及其引起的染色体端粒长度稳定是肿瘤细胞生长的重要因素之一。针对hTERT的生物学功能及其调节机制，目前已有数种方法抑制端粒酶活性。如针对hTERT的翻译核酸、核酶等，采用hTERT启动子与凋亡诱导基因相连形成嵌合载体，这种载体能够诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞无损害。抗hTERT的抗体对端粒酶抑制的有效性和特异性尚未搞清。近年来发现一些小的双链RNA可在哺乳动物细胞内高效、特异地阻断特定基因的表达，促使mRNA降解，介导特异性基因沉默，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi），可能成为关闭基因的有效手段。采用RNAi技术抑制hTERT的表达，不仅可直接减低端粒酶活性，而且还可以通过基因及蛋白表达的变化寻找与其相互作用的蛋白或信号转导分子，对端粒酶在肿瘤发生、发展中的作用、调控机制、抗肿瘤药物的开发等具有重要意义。

HPV16E6原癌蛋白是一种多功能蛋白，它可能通过激活端粒酶而使正常细胞逃避衰亡过程的增殖限制而永生化。Ohta等用HPV16E6 DNA转染两组不同的人正常宫颈上皮细胞，发现细胞株传代可超过100代且有较强的端粒酶表达，提示HPV感染与端粒酶激活有关。有研究表明用HPV16E6蛋白作用于早期人角质细胞和哺乳类上皮细胞，发现E6蛋白可以激活端粒酶，并提示E6蛋白激活端粒酶使p53非依赖性的。Lee等研究发现抑制整合HPV DNA的永生化细胞和子宫颈癌细胞的HPVE6/E7表达可明显抑制hTERT mRNA表达和端粒酶活性，认为HPV E6/E7蛋白不仅可诱导这些细胞的端粒酶表达，而且对端粒酶表达的维持也是必要的。端粒酶的激活是高危型HPV感染宫颈组织后由CIN向子宫颈癌转化过程的相当关键步骤。至于肿瘤组织中端粒酶活性增高的具体机制尚不清楚，目前认为通过HPV E6蛋白上调内源性hTERT水平而激活端粒酶使关键的限速步骤。hTERT的表达调控主要在转录水平，E6对hTERT 的调节依赖h-TERT基因上游大约251bp构成的调节区域，该区域包括E盒和SP1接位点。另外，已发现许多转录因子、癌基因（c-myc，HPV16E6，SP1，雌激素受体，bcl2等）于hTERT转录激活有关。hTERT蛋白磷酸化也被证明在端粒酶激活中具有重要的作用。

以上研究表明在子宫颈癌的发生中，HPV感染和端粒酶的激活密切相关；HPV的病毒癌基因蛋白，特别是E6癌蛋白，可能在端粒酶的激活中其重要作用；在HPV激活端粒酶的过程中，hTERT亚单位表达上调是端粒酶集合的主要途径。

总之，HPV转化蛋白协同参与转化过程：E6使p53调节的G1/S节点失控，抑制凋亡作用，激活端粒酶；E7灭活CDK抑制物pRB、p21和p27，激活CyclinA/E，干扰INF产生，共同抑制抗原提呈等途径，使染色体不稳定性和基因突变等肿瘤发生因素不断积累，最后使细胞“永生化”和转化成为肿瘤。

3）HPV免疫逃逸机制：

机体免疫功能与子宫颈癌的发生密切相关。宿主对HPV的免疫反应直接影响到HPV感染是否被清除或转化为持续性感染。在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者中，子宫颈癌的发病率非常高（仅次于肺肿瘤）。在免疫缺陷的个体中，机体的免疫防御和免疫监视功能被削弱，易发生HPV的持续反复感染，导致相关疾病，如生殖道疣、CIN和子宫颈癌的发生。HPV感染机体后，防御病毒感染的免疫系统会受到影响，细胞免疫、体液免疫以及局部免疫反应均会发生多种改变。

现在多认为HPV整合到宿主细胞基因组是致癌的一个重要机制，但被病毒感染的宿主细胞可以通过激活自杀机制，以阻止新的病毒颗粒复制。宿主细胞有一套完整的调控机制，尤其通过信号转导来调控HPV感染，HPV只有逃避宿主细胞的调控才可能继续复制。对HPV逃避宿主细胞的调控机制的分子研究主要有：①E7蛋白的17～37位氨基酸参与p48结合，阻断IFN-α介导的信号转导，从而抵抗干扰素的抗病毒、抗肿瘤作用；②E6蛋白与细胞内信号转接蛋白TyK2相互作用，影响JAD-SIAT活化，阻断IFN合成的信号通路及其转录活化；③E6蛋白与IRF-3结合，抑制IFN-B基因转录合成和E6蛋白与IRF-3结合，阻断IFN-α亚型的转录；④E6及E7蛋白抑制TGF的诱导和表达，从而干扰抗细胞增殖、诱导细胞分化和阻断细胞周期等作用。

三、宫颈病变的转归和后果

子宫颈癌的发生与发展是逐步的、区域性的、阶段性的，即“宫颈上皮非典型增生（轻-中-重）—原位癌—早期浸润癌—浸润癌”的病理变化，CIN是发生在宫颈的癌前病变，是宫颈上皮进展为浸润癌的一个中间环节其发展过程有三个倾向：①自然消退或逆转；②持续不变；③进展为更高一级的CIN乃至浸润癌。大多数CIN发生发展缓慢（表2-1），并不是CIN必然发展为浸润癌，也并不是所有的浸润癌患者都经由CINⅢ（原位癌）转变而来，也有从CINⅠ或CINⅡ直接转变而来。

