第二节　细菌sRNA在耐药中的作用

细胞对环境变化的感应与调节涉及一系列复杂的生物学过程，其中涉及DNA、RNA和蛋白质对基因表达的调节，细菌通过基因表达的调节和细胞内的信号传导，实现对环境的适应。近年研究发现，由细菌sRNA（Small non-coding RNA）组成的转录后调控网络，是细菌感应外界环境、进行生理调节的重要机制之一。

一、sRNA概述

细菌sRNA是一类长度在50～300个核苷酸的小非编码RNA，最初于1967年在大肠埃希菌中发现，凭借迅速发展的高通量测序技术，结合cDNA文库构建、RNA印迹（northern blot）、实时定量PCR技术和生物信息学分析等方法，近年来，数百种sRNA在不同种属细菌中相继被发现，几乎所有细菌中都含有sRNA，其中大肠埃希菌中有近140种。目前sRNA的筛选、鉴定、分子作用模式和生理功能已成为细菌学研究的前沿热点。sRNA通过对基因表达的调控，在细菌的物质代谢、毒力、群体感应、物理因素应激和致病等过程中发挥重要的调节作用。这些感应环境信号的sRNA的典型特征是，既受某些与特定环境或代谢信号相关的转录因子的调节，又可调节一个或多个靶位基因的表达，甚至作为细胞压力调节和众多其他关键反应的整体调节因子（global regulator）。

二、sRNA分类

迄今为止细菌中发现的sRNA可分为三类，第一类sRNA占绝大多数，通过与靶核酸特异性碱基互补或与蛋白质结合的方式，发挥调节作用，这种sRNA可分顺式（cis）和反式（trans）两种类型，前者的序列是靶mRNA的反义链，后者是基因间序列，通常基因组上有多个结合靶位。第二类sRNA是核糖开关（ribo-switches），一般为mRNA的5′-UTR区序列，环境因素可诱发核糖开关构象改变，进而调节下游基因的表达。第三类是新近发现的成簇规律间隔的重复短回文序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs），是基因组上串联排列的、重复规律间隔的短回文序列，CRISPRs完整转录之后被酶解为含有短回文序列的小RNA，又称crRNA，目前认为CRISPRs可抑制噬菌体或质粒等外源DNA的复制。

三、sRNA与靶位的作用方式

（一）反式编码的sRNA（trans-coded sRNA）

是sRNA中研究最广泛的一类，为基因间序列，通过不完全碱基互补配对发挥调节作用，通常基因组上有多个结合靶位，称反式编码的sRNA。通过与mRNA之间的碱基互补配对，正向或负向调控mRNA的翻译及其稳定性。反式编码的sRNA与mRNA的结合通常通过RNA分子伴侣Hfq介导实现。Hfq是细菌的RNA结合蛋白，也称RNA分子伴侣，能够促进sRNA-mRNA之间的碱基配对并维持sRNA的稳定性。Hfq是一个六聚环蛋白，与sRNA和mRNA的结合位点分别在环的近极端和远极端，通过连接sRNA和mRNA，重构RNA的二级结构，进而增加sRNA和mRNA配对的频率和效率。

1.负调控作用

对翻译的负调控作用是反式编码sRNA的最主要作用。当sRNA发挥负调控作用时，常需要RNA分子伴侣Hfq来促进与靶mRNA之间的配对。如果sRNA-mRNA结合位点在mRNA起始密码子上游15nts和下游20nts之间，sRNA可直接与核糖体结合位点（RBS）结合，抑制翻译起始。sRNA抑制翻译的机制可通过与核糖体备用结合位点、上游开放阅读框、翻译增强子结合而实现。sRNA在Hfq的帮助下，与mRNA的内部核糖体进入位点（RBS）结合，抑制核糖体装载，进而间接抑制翻译。此外，sRNA的负调控作用，还体现在与mRNA之间的碱基配对后不阻止翻译，而是直接促进mRNA的降解。

2.正调控作用

反式编码sRNA的正向调节作用较少见，主要表现为sRNA与靶mRNA结合后，促进靶mRNA翻译或提高靶mRNA的稳定性。其作用方式有三种，最常见的一种是sRNA通过碱基互补配对，破坏mRNA上固有的抑制翻译的二级结构，暴露RBS位点，以这种反-反义机制激活靶mRNA的翻译。第二种是sRNA与靶mRNA结合，诱导其降解，使带有RBS的mRNA片段增多，从而促进翻译。第三种是内切核苷酸切割产生的mRNA片段，与sRNA碱基配对构成sRNA-mRNA复合体，防止mRNA进一步降解，从而增加编码蛋白的产生。

（二）顺式编码的sRNA（cis-coded sRNA）

与反式编码sRNA不同，其与靶mRNA之间完全互补配对。这类sRNA在质粒、噬菌体、转座子等移动元件和细菌染色体中都有发现。许多染色体上的顺式编码sRNA可作为细菌的抗毒素因子，调节有毒的小疏水蛋白的表达。顺式编码sRNA的片段大小差别很大，范围一般在100到7000nts不等，能够在转录、mRNA稳定性和翻译水平上起调节作用。