Richart指出，CIN级别越高，发展到浸润癌的可能性越大。CINⅠ、CINⅡ级是一组不稳定的边界病变，约有50%的病变持续不变或逆转，20%～30%的病变进展。宫颈原位癌发展到浸润癌需要5～15年。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ进展为浸润癌的危险性分别是15%、30%和45%，分别是正常宫颈的4倍、14.5倍和46.5倍。反之，低级别的CIN逆转的概率更大。随着CIN级别的提高，病变逆转率逐渐下降而进展率则逐渐升高。

Nasiel等对555例CINⅠ患者随访39～52个月发现，61%病变逆转，22%病变稳定，16%进展，预测12年后病变进展率达23%。Bos等对1595例CIN患者随访16年发现，总的逆转率为39%、稳定率38%、进展率24%，预测48%以上的CIN患者终生不发展为浸润癌。Forsmo等预测只有20%的CINⅢ患者在16年内进展为浸润癌。不同治疗CIN的进展率、逆转率差异如此之大，与所观察的级别、观察的时间等因素有关。

有研究者总结大量文献指出：CINⅠ中57%消退，32%持续存在，11%发展成为CINⅢ，治疗后极少复发；CINⅡ约22%进展为CINⅢ；CINⅢ可以由低级别CIN发展而来，也可以由无病变的上皮直接发展而来，一般均进展为浸润癌，仅少数自然消退或活检后消退。而1993年Burghandt综合报道未经治疗的444例原位癌，观察6个月至12年，有13.4%～70.9%的病变进展为浸润癌，1%～25.4%的病变消退。也有人报道约41%的原位癌发展为浸润癌。

从子宫颈癌前病变CIN到癌的自然演变的病理过程需要10～20年，这是个不可忽视的时间，对CIN正确的治疗能有效扼制病变的进一步发展，将不可逆转的浸润癌有效的扼制在癌前阶段。所谓的子宫颈癌是可以预防的疾病。其关键就在于此期的及时诊断和正确治疗。

HPV感染类型是影响CIN预后的重要因素之一，低危型HPV感染相关的病变以CINⅠ为主，大多数可能逆转，而高危型HPV感染相关的CIN往往发生病变进展。持续高危型HPV感染对CIN病变的发展有重要意义。因此，HPV检测尤其高危型HPV的检测在预测CIN的转归上游重要的作用。对CIN患者定期复查HPV DNA，确定持续HPV感染的患者，对其进行必要的治疗，可阻止CIN病变的发展。Koutsky等对宫颈细胞学及阴道镜检查均正常，但高危型HPV感染缓患者随访发现，2年内 CINⅡ、Ⅲ的累积发生率达39%，而2～5年间仅1例新发病例。表明高危型HPV感染后，CINⅡ、Ⅲ主要发生在HPV感染后2年内。因此认为，CIN病情检测尤其应注意HPV感染后2年内的病情变化。

影响子宫颈病变变化的重要因素是HPV感染的状态。HPV是一种可致软疣的病毒，1995年被国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）定为致子宫颈癌及其相关病变的关键因素。99.7%子宫颈癌中可检出HPV，在宫颈上皮内病变中，HPV检出率也高达90%。高危型HPV感染者发生子宫颈癌的危险性为正常的20倍。

性活跃期女性HPV感染十分常见，但多为一过性，感染者体内病毒常可自行清除，无临床病变，一般HPV感染后1年，病毒不能检出。但高危型HPV感染及多重HPV感染时，病毒存在的时间增加，病毒颗粒会整合到人体细胞DNA中，细胞失去正常的生长调控癌病。持续的HPV感染，平均感染8～24个月，可发生CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ，再过8～12年可发生浸润癌。年龄亦是重要因素，若大于30岁，HPV持续性阳性，发生CIN和子宫颈癌的危险增加。

总之，CIN存在自然转归，CIN虽是一连续发展的病变，但是亦存在逆转的可能性。

四、HPV致子宫颈癌后果

HPV持续性感染的定义及流行概况：

作为一种常见的性传播疾病，宫颈感染高危型HPV是非常普遍的、暂时性的，有10%～15%的患者呈持续性感染状态。许多研究显示持续性高危型HPV感染是发生宫颈病变的必要条件。目前对于“持续性感染”这一概念的定义尚未统一。许多学者认为，当基底层细胞无相关HPV感染时，如果在间隔4～6个月或6～12个月的相邻2次随访中，同一患者的阴道宫颈检测样本均显示HPV阳性且为同种类型，则称为此种类型HPV的持续性感染。

HPV在人群中普遍存在，美国一调查显示员1/3有性行为的女大学生可检测到HPV DNA，70%的妇女一生中有1次机会感染高危型HPV。HPV的现患病率估计为25%～39%，主要取决于年龄组、居住地区及检测手段。生殖道HPV感染的高峰年龄位18～28岁，35岁后5%～10%为高危型HPV持续感染状态，持续感染HPV高危型病毒的妇女发生宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的风险增加100～300倍。持续感染HPV高危型病毒是导致并维持宫颈上皮重度不典型增生（cervical intraepithelial neoplasia，CIN Ⅲ）病变的必要条件。世界不同地区所开展的病例对照研究显示HPV感染在子宫颈癌发病中的相对危险度为50～100，而HPV16、18的相对危险度更是高达100～500。在几乎全部子宫颈癌标本中均能检测到高危组HPV的存在，在癌前病变（即Ⅱ、Ⅲ 级上皮内瘤样病变）中HPV DNA检出率为70%～90%，在Ⅰ级病变中检出率为20%～50%。