（三）与蛋白质结合的sRNA

虽然绝大多数sRNA通过与靶mRNA互补配对来发挥调节作用，但也有少数sRNA能够与蛋白结合并调节其活性。一般是通过模仿蛋白同源靶点的结构，调节核酸结合蛋白的活性。这类sRNA的典型代表是许多细菌种属中的6S RNA，它可结合到RNA聚合酶全酶的σ70亚基的活性位点上，阻止RNA聚合酶与DNA启动子结合。在大肠埃希菌等细菌中，还发现另一类能够与蛋白质结合的sRNA，它们能与相应的靶蛋白结合并抑制其活性，间接调节一系列基因的表达。此外，转移信使RNA（tmRNA）也能与蛋白结合，其能促进异常多肽链的降解从而保持蛋白质的稳定型。

长期以来人们一直认为，每个sRNA只具有一种调节功能，即参与碱基互补配对或与蛋白结合参与翻译调控。然而，最近发现了双功能sRNA，这些sRNA不仅能够与一个或多个靶点结合，也能像mRNA一样编码小分子蛋白。RNA Ⅲ就属于这类sRNA，它是金黄色葡萄球菌中最重要的毒力调节因子，能够编码δ-溶血素毒素，也能够通过与编码其他毒力因子的mRNA进行碱基互补配对来发挥作用。在铜绿假单胞菌中也发现了一种双功能sRNA，通过调节毒力因子编码基因的mRNA发挥间接的调节毒力作用。

四、与细菌耐药相关的sRNA

细菌耐药为细菌的自然生理反应，细菌通过改变自身状态如产生灭活酶、改变细菌外膜通透性、改变抗菌药物作用靶位、主动外排泵系统改变、生物被膜的形成等来适应抗菌药物的影响，最终产生了耐药。抗菌药物能够使sRNA表达发生变化而使细菌产生一系列变化，最终调节细菌适应抗生素而产生耐药。在sRNA与耐药关系的研究中，发现以下几种sRNA通过不同的途径介导细菌对抗生素的耐药。

（一）sRNA调节抗生素的摄取

大肠埃希菌的小RNA MicF通过调节细菌外膜蛋白表达，控制细菌对抗生素的摄取能力，从而参与细菌耐药的调节。MicF能够负调控孔蛋白OmpF mRNA的翻译及其稳定性，进而抑制OmpF孔蛋白的产生，使进入细胞的药物量减少，从而引起抗生素耐药。2012年，Holmqvist等通过实验发现，MicF通过以转录因子Lrp为中心的调控网络参与细菌抗生素应答和耐药的调节。Lrp是细菌重要的转录因子，能调节大肠埃希菌细胞内1/10左右蛋白质的表达。MicF可调控Lrp蛋白的转录，进而影响Lrp调控靶蛋白质的表达，反过来，Lrp对MicF又有负调控作用。

（二）sRNA介导抗菌药物的杀菌作用

抗菌药物能够影响sRNA而导致相关基因的表达受到影响，提高药物敏感性而产生抗菌作用，例如，阿奇霉素能够影响sRNA从而干扰蛋白质的合成、损伤细胞膜而达到杀菌的效果。大肠埃希菌sRNA中的RyhB能促进CirA的表达，而CirA与大肠菌素Ia结合后会导致细胞的死亡。在RyhB和CirA缺乏的大肠埃希菌突变株中，大肠菌素Ia则不能导致细菌死亡。sRNA还能与细菌的二级代谢产物作用，影响抗生素的生成。此外，一些细菌如沙门菌中RyhB的缺失会使活性氧物质（ROS）异常增高，达到其杀菌作用，这样的机制是否和抗生素杀菌的作用机制有着重要联系还尚待验证。

（三）sRNA调节生物膜的形成过程

研究表明sRNA能够参与细菌生物膜形成的调控网络。有文献报道，Hfq突变株中由于sRNA的调控能力受到干扰，使鼠伤寒沙门菌不能产生成熟的生物膜，这意味着sRNA在生物膜形成方面发挥了至关重要的作用。最近研究，越来越多的sRNA被发现参与生物膜形成的调控。近期有利用突变体库对沙门菌生物膜的形成能力进行了研究分析，sRNA SdsR是沙门菌生长到稳定期时，细胞内最丰富的sRNA之一。在沙门菌SdsR的突变株中，观察到生物膜的表型降低。研究发现，另外5个sRNA，即OmrA/B、McaS、RprA和GcvB能够直接调节csgD基因，csgD是与产生curli有关的中央生物膜主调节器。此外，有的sRNA还调控鞭毛的合成和流动性，从而影响生物膜的形成过程。

（四）sRNA介导细菌代谢状态的改变而影响耐药性

微生物当营养物质匮乏时，容易出现生长缓慢或停止的现象。如在葡萄糖磷酸盐压力下，葡萄糖-6-磷酸（G6P）或不可代谢的葡萄糖类似物α-甲基-葡萄糖苷-6-磷酸（αMG6P）累积，会导致生长停滞和细胞死亡。在大肠埃希菌中，葡萄糖和α-甲基-葡萄糖苷（αMG）输入细胞后，被磷酸转移酶系统（PTS）磷酸化。其中由ptsG基因编码的PtsG是PTS中的主要葡萄糖转运蛋白。在葡萄糖磷酸盐压力下，sRNA SgrS能够对PtsG mRNA的转录后水平进行负调控，阻止PtsG蛋白的合成以及G6P或αMG6P的进一步积累。有文献报道，SgrS编码一个小肽段SgrT，它能够通过未知机制抑制PtsG的活性。最近的研究显示在葡萄糖磷酸化压力下，PTS和ManXYZ也同PtsG一样，在转录后水平上受到SgrS的调控。此外，也有研究显示SgrS能够在转录后水平抑制沙门菌特异毒性蛋白SopD的合成。这一发现表明，葡萄糖磷酸压力和毒力因素之间可能存在一些相关性。

（五）氧化应激压力下的sRNA

关于调节细菌适应氧化应激反应的信号转导蛋白研究，了解较多的是OxyR和SoxR。OxyR是LysR转录调节因子家族的成员，它能够激活一些防御基因的表达，这些防御基因主要编码过氧化氢酶、烷基过氧化氢还原酶和超氧化物歧化酶等。OxyR能够被过氧化氢激活进而诱导sRNA OxyS的转录。作为一种多效性调节器，OxyS能够增强和抑制多个基因的表达，并且能够在某种程度上保护细胞自发和化学诱导的突变。现今已经确定了一些OxyS sRNA调节的靶mRNA。其中OxyS能够抑制fhlA（编码一种转录激活因子）和rpoS（编码RNA聚合酶的σs亚基）的翻译起始。并且有文献指出，rpoS的翻译抑制将下调呼吸作用和超氧化物的产生。

（六）sRNA参与细胞铁的平衡

铁是细胞活动所需的重要成分，对于细胞的生长和分化、电子转移、氧运输、代谢、活化和解毒等活性是必需的。当细胞内铁含量升高时，会导致活性氧物质（ROS）增多，从而对细菌产生危害。在大多数细菌中，铁吸收调节器（Fur）能够作为中央传感器和铁稳态调节器。Fur也参与多种细胞功能，如氧化应激，能量代谢，耐酸性和毒力基因的产生等。

RyhB是铁饥饿条件下在大肠埃希菌中表达的sRNA，它受Fur蛋白的调节。当环境中铁的浓度减少时Fur与RyhB不发生结合，RyhB则发生表达，然后RyhB通过与相关铁储存蛋白和mRNA配对后抑制mRNA的表达，铁含量得以升高。相反的，在环境中铁的浓度很高时，Fur能够结合并抑制RyhB，使铁储存蛋白含量增高，维持铁平衡。

RyhB的表达最终导致6个基因的mRNA水平下降，主要有：sdhCDAB（编码琥珀酸脱氢酶），acnA（编码乌头酸），fumA（编码延胡索酸），bfr、ftnA（均编码铁蛋白）以及sodB（编码超氧化物歧化酶）。RyhB还可以与ShiIA mRNA的5′非编码区碱基配对，使其核糖体结合位点（RBS）暴露，从而增加ShiIA mRNA的翻译，其中shiIA是编码莽草酸通透蛋白的基因。

（七）sRNA与细菌的耐酸性有关

有研究表明，RyhB可以通过调控ydeP基因的表达来调节细菌的耐酸性。ydeP基因编码一种耐酸细菌中所必须的氧化还原酶，它受到转录激活因子EvgA的调节，然而RyhB则可通过负调控EvgA的表达来调节ydeP基因的表达。有文献报道，GcvB能够通过上调RpoS的水平来增强大肠埃希菌的耐酸能力，但机制尚不清楚。与GcvB相似，sRNA DsrA和RprA也是大肠埃希菌中耐酸系统（AR）的正向调节者。

DsrA和RprA连接到rpoS mRNA 5′端的同一区域，此区域内的序列能够形成一个自身抑制的茎环结构，封闭核糖体结合位点进而抑制翻译。DsrA11和RprA连接到这一茎环结构后，能够释放核糖体结合位点，进而介导rpoS mRNA的翻译。

随着研究的深入，发现越来越多的sRNA与细菌耐药性的形成密切相关，某些耐药相关sRNA与细菌的整体调节因子的相互影响，构成复杂的转录调控网络，参与细菌对抗生素的应答和耐药性的形成。进一步研究sRNA在细菌耐药性形成中的网络调节作用，将有助于理解细菌适应抗生素环境的分子调节机制